Skóre modulu uCRM (Urinary Common Rejection Module) pre neinvazívne monitorovanie transplantácie obličky

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktné

Spoločný modul rejekcie (CRM) pozostávajúci z 11 génov exprimovaných v biopsiách aloštepu, bol predtým hlásený, že slúži ako biomarker pre akútne odmietnutie (AR), koreluje s rozsahom poškodenia štepu a predpovedá budúce poškodenie aloštepu. Skúmali sme použitie tohto génového panelu na peletu močových buniek pacientov s transplantovanou obličkou. Sedimenty močových buniek boli odobraté od pacientov s biopsiou potvrdeným akútnym odmietnutím, hraničnou AR (bAR), BK vírusovou nefropatiou (BKVN) a stabilné obličkové štepy s normálnymi protokolovými biopsiami (STA) boli analyzované na expresiu týchto 11 génov pomocou kvantitatívneho polymerázového reťazca reakcie (qPCR). Hodnotili sme týchto 11 CRM génov z hľadiska ich hojnosti, autokorelácie a individuálnych úrovní expresie. Expresia 10/11 génov bola zvýšená v AR v porovnaní s STA.Psmb9 a Cxcl10 mohli klasifikovať AR oproti STA tak presne ako 11-génový model ( citlivosť=93.6 percent ,špecifickosť=97.6 percent ). Skóre Au CRM, založené na geometrickom priemere hladín expresie, by mohlo odlíšiť AR od STA s vysokou presnosťou (AUC= 0.9886) a špecificky korelovalo s histologickými mierami tubulitídy a intersticiálneho zápalu, a nie tubulárnej atrofie, glomerulosklerózy, intimálna proliferácia, tubulárna vakuolizácia alebo akútna glomerulitída. Toto skóre založené na génovej expresii v moči môže umožniť neinvazívne a kvantitatívne monitorovanie AR.

ÚČINKY CSITANCHE: PROTIZÁPALOVÉ

Úvod

Transplantácia obličky (KTx) je preferovanou modalitou na liečbu terminálneho štádia renálneho ochorenia (ESRD) z akejkoľvek príčiny [1]. Zatiaľ čo sa tento terapeutický prístup stal rutinnou praxou na celom svete, čím sa výrazne zlepšila kvalita života a prežitie pacienta[2], dlhodobé výsledky aloštepu obličky sa nezlepšili, ako sa očakávalo, napriek lepšiemu pochopeniu imunitnej biológie odmietnutia aloštepu a príchodu nových a silnejšie imunosupresíva [3]. Hlavnou príčinou pretrvávajúceho a slabého prežívania štepu je neschopnosť neinvazívne kvantifikovať záťaž imunitného poškodenia štepu a predpovedať akútne odmietnutie pred podstatným funkčným poklesom a histologickým poškodením. Aj keď je dobre známe, že pacienti s KTx sú nepretržite vystavení imunitným a neimunitným poraneniam [4, 5], pravidelné monitorovanie KTx závisí od necitlivých náhradných markerov dysfunkcie aloštepu, ako je sérový kreatinín (6, Z] a sporadické monitorovanie KTx je založený na protokolových biopsiách štepu na detekciu subklinického histologického poškodenia štepu v neprítomnosti poruchy sérového kreatinínu[8]. Hoci hodnotenie dysfunkcie štepu založené len na sérovom kreatiníne má citlivosť na nešpecifické, preukázané poškodenie štepu, má nízku špecificitu pre diagnózu akútnej rejekcie (AR), pretože zvýšenie sérového kreatinínu môže byť spôsobené inými dôvodmi, ktoré priamo nesúvisia s odmietnutím aloštepu, ako je nefrotoxicita súvisiaca s imunosupresívami (IS), akútna tubulárna nekróza, infekcia a intersticiálna fibróza a tubulárna atrofia (IFTA). Okrem toho, zatiaľ čo použitie monitorovacích biopsií sa postulovalo ako zlatý štandardný nástroj na diagnostiku al lograftových lézií, tento prístup je nákladný, invazívny, s morbiditou zákroku (riziko krvácania; postup vyžadujúci sedáciu, najmä u pediatrických pacientov s KTx)[9], plný variability čítania medzi operátormi a často nedostatočne reprezentujúci fokálne histologické poškodenie. Preto použitie neinvazívnych biologických markerov, ktoré dokážu presne predpovedať a kvantifikovať záťaž poškodenie imunity v aloštepe by bolo významným pokrokom pri precíznom monitorovaní KTx [10-12].

Vyšetrenie proteomických, RNA a mikroRNA biomarkerov v moči pacientov s KTx preukázali naše skupiny a iní[13-17] ako optimálnu biologickú tekutinu na sériové monitorovanie obličkového aloštepu, pretože ide o ultrafiltrát obličky a odzrkadľuje biologické procesy a zápalovú záťaž nachádzajúcu sa v obličkovom štepe [18]. Napriek množstvu štúdií, ktoré predtým hodnotili biomarkery v moči ako neinvazívny diagnostický prístup na analýzu AR pri transplantácii obličky, sa zameriavame výlučne na jednotlivé biomarkery, ako sú konkrétne chemokíny a receptory, ako sú CXCR3, CXCL9 alebo CXCL10 [{{ 6}}] je ťažké zachytiť molekulárnu komplexnosť a heterogenitu AR u rôznych pacientov s KTx. Zachytenie tejto heterogenity je nevyhnutné na kvantifikáciu záťaže poranenia spôsobom použiteľným na prospektívne monitorovanie AR a zotavenie poškodenia štepu po terapeutickej intervencii [25, 26].

V tejto štúdii aplikujeme poznatky získané využitím spoločného odmietnutia modulu (CRM) 11 génov [27], pôvodne vyvinutého pomocou vyčerpávajúcej metaanalýzy verejne dostupných súborov údajov z mikročipov transplantovaného tkaniva vzoriek biopsie zo štyroch rôznych typov pevných látok. orgánov. Všetky CRM gény v tkanive (tCRM) boli medzi pacientmi s AR nadmerne exprimované, bez ohľadu na typ orgánu, rozdiely v imunosupresívnych protokoloch alebo rozdiely v platformách skúmajúcich génovú expresiu. Kvantitatívny prah určený výpočtovou analýzou kombinovaného génového skóre (skóre tCRM) presne predpovedal prítomnosť AR krížovou validáciou signatúr tkanivovej génovej expresie v 8 nezávislých kohortách (n= 236 vzoriek) aloštepu ľudskej obličky biopsie[27]. Skóre tCRM bolo ďalej validované pomocou qPCR v samostatnej štúdii na vzorkách biopsie KTx ako diagnostika AR aj chronického poškodenia aloštepu (CAl) s rôznymi prahmi génovej sady [28]. Okrem toho bol tento súbor CRM génov validovaný v nezávislom súbore biopsie tkaniva od pacientov po transplantácii pľúc s chronickou dysfunkciou pľúcneho aloštepu (CLAD) [29].

V tejto štúdii hodnotíme súbor génov CRM na použitie vo vzorkách moču od pacientov s KTx, spárovaných s biopsiami aloštepu so známou histológiou, na neinvazívnu diagnostiku AR a iných imunitne sprostredkovaných poranení. Ďalej vyvíjame skóre CRM (uCRM) v moči, ktoré presne rozlišuje medzi pacientmi s STA a AR. Klinický potenciál tohto skóre pri detekcii bAR hodnotíme koreláciou tohto skóre s histologickým skóre tubulitídy a intersticiálneho zápalu.

ÚČINKY CSITANCHE: ZLEPŠENIE IMUNITY

Materiály a metódy

Vzorky moču a študijná kohorta

Do štúdie boli zahrnuté vzorky moču z biobanky (n{0}}) od príjemcov KTx zapísaných na Stanfordskej univerzite v rokoch 2000 až 2011 a UCSF Medical Center zapísaných v rokoch 2014 až 2016. Štúdiu schválila Inštitucionálna hodnotiaca rada a Etická komisia Kalifornskej univerzity v San Franciscu, CA. Všetci pacienti poskytli písomný informovaný súhlas s účasťou na výskume v plnom súlade s Helsinskou deklaráciou. Uvedené klinické a výskumné aktivity sú v súlade s princípmi Istanbulskej deklarácie, ako je uvedené v Istanbulskej deklarácii o obchodovaní s orgánmi a transplantačnej turistike. V prípade vzoriek moču použitých na stanovenie prahu uCRM pre AR sa identifikovalo 178 vzoriek moču pomocou párových biopsií obličkových aloštepov s jasne definovanými patológiami buď AR stupňom Banff [30,31] alebo štepov bez poškodenia/stabilných (STA) (Eig 1). Okrem toho sme tiež hodnotili podpis pre test uCRM pri vírusovej nefropatii BK, ktorá je dôležitým zmätkom pre diagnostiku AR a často sa prejavuje významným zápalom na biopsii aloštepu. Celkovo bolo vyradených 28 vzoriek z dôvodu problémov s kontrolou kvality súvisiacich s nízkym obsahom a nekvalitnou RNA, čo viedlo ku konečnému počtu 150 vzoriek moču od 150 jedincov na prierezovú analýzu imunitne sprostredkovaného poškodenia KTx. Každá vzorka moču bola porovnaná s biopsiou v čase odberu moču, ktorú vyhodnotil centrálny patológ na Stanfordskej univerzite (Richard Sibley) alebo na UCSF (Zol-tan Laszik).

Charakteristiky pacienta

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 mononukleárne bunky /tubulárny prierez, pričom 19 splnilo kritériá pre hraničnú AR s il/i2 a t0/t1 a infiltráciu 1-4 mononukleárnymi bunkami/tubulárny prierez), STA (n { {8}}), nefritída vírusom BK (n =43), pacienti dostávali režim ILS s inhibítorom kalcineurínu na báze takrolimu a mykofenolátmofetilu, so steroidmi alebo bez nich, a indukčnú terapiu buď tymoglobulínom alebo anti-IL{{ 12}} receptorová monoklonálna protilátka (daklizumab alebo bazi. infliximab)[32]. Vzorky moču boli získané v priemere 731 dní po transplantácii (rozsah 169-1335 dní).

Definícia fenotypov poranení

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>20-percentné zvýšenie sérového kreatinínu v porovnaní s jeho predchádzajúcou východiskovou hodnotou v rovnovážnom stave a súvisiaca biopsia, ktorá bola klasifikovaná ako AR alebo BKVN.AR, bola definovaná minimálne, podľa Banffovej schémy, skóre tubulitídy väčšie alebo rovné 1 sprevádzané skóre intersticiálneho zápalu Vyššie alebo rovné 1 s negatívnymi Cd aj DSA. Boli indukované prípady AR (TCMR) sprostredkované T-bunkami aj odmietnutie sprostredkované protilátkami (ABMR), hoci všetky pozorované prípady ABMR mali zmiešaný fenotyp TCMR a ABMR, pretože pozorovanie čistého ABMR sa zriedkavo pozoruje v nízkorizikových, nesenzibilizovaných kohortách. Hraničné zmeny (bAR) boli pozorované v niektorých prípadoch TCMR, charakterizovaných infiltráciou mononukleárnych buniek (<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

Obr. 1. Výber vzorky a schéma štúdie štúdie. V rokoch 2000 až 2016 bolo odobratých 1 760 vzoriek moču,

z ktorých 643 malo zodpovedajúce údaje biopsie. 178 z týchto 643 malo dobre definované fenotypy AR, bAR, BKVN alebo STA.

Po extrakcii RNA, syntéze cDNA a kvantifikácii qPCR 28 vzoriek neprešlo QA/QC, zostalo 150

vzorky na štatistickú analýzu a modelovanie.

Odber moču, spracovanie, extrakcia celkovej RNA, syntéza cDNA a qPCR

Moč (50 ml; sterilná nádoba) sa odoberal pacientom po transplantácii obličky pred biopsiou a pred akoukoľvek intenzifikáciou liečby AR. RNA bola extrahovaná zo sedimentu močových buniek podľa nášho predtým opísaného protokolu [36]. Stručne povedané, bunky moču sa získali centrifugáciou 50-ml vzorky moču pri 2000 x g počas 20 minút. RNA sa extrahovala z peliet močových buniek pomocou Mikrosúprava RNeasy Plus (Qiagen, Valencia, CA). Kvalita RNA bola hodnotená spektrofotometrom NanoDrop ND-2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) s pomerom 260/280. Syntéza cDNA sa uskutočnila s použitím 50 ng extrahovanej RNA pomocou SuperScript VILO "Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA). qPCR sa uskutočnila na cDNA syntetizovanej z 50 ng celkovej RNA, potom sa 1,56 ng cDNA spracovalo prostredníctvom amplifikácie špecifického cieľa a vzorky riedenie pomocou spojených testov Taqman pre 1 l uCRM génov v multiplexe, s Taqman PreAmp Master Mix (ABI) na konečný objem 5 ul, na 18 cyklov v tepelnom cykléri, potom zriedené suspenzným pufrom DNA (TEKnova, CA). Mikrofluidná qPCR bola uskutočnené na 96,96 dynamických poliach (Fluidigm, South San Francisco, CA) s použitím 2,25 ul zriedenej vzorky zo špecifickej cieľovej amplifikácie, spolu s Taqman Assays (ABI) pre každý génový transkript (S1Table), Taqman Universal master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a Load Reagent (Fluidigm), naplnením a zavedením čipu cez HX IFC Controller a vykonaním qPCR v systéme BioMark (Fluidgm). Relatívne množstvo expresie RNA sa vypočítalo pomocou komparatívneho cy metóda prahu cle (CT). Hodnoty expresie boli normalizované na 18 s použitím endogénnej referenčnej ribozomálnej RNA a univerzálnej RNA (Agilent Inc., Santa Clara, CA).

Štatistika

Všetky testy qPCR sa uskutočňovali v duplikátoch. Všetky údaje sú prezentované ako priemer ± SEM. Na porovnanie génov CRM na fenotyp sa použil model so zmiešanými účinkami s Geisser-Greenhouseovou korekciou s viacerými porovnávacími korekciami vykonanými pomocou dvojstupňového lineárneho postupu Beniaminiho, Kriegera a Yekutieliho. Pearsonova korelácia a hierarchické oprašovanie boli vykonané v Morpheus (Broad Institute). V prípade modelov predpovedí strojového učenia boli údaje rozdelené na trénovaciu množinu (80 percent) a testovaciu množinu (20 percent). Na určenie najpresnejšej hranice skóre uCRM sa použil model klasifikácie rozhodovacieho stromu, validovaný na testovacej sade. Selekcia premenných pomocou náhodných lesov (VSURF) sa použila na klasifikáciu AR ys STA, ako aj na hodnotenie a klasifikáciu dôležitosti jednotlivých génov. Výstup dôležitosti premennej Random Forest je definovaný ako priemerný percentuálny pokles nepresnosti modelu premennej (génu) boli vylúčené (náhodne permutované) z modelu. Oprášenie bez dozoru na vizualizáciu separácie fenotypu sa uskutočnilo pomocou distribuovaného stochastického susedného embed-ding algoritmu (t-SNE) v Mathematica 11.3 (Wolfram Research, Champaign. IL). Sieťová analýza CRM génov bola vykonaná pomocou GeneMANIA [37]. Štatistika demografických premenných sa uskutočnila pomocou analýzy chí-kvadrát pre diskrétne a Kruskal-Wallisovho testu pre spojité premenné v IMP 14.2 (SASInstitute, Cary, NC). Pokiaľ nie je uvedené inak. všetky ostatné analýzy boli uskutočnené a vizualizované pomocou Prism 8.0.1 (GraphPad, Carlsbad, CA).

Schválenie štúdie

Štúdiu schválili etické komisie lekárskej fakulty Stanfordskej univerzity a zdravotníckeho centra UCSF. Všetci dospelí pacienti a rodičia/opatrovníci iných ako dospelých pacientov poskytli písomný informovaný súhlas s účasťou na výskume v plnom súlade s Helsinskou deklaráciou. Uvedené klinické a výskumné aktivity sú v súlade s princípmi Istanbulskej deklarácie, ako je uvedené v Istanbulskej deklarácii o obchodovaní s orgánmi a transplantačnej turistike.

ÚČINKY CSITANCHE: ZLEPŠENIE IMUNITY

Výsledky

Základné klinické a demografické premenné pre všetkých 150 príjemcov KTx s fenotypmi AR, bAR, BKVN a STA sú uvedené v tabuľke 1.

Relatívna hojnosť a korelácia expresie génu CRM v sedimente myších buniek

Relatívna hojnosť. Na stanovenie relatívneho množstva transkriptov génu CRM v močových sedimentoch sa ako metrika hojnosti použili hodnoty prahu cyklu (Ct). Čím nižšia je hodnota Ct, tým vyššia je jej abundancia medzi génmi CRM. Spomedzi 11 génov CRM bol BASP1 najhojnejším transkriptom v sedimente močových buniek. Po BASP1 nasledovali TAP1, PSMB9 a ISG20 ako 4 najpočetnejšie transkripty. LCK a CD6 patrili medzi najmenej zastúpené transkripty v močových sedimentoch v súbore génov CRM. Keďže hodnoty Ct sa pohybovali od najnižšej hodnoty Ct 14 do najvyššej hodnoty Ct 20, medzi génovými transkriptmi BASP1 a CD6 bol 64--násobný rozdiel, pričom CD6 bol najmenej zastúpený transkript.

Obr. 2. Relatívna abundancia a korelácia množstva CRM génov v moči a expresia CRM génov naprieč rôznymi klinickými fenotypmi transplantácie obličky. A. Pearsonova korelačná matica demonštrujúca koreláciu medzi 11 génmi CRM v ich expresii v sedimentoch močových buniek. Veľkosť štvorca slúži ako vizuálny indikátor sily korelácie. B. Teplotná mapa s kontrolovaným zhlukom podľa fenotypu demonštrujúcim relatívnu expresiu CRM génov v AR, bAR, BKVN a STA. C. Husľové grafy zobrazujúce distribúciu CRM génov v AR, bAR, BKVN a STA bunkovej pelete moču. � naznačuje, že AR vs STA bola významná po viacnásobnom porovnaní. # naznačuje, že bAR vs STA bol významný po viacnásobnom porovnaní. Ďalšie štatistiky sú k dispozícii v tabuľke 2.

Korelácia génovej expresie medzi génmi CRM.

Ďalej sme hodnotili koreláciu génovej expresie medzi 11 CRM génmi. Korelácia sa pohybovala od veľmi slabej (r=-0,17 pre CXCL9 a NKG7 a r=-0,10 CXCL10 a RUNX3) po veľmi silnú (r=0,77 pre INPP5D a TAP1 a rovnaká hodnota pre CD6 a LCK). Hoci CXCL9 a CXCL10 patria do rovnakej triedy chemokínov, korelácia génovej expresie medzi nimi bola len mierna (r=0.46). Grafická prezentácia korelačnej matice je znázornená na obr. 2A. Tepelná mapa vytvorená pomocou kontrolovaného zhlukovania demonštruje značné zvýšenie hodnôt génovej expresie génov CRM v AR, bAR a BKVN v porovnaní s fenotypom STA (obr. 2B).

Expresia génu uCRM v močových sedimentoch s biopsiou potvrdenou AR a BKVN

Génová expresia CRMgénov v AR a bAR. Ďalej sme hodnotili génovú expresiu každého z 11 CRM génov z hľadiska ich relatívnej expresie v AR, bAR, BKVN a STA. Súhrn výsledkov analýzy je uvedený v tabuľke 2 a na obrázku 2C.1 0 z 11 génov sa významne zvýšili v sedimentoch AR moču v porovnaní s močovými sedimentmi z STA. Avšak iba päť génov CRM (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7 a Psmb9) bolo významne upregulovaných vo vzorkách bAR v porovnaní s STA a ich expresia v skupine bAR bola relatívne nižšia ako v skupine AR odstupňovanej podľa Banffa, čo zdôrazňuje, že gény uCRM môžu odráža zápalovú záťaž v aloštepe Eig 2C.

Tabuľka 2. Hladiny génovej expresie génov CRM naprieč rôznymi fenotypmi

Génová expresia CRMgénov v BKVN. Expresia CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7 a PSMB9 bola rozdielne regulovaná vo vzorkách moču u pacientov s BKVN v porovnaní so vzorkami od pacientov so STA. Zo šiestich génov so štatisticky odlišnými hodnotami génovej expresie medzi vzorkami BKVN a STA bola expresia iba NKG7 podstatne nižšia v moči BKVN.

Stanovenie skóre expresie génu CRM (uCRM) v moči na identifikáciu odmietnutia transplantátu obličky

Pretože expresia génového súboru CRM nebola homogénna naprieč transplantačnými fenotypmi a medzi rôznymi génmi došlo k značnému fyziologickému krížovému rozhovoru (obr. S1), na ďalšiu diferenciáciu a klasifikáciu fenotypov sme použili nelineárne kontrolované metódy. Na určenie vzťahov medzi génmi uCRM a fenotypmi sa uskutočnilo zhlukovanie bez dozoru prostredníctvom t-SNE. Obrázok 3A ukazuje graf t-SNE, čo naznačuje, že 11 génov CRM mohlo takmer úplne oddeliť AR od vzoriek STA. Model VSURF, v závislosti od skóre dôležitosti náhodných lesov, určil, že PSMB9 a CXCL10 boli dva najdôležitejšie gény pri uspokojovaní AR z STA. Obr. 3B ďalej znázorňuje význam týchto 2 génov. Graf dôležitosti génových váh označuje, že ak je ktorýkoľvek z 2 génov vylúčený z modelu, zodpovedá približne 20-percentnému zníženiu nepresnosti modelu. Tieto dva gény mohli klasifikovať AR oproti STA s takmer rovnakou presnosťou ako 1l génový model, so senzitivitou 93,6 percenta a špecifickosťou 97,6 percenta. Prahové hodnoty génovej expresie pre tieto dva gény boli určené klasifikátorom rozhodovacieho stromu a hodnoty logaritmickej stupnice týchto dvoch génov sú znázornené na obr. 3C. Hranica 28 pre CXCL10 a 3 pre PSMB9 správne klasifikovala 86/88 prípadov AR & STA s celkovou presnosťou 97,7 percenta. Predovšetkým vzorky bAR spadali medzi fenotypy AR a STA, čo naznačuje gradáciu týchto dvoch génov v stupni zápalu aloštepu.

Na preskúmanie klasifikačnej výkonnosti skóre uCRM v prípadoch AR, hraničnej AR a STA sa vytvoril klasifikátor rozhodovacieho stromu (obr. 4A). Rozhodovací strom určil optimálne prahy skóre uCRM pre každý fenotyp. Skóre vyššie ako 4 správne klasifikovalo 44/49 prípadov AR; skóre menšie ako 1,8 správne klasifikovalo 33/35 prípadov STA. 14/23 hraničných prípadov bolo medzi týmito dvoma prahmi. Distribúcia skóre uCRM podľa fenotypu je znázornená na obrázku 4B. Priemerné skóre uCRM (SEM) pre AR, bAR a STA boli 8,195 (0,631), 3,265 (0,412{{21 }}), respektíve 1,404 (0,162) a všetky porovnania boli významné po korekcii viacerých porovnaní. Skóre uCRM dokázalo s vysokou presnosťou rozlíšiť medzi AR a STA – pri prahovej hodnote 3,63 bola citlivosť 95,35 percenta a špecifickosť 97,78 percenta (Eig 4C. Pri rozlišovaní medzi AR a kombináciou bAR a STA sa skóre uCRM zachovalo vysoká presnosť pri rovnakom prahu, senzitivita a špecificita boli 87,10 percent a 97,78 percent v tomto poradí (obr. S2A).

Pri zahrnutí vzoriek BKVN sa všetky fenotypy výrazne líšili od seba po korekcii viacerých porovnaní okrem bAR a BKVN (S2BFig). Pri rozlišovaní medzi AR a kombináciou bAR, STA a BKVN si skóre uCRM stále zachovalo vysokú, ale nižšiu presnosť. Pri použití rovnakých prahových hodnôt 3,63 bola citlivosť 76,92 percenta a špecifickosť 97,78 percenta (S2CFig).

ComScore koreluje s histologickými léziami biopsie špecifickými pre AR Trend zvyšovania skóre uCRM z STA na bAR na AR naznačuje, že skóre uCRM by mohlo odhaliť klinicky relevantné gradácie zápalu. Ako také sme hodnotili, či skóre uCRM bolo spojené s rozsahom histologických lézií AR pozorovaných v zodpovedajúcich biopsiách od toho istého pacienta, ktoré boli zozbierané súčasne. Ako je vidieť na obrázku 5A a 5B, skóre uCRM korelovalo s rozsahom tubulitídy(t) a skóre biopsie intersticiálneho zápalu(i) v AR(R=0.5479, P<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

ÚČINKY CSITANCHE: PROTI ÚNAVE

Diskusia

V transplantačnej medicíne je naliehavá potreba vyvinúť spoľahlivé a neinvazívne monitorovacie nástroje, ktoré môžu pomôcť transplantačným lekárom predpovedať riziko poranenia aloštepu, prednostne skôr, ako už bolo zistené poškodenie aloštepu. Zatiaľ čo množstvo transkripčných biomarkerov bolo spojených s AR, väčšina štúdií sa v podstate zamerala na jedinečný alebo jediný transkripčný faktor a neodráža celú molekulárnu komplexnosť biologického procesu odmietnutia aloštepu [11,38]. Okrem toho, zatiaľ čo súčasným zlatým štandardom na diagnostikovanie prítomnosti imunitne sprostredkovaného poškodenia aloštepu je biopsia aloštepu, je dobre známe, že tento postup má kľúčové obmedzenia, pokiaľ ide o časté chybné zastúpenie vzoriek, jeho vysoké náklady a nepraktickosť pri opakovaní. skríningu kvôli invazívnemu charakteru techniky.

Niekoľko správ preukázalo hodnotu štúdia rôznych biomarkerov predpovedajúcich AR vo vzorkách moču príjemcov transplantovanej obličky [20-22]. Zvýšené hladiny imunitných efektorových molekúl a transkriptov v moči, ako je granzým B. CXCL10.CXCL9.IFN-y a CXCR3. Ukázalo sa, že sú vysoko spojené s AR a v niektorých prípadoch dokonca predpovedajú nástup AR vopred [19,24,39-43]. Využitím nedávno publikovaných údajov našej skupiny [2Z, 29,44], ktoré ukazujú spoločný modul odmietania génovej expresie v biopsiách aloštepu počas AR, bez ohľadu na typ tkanivového orgánu, bolo hlavným cieľom tejto štúdie zistiť, či hodnotenie CRM v moči pacientov po transplantácii obličky by mohol byť užitočný ako ideálny neinvazívny biomarker predpovedajúci nástup AR.

Zatiaľ čo mnohé z jednotlivých génov CRM a génových produktov boli hodnotené individuálne, toto je prvá správa o kolektívnom, neinvazívnom použití génov CRM pri predikcii AR v KTx. Napríklad močová CXCL9 mRNA a proteín a CXCL10 mRNA boli predtým hodnotené v multicentrických štúdiách na diagnostiku AR[13,45,46. Transkripty PSMB9 v renálnych biopsiách boli tiež predtým spojené s kvalitou štepu a predikciou akútnej rejekcie [ 47].

Analyzovali sme údaje o génovej expresii v močových sedimentoch od pacientov s KTx na relatívne množstvo CRM transkriptov a ich koreláciu expresie medzi CRM génmi (obr. 2A). V súlade s našou predtým publikovanou štúdiou analyzujúcou skóre CRM vo vzorkách tkanivových obličkových a pľúcnych aloimplantátov CRM gény mali zvýšenú expresiu v AR a iných transplantačných poraneniach, ako sú AR a BKVN (obr. 2B a 2C). V tejto správe sme tiež pozorovali silnú koreláciu medzi novo vyvinutým skóre uCRM a histologickým skóre zápalu (skóre t a ii biopsií obličiek). Pretože väčšina týchto CRM génov je exprimovaná takmer výlučne v infiltrujúcich imunitných bunkách, zvýšená expresia CRM génov v močových sedimentoch naznačuje, že dochádza k zvýšenému uvoľňovaniu infiltrujúcich imunitných buniek v moči príjemcov transplantátu obličky, ktorí podstúpili poškodenie štepu.

Ďalej sme použili kombinované skóre vypočítané z individuálnych hodnôt génovej expresie jednotlivých génov CRM, ComScore, ako metriku na klasifikáciu pacientov s transplantovanou obličkou buď na pacienta s akútnym odmietnutím alebo bez poškodenia, a určili sme prah pre AR. Výsledky z tejto štúdie demonštrujú silu testu uCRM nielen na identifikáciu pacientov s AR, ale aj na kvantifikáciu stupňa poškodenia, ku ktorému dochádza v aloštepe, pretože skóre sa zvyšuje z nízkych hodnôt u pacientov s STA na stredné hodnoty u pacientov s bAR, a na vysoké hodnoty u pacientov s AR, čo sa odráža v histologických skóre tubulitídy a intersticiálneho zápalu. Sme presvedčení, že skóre uCRM má potenciálnu užitočnosť pri monitorovaní transplantácie a môže slúžiť ako doplnok alebo odporúčací test na biopsie. Pacient s nízkym skóre uCRM môže byť schopný vyhnúť sa zbytočným biopsiám podľa protokolu, zatiaľ čo pacient s vysokým skóre uCRM môže vyžadovať sériové monitorovanie alebo biopsiu pre príčinu na posúdenie stavu štepu.

Uznávame niekoľko obmedzení tejto štúdie, ktoré zahŕňajú (i) obmedzenú veľkosť vzorky štúdie, (ii) absenciu iných fenotypov poškodenia transplantátu, ako je chronické poškodenie aloštepu alebo toxicita lieku, a (i) nedostatok hodnotenia skóre uCRM v pozdĺžnom vzorka vo väčšej veľkosti kohorty. Tieto sľubné zistenia naznačujú, že sú potrebné ďalšie prospektívne štúdie na overenie a úplné posúdenie potenciálnej užitočnosti skóre uCRM v klinickom prostredí. V súhrne uvádzame neinvazívny biomarker založený na moči vyvinutý zo spoločného odmietnutého modulu zloženého z 11 génov, ktoré dokážu identifikovať poškodenie a odmietnutie transplantátu u pacientov s transplantovanou obličkou.

ÚČINKY CSITANCHE: ZLEPŠENIE PAMÄTE

Referencie

1 Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Ettenger RE, Agodoa LY a kol. Porovnanie mortality u všetkých dialyzovaných pacientov, dialyzovaných pacientov čakajúcich na transplantáciu a príjemcov prvej kadaveróznej transplantácie. New England Journal of Medicine. 1999; 341 (23): 1725–30.

2. Laupacis A, Keown P, Pus N, Krueger H, Ferguson B, Wong C a kol. Štúdia kvality života a nákladovej užitočnosti transplantácie obličky. Obličky internacionála. 1996; 50(1):235-42. PMID: 8807593.

3. Lodhi SA, Lamb KE, Meier-Kriesche HU. Zlepšenie dlhodobých výsledkov pre pacientov po transplantácii: zdôvodnenie dlhodobého a multidisciplinárneho výskumu špecifického pre danú chorobu. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2011; 11(10):2264-5.

4. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R, et al. Progresívne histologické poškodenie obličkových aloimplantátov je spojené s expresiou génov vrodenej a adaptívnej imunity. Obličky internacionála. 2011; 80 (12): 1364-76.

5. Sigdel TK, Li L, Tran TQ, Khatri P, Naesens M, Sansanwal P a kol. Non-HLA protilátky proti imunogénnym epitopom predpovedajú vývoj chronického poškodenia renálneho aloštepu. Časopis Americkej nefrologickej spoločnosti: JASN. 2012; 23 (4): 750-63.

6. Pape L, Offner G, Ehrich JH, de Boer J, Persijn GG. Funkcia obličkového aloštepu v pároch pediatrických a dospelých príjemcov od rovnakého darcu. Transplantácia. 2004; 77 (8): 1191-4. PMID: 15114083.

7. Provoost AP, Wolff ED, de Keijzer MH, Molenaar JC. Vplyv veľkosti príjemcu na funkciu obličiek po transplantácii obličky. Experimentálny a klinický výskum. Časopis pre detskú chirurgiu. 1984; 19(1):63-7.

8. Moreso F, Lopez M, Vallejos A, Giordani C, Riera L, Fulladosa X, et al. Sériové protokolové biopsie na kvantifikáciu progresie chronickej transplantačnej nefropatie v stabilných obličkových aloimplantátoch. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2001; 1(1):82-8. PMID: 12095044.

9. Davis ID, Oehlenschlager W, O'Riordan MA, Avner ED. Detská renálna biopsia: mal by sa tento postup vykonávať ambulantne? Detská nefrológia. 1998; 12(2):96-100. PMID: 9543363.

10. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O a kol. Test kSORT na detekciu pacientov po transplantácii obličky s vysokým rizikom akútneho odmietnutia: výsledky multicentrickej štúdie AART. PLoS medicina. 2014; 11(11):e1001759.

11. Sarwal M, Chua MS, Kambham N, Hsieh SC, Satterwhite T, Masek M a kol. Molekulárna heterogenita pri akútnom odmietnutí obličkového aloštepu identifikovaná profilovaním DNA microarray. The New England Journal of Medicine. 2003; 349 (2): 125–38.

12. Sigdel TK, Sarwal MM. Nedávne pokroky v objavovaní biomarkerov pri transplantácii pevných orgánov pomocou proteo mikrofónov. Odborný posudok proteomiky. 2011; 8(6):705-15. https://doi.org/10.1586/epr.11.66 PMID: 22087656.

13. Suthanthiran M, Schwartz JE, Ding R, Abecassis M, Dadhania D, Samstein B a kol. Profil mRNA močových buniek a akútne odmietnutie buniek v aloštepoch obličiek. New England Journal of Medicine. 2013; 369 (1): 20-31.

14. Sigdel TK, Gao Y, He J, Wang A, Nicora CD, Fillmore TL a kol. Ťažba proteómu ľudského moču na monitorovanie poškodenia obličkového transplantátu. Obličky internacionála. 2016; 89 (6): 1244-52. https://doi.org/10.1016/j. knit.2015.12.049 PMID: 27165815.

15. Sigdel TK, Ng YW, Lee S, Nicora CD, Qian WJ, Smith RD a kol. Perturbácie v močovom exozóme pri odmietnutí transplantátu. Hranice v medicíne. 2014; 1:57.

16. Yang JY, Sarwal MM. Genetika a genomika transplantátov. Príroda recenzie genetiky. 2017; 18(5):309–26.

17. Loupy A, Lefaucheur C, Vernerey D, Chang J, Hidalgo LG, Beuscart T a kol. Stratégia molekulárneho mikroskopu na zlepšenie stratifikácie rizika pri včasnom odmietnutí obličkového aloštepu sprostredkovaného protilátkami. Časopis Americkej nefrologickej spoločnosti: JASN. 2014; 25(10):2267-77. Epub 2014/04/05.

18. Sigdel TK, Vitalone MJ, Tran TQ, Dai H, Hsieh SC, Salvatierra O a kol. Rýchly neinvazívny test na detekciu poškodenia obličkového transplantátu. Transplantácia. 2013; 96(1):97-101. PMID: 23756769.

19. Hauser IA, Spiegler S, Kiss E, Gauer S, Sichler O, Scheuermann EH a kol. Predpoveď akútneho odmietnutia renálneho aloštepu močovým monokínom indukovaného IFN-gama (MIG). Časopis Americkej nefrologickej spoločnosti: JASN. 2005; 16 (6): 1849-58.

20. Hu H, Kwun J, Aizenstein BD, Knechtle SJ. Neinvazívna detekcia akútnych a chronických poranení pri transplantácii ľudskej obličky zvýšením množstva cytokínov / chemokínov v moči. Transplantácia. 2009; 87 (12): 1814-20. PMID: 19543058.

21. Jackson JA, Kim EJ, Begley B, Cheeseman J, Harden T, Perez SD, a kol. Močové chemokíny CXCL9 a CXCL10 sú neinvazívne markery odmietnutia obličkového aloštepu a vírusovej infekcie BK. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2011; 11(10):2228-34.

22. Schaub S, Nickerson P, Rush D, Mayr M, Hess C, Golian M, a kol. Hladiny CXCL9 a CXCL10 v moči korelujú s rozsahom subklinickej tubulitídy. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2009; 9 (6): 1347-53.

23. Segerer S, Cui Y, Eitner F, Goodpaster T, Hudkins KL, Mack M a kol. Expresia chemokínov a chemokínových receptorov počas odmietnutia ľudského obličkového transplantátu. Americký žurnál chorôb obličiek: oficiálny žurnál National Kidney Foundation. 2001; 37 (3): 518-31. PMID: 11228176.

24. Tatapudi RR, Muthukumar T, Dadhania D, Ding R, Li B, Sharma VK a kol. Neinvazívna detekcia zápalu obličkového aloštepu meraním mRNA pre IP-10 a CXCR3 v moči. Obličky internacionála. 2004; 65 (6): 2390-7.

25. Menon MC, Murphy B, Heeger PS. Posun biomarkerov ku klinickej implementácii pri transplantácii obličiek. JASN. 2017.

26. Naesens M, Anglicheau D. Precision Transplant Medicine: Biomarkers to the Rescue. JASN. 2017.

27. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Visser K, Morgan AA, Gong Y a kol. Spoločný rejekčný modul (CRM) pre akútne odmietnutie medzi viacerými orgánmi identifikuje nové terapeutiká na transplantáciu orgánov. Časopis experimentálnej medicíny. 2013; 210(11):2205–21.

28. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I a kol. Výpočtové skóre génovej expresie na predpovedanie poškodenia imunity v obličkových aloimplantátoch. PloS jedna. 2015; 10(9):e0138133.

29. Secrets A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I, et al. Spoločný rejekčný modul pri chronickej rejekcii po transplantácii pľúc. PloS jedna. 2018; 13(10):e0205107. Epub 2018/10/06.

30. Sis B, Mengel M, Haas M, Colvin RB, Halloran PF, Racusen LC a kol. Správa zo stretnutia v Banff '09: zhoršenie štepu sprostredkované protilátkami a implementácia pracovných skupín v Banff. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2010; 10(3):464-71.

31. Solez K, Colvin RB, Racusen LC, Haas M, Sis B, Mengel M a kol. Banff 07 klasifikácia patológie renálneho aloštepu: aktualizácie a budúce smery. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2008; 8 (4): 753-60.

32. Sarwal MM, Ettenger RB, Dharnidharka V, Benfield M, Mathias R, Portale A a kol. Úplné vyhýbanie sa steroidom je účinné a bezpečné u detí s transplantáciou obličiek: multicentrická randomizovaná štúdia s trojročným sledovaním. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2012; 12(10):2719-29.

33. Racusen LC. Banffova schéma a diferenciálna diagnostika dysfunkcie aloštepu. Transplantačné konania. 2004; 36 (3): 753-4.

34. Jianghua C, Wenqing X, Huiping W, Juan J, Jianyong W, Qiang H. C4d ako významný prediktor humorálnej rejekcie v obličkových aloimplantátoch. Klinická transplantácia. 2005; 19(6):785-91.

35. Crespo M, Pascual M, Tolkoff-Rubin N, Mauiyyedi S, Collins AB, Fitzpatrick D, a kol. Akútne humorálne odmietnutie u príjemcov renálneho aloštepu: I. Incidencia, sérológia a klinické charakteristiky. Transplantácia. 2001; 71 (5): 652-8. PMID: 11292296.

36. Keslar KS, Lin M, Zmijewska AA, Sigdel TK, Tran TQ, Ma L a kol. Multicentrické hodnotenie štandardizovaného protokolu pre neinvazívne profilovanie génovej expresie. AJT. 2013.

37. Montojo J, Zuberi K, Rodriguez H, Bader GD, Morris Q. GeneMANIA: Rýchla konštrukcia génovej siete a predikcia funkcie pre Cytoscape. F1000Research. 2014; 3:153.

38. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH. Identifikácia génov odlišne regulovaných interferónom alfa, beta alebo gama pomocou oligonukleotidových polí. Zborník Národnej akadémie vied Spojených štátov amerických. 1998; 95 (26): 15623–8.

39. Hartono C, Muthukumar T, Suthanthiran M. Neinvazívna diagnostika akútneho odmietnutia obličkových aloštepov. Súčasný názor na transplantáciu orgánov. 2010; 15(1):35-41. https://doi.org/10.1097/MOT. 0b013e3283342728 PMID: 19935064.

40. Lazzeri E, Rotondi M, Mazzinghi B, Lasagni L, Buonamano A, Rosati A a kol. Vysoká expresia CXCL10 v odmietnutých obličkách a prediktívna úloha predtransplantačného séra CXCL10 pre akútne odmietnutie a chronickú nefropatiu aloštepu. Transplantácia. 2005; 79(9):1215-20. PMID: 15880073.

41. Matz M, Beyer J, Wunsch D, Mashreghi MF, Seiler M, Pratschke J a kol. Včasná potransplantačná IP-10 expresia v moči po transplantácii obličky predpovedá krátkodobú a dlhodobú funkciu štepu. Obličky internacionála. 2006; 69 (9): 1683-90.

42. Simon T, Opelz G, Wiesel M, Ott RC, Susal C. Merania sériového periférneho krvného perforínu a génovej expresie granzýmu B na predikciu akútneho odmietnutia u príjemcov obličkového štepu. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2003; 3(9):1121-7. PMID: 12919092.

43. Yannaraki M, Rebibou JM, Ducloux D, Saas P, Duperrier A, Felix S, a kol. Močové cytotoxické molekulárne markery pre neinvazívnu diagnostiku pri akútnej rejekcii obličkového transplantátu. Transplant international: oficiálny časopis Európskej spoločnosti pre transplantáciu orgánov. 2006; 19(9):759-68. https://doi.org/10. 1111/j.{8}}.2006.00351.x PMID: 16918537.

44. Yang JYC, Verleden SE, Zarinsefat A, Vanaudenaerde BM, Vos R, Verleden GM a kol. Bezbunková DNA a CXCL10 odvodené z bronchoalveolárnej laváže predpovedajú prežitie po transplantácii pľúc. J Clin Med. 2019; 8(2). Epub 20. 2. 2019.

45. Faddoul G, Nadkarni GN, Bridges ND, Goebel J, Hricik DE, Formica R, et al. Analýza biomarkerov počas prvých 2 rokov po transplantácii a 5-Výsledky po transplantácii obličky počas jedného roka: Výsledky klinických skúšok pri transplantácii orgánov-17. Transplantácia. 2018; 102 (4): 673-80. Epub 12. 12. 2017.

46. ​​Hricik DE, Nickerson P, Formica RN, Poggio ED, Rush D, Newell KA, et al. Multicentrická validácia močového CXCL9 ako biomarkeru na stratifikáciu rizika pre poškodenie obličkového transplantátu. Americký časopis pre transplantácie: oficiálny časopis Americkej transplantačnej spoločnosti a Americkej spoločnosti transplantačných chirurgov. 2013; 13(10):2634-44. Epub 24. 8. 2013.

47. Kotsch K, Kunert K, Merk V, Reutzel-Selke A, Pascher A, Fritzsche F, et al. Nové markery v biopsiách obličiek s nultou hodinou naznačujú kvalitu štepu a klinický výsledok. Transplantácia. 2010; 90(9):958-65. Epub 23. 9. 2010. PMID: 20859252.