Exozómy moču identifikujú zápalové cesty pri akútnom poškodení obličiek spojenom s vankomycínom

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 a v mene priamych vyšetrovateľov †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, CA 92093, USA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 School of Medicine, University of California, San Diego, CA 92093, USA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, USA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Division of Renal Diseases and Hypertension, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, USA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Lekárska fakulta, University of Colorado, Aurora, CO 80045, USA

8 Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, USA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Michigan Medical System, Ann Arbor, MI 48109, USA; satishpr@med.umich.edu

* Korešpondencia: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plus 858-534-3919

† Členstvo v Priamych výskumných pracovníkoch je uvedené v Poďakovaní.

Abstrakt:

Pozadie:Vankomycín sa bežne používa ako liečba prvej línie pre grampozitívne organizmy, ako je Staphylococcus aureus rezistentný na meticilín. Akútna vyvolaná vankomycínomobličkyzranenie(V-AKI) bol hlásený až u 43 percent pacientov, najmä u tých s vyššími cieľovými minimálnymi koncentráciami. Presný mechanizmus poškodenia u ľudí zostáva nepolapiteľný, pričom nedávne dôkazy smerujú k apoptóze buniek proximálneho tubulu. V tejto štúdii sme skúmali obsah proteínov v močových exozómoch u pacientov s V-AKI, aby sme ďalej objasnili biomarkery mechanizmov poškodenia a potenciálnych reakcií. Metódy: Do analýzy boli zahrnuté vzorky moču od pacientov s V-AKI, ktorí boli zaradení do štúdie DIRECT, a zdravých kontrol z UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository. Exozómy sa extrahovali použitím princípu vylučovania rozpúšťadla a zrážania indukovaného polyetylénglykolom. Proteínová identita a kvantifikácia boli stanovené kvapalinovou chromatografiou bez značenia a hmotnostnou spektrometriou (LC/MS). Priemerný vrchol sérového kreatinínu bol 3,7 ± 1,4 mg/dl a čas doobličkyzraneniebol 4.{1}} ± 3.0 dní. Pri prepustení preukázalo 90 percent pacientov čiastočné zotavenie; 33 percent zaznamenalo úplné zotavenie do 28. dňa. Proteomické analýzy piatich V-AKI a 7 kontrolných vzoriek odhalili 2009 proteínov vo všetkých vzorkách a 251 proteínov významne spojených s V-AKI (Pi-skóre > 1). Najlepšie rozlišujúce proteíny boli komplement C3, komplement C4, galektín -3-viažuci proteín, fibrinogén, alfa-2 makroglobulín, imunoglobulínový ťažký konštantný mu a sérotransferín.

Záver:Močové exozómy odhaľujú up-reguláciu in-zápalových proteínov po nefrotoxickom poškodení vo V-AKI. Pre veľkú vzorku pacientov sú potrebné ďalšie štúdie na potvrdenie týchto zistení na objasnenie patofyziologických mechanizmov a validáciu potenciálnych biomarkerov poškodenia.

Kľúčové slová:vankomycín; AKI; nefrotoxicita; exozómy; zápal; dopĺňať; imunitných dráh

Cistanche herbamôže liečiť poškodenie obličiek

Chengdu Wecistanche mácistancheprodukty na liečbu poškodenia obličiek

1. Úvod

Vankomycín je glykopeptidové antibiotikum používané na liečbu infekcií Staphylococcus aureus rezistentných na meticilín u kriticky chorých pacientov. Nefrotoxicita je závažná nežiaduca udalosť postihujúca 10 – 20 percent liečených pacientov a je spojená s predĺženou dĺžkou hospitalizácie, 30-mierou opakovaných hospitalizácií a 30-dennou mortalitou zo všetkých príčin [1]. Akútna súvisiaca s vankomycínomobličkyzranenie(V-AKI) závisí od dávky a začína 4–17 dní od začiatku liečby. Hoci bol V-AKI dlho uznávaný ako hlavný vedľajší účinok vankomycínu, mechanizmy nefrotoxicity zostali nedostatočne pochopené. Pochopenie bunkových a molekulárnych reakcií spúšťaných vankomycínom má kľúčový význam pre pochopenie mechanizmov a vývoj stratégií na minimalizáciu rizika V AKI a súvisiacich nákladov pri maximalizácii jeho účinnosti pri liečbe infekcií. Zdá sa, že toxická renálna odpoveď je spôsobená priamym účinkom vankomycínu na epitel proximálnych tubulov [2]. Doteraz sa na štúdium V-AKI na myších modeloch aplikovali štandardné toxikogenomické prístupy, chýbajú však štúdie u ľudí [3–5]. Zvieracie modely ukazujú, že podávanie vankomycínu vyvoláva oxidačný stres, ktorý môže prispieť k poškodeniu obličiek [6,7]. Jedným z možných mechanizmov poškodenia je zachytenie lieku v proximálnych tubulárnych bunkách, pretože je transportované transportérmi organických katiónov (OCT) cez bazolaterálnu membránu a do bunky proximálneho tubulu, ale neboli identifikované žiadne aktívne efluxné transportné mechanizmy [6] –8].

Exozómy sú mikrocytové vezikuly odvodené z membrány, ktoré hrajú kľúčovú úlohu v medzibunkovej komunikácii a dodávaní proteínov/nukleových kyselín a poskytujú potenciál na objavenie nových biomarkerov na pomoc pri klinickej diagnostikeobličkyzranenie[9]. Bolo navrhnuté, že exozómy majú väčšiu špecifickosť a citlivosť na objavovanie biomarkerov, čo sa pripisuje stabilite vzoriek v porovnaní s transkriptomickými a proteomickými prístupmi s použitím konvenčných vzoriek séra a moču [9]. V tejto štúdii sme testovali hypotézu, že zmena v močových exozómových proteínoch v reakcii na V-AKI pomáha objasniť mechanizmy poškodenia a identifikovať nové biomarkery u pacientov s potvrdeným poškodením obličiek vyvolaným liekmi. Na tento účel sme použili subjekty zo štúdie Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT), čo je medzinárodná, multicentrická kohorta klinicky posudzovaných prípadov liekmi vyvolaných akútnychobličkyzraneniea kontroly založené na populácii na skúmanie farmakogenomických prediktorov pomocou asociácie celého genómu. Podrobnosti o štúdii DIRECT sú opísané v časti Metódy a nedávnej publikácii z nášho laboratória [10].

2. Výsledky

Do analýz boli zahrnuté vzorky moču od 22 subjektov, 10 prípadov V-AKI a 12 kontrol. Demografia pacientov bola podobná medzi prípadmi V-AKI a kontrolami a sú zhrnuté v tabuľke 1. Ako sa očakávalo, prevalencia hypertenzie, cukrovky a srdcového zlyhania bola vyššia v prípadoch V-AKI v porovnaní s kontrolami (tabuľka 1).

Všetky prípady V-AKI vyvinuli AKI štádium 2 alebo vyššie, ako je definované podľa kritérií KDIGO (Obrázok 1) [11]. Nástup V-AKI nastal 4.0 ± 3.0 dní po iniciácii vankomycínu. Časový priebeh zmien sérového kreatinínu (Scr) po prijatí do nemocnice až po prepustenie z nemocnice a potom je znázornený na obrázku 1.

Obrázok 1. Zmeny sérového kreatinínu v priebehu V-AKI kurzu. Tento obrázok znázorňuje zmeny sérového kreatinínu v 10 prípadoch v priebehu akútneho ochorenia spojeného s vankomycínomobličkyzranenieod prijatia do nemocnice až po 90. deň po úraze. Časové body zodpovedajú časovým bodom štúdie Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT). Skratky: SCr=sérový kreatinín, hospitalizácia=hospitalizácia, predliečba=pred expozíciou lieku, DIRI=splnená definícia poškodenia obličiek vyvolaného liekom, DrugDC {{8} } vysadenie lieku alebo zníženie dávky, Nadir Scr=najnižšie sérum po V-AKI, Hospital Disch= prepustenie z nemocnice

Východiskové rizikové faktory v prípadoch V-AKI zahŕňali sepsu (30 percent), srdcové choroby (30 percent), diabetes mellitus (30 percent), anémiu (20 percent), vystavenie rádiokontrastu (10 percent), ochorenie pečene (10 percent) a hypoalbuminémia (10 percent) (obrázok 2).

Nanajvýš prípady V-AKI dostali tri epizódy dávkovania vankomycínu. Denné dávky vankomycínu sa pohybovali od 1000 do 4000 mg. Priemerný (interkvartilný rozsah (IQR)) počet dní strávených v každej dávkovacej epizóde je znázornený na obrázku 3. Priemerné (štandardná odchýlka (SD)) minimálne plazmatické koncentrácie vankomycínu spojené s dávkovacími epizódami 1–3 boli zvýšené na 20,6 ± 8,1, 29,6 ± 16,3, resp. 38,0 ± 13 mg/l. Rozdiel v koncentráciách medzi jednotlivými epizódami však nebol štatisticky významný (epizóda 1 vs. 2 p=0,5, epizóda 2 vs. 3 p=0,41)

Ďalšie údaje o výsledkoch sú zhrnuté v tabuľke 2. Vzhľadom na závažnosť poranenia potrebovalo 20 percent pacientov substitučnú liečbu obličiek. Úmrtnosť v nemocnici bola 10 percent. Po prepustení z nemocnice sa 90 percent pacientov z V-AKI nezotavilo. Šesť pacientov malo namerané Scr na 28. deň po úraze a štyria na 90. deň. Na 28. deň mali dvaja zo šiestich (33 percent) pacientov AKD, ale žiadny zo štyroch zostávajúcich pacientov nemal AKD na 90. deň.Obličkybiopsie boli vykonané v 20 percentách prípadov V-AKI (tabuľka 2).

12 vzoriek, ktoré boli kvalifikované na analýzy po zavedení filtra na porovnávanie peptidov s ich príbuzným spektrom, obsahovalo celkovo 2009 proteínov. Tieto proteíny boli ďalej analyzované. Najprv sa uskutočnila analýza hlavných súradníc (PCoA), aby sa porovnal celkový proteóm každej vzorky. Táto analýza odhalila významnú separáciu (P-hodnota PERMANOVA=0.037) medzi AKI a kontrolnými vzorkami (obrázok 4), čím sa rekapituluje fenotyp systémovej úrovne aj na úrovni exozómového proteínu, čím sa zvyšuje naša dôveryhodnosť v tieto súbory údajov . Sila asociácie medzi každým proteínom a stavom V-AKI bola hodnotená pomocou metriky pi-hodnoty, ktorá kombinuje významnosť p-hodnoty s násobkom zmeny [12].

Obrázok 4. Zloženie proteómu rozlišuje močové exozómy pacientov s V-AKI a kontrol. (A) Analýza hlavných súradníc vzoriek proteómov. Metrika vzdialenosti Bray-Curtis sa použila na výpočet rozdielov medzi vzorkovým proteómom a je znázornený graf hlavných súradníc. Separácia pozdĺž osi 1 a 3 bola pozorovaná medzi vzorkami AKI (červená) a kontrolnými vzorkami (modrá). (B) Boxplot sumarizujúci Bray-Curtisovu vzdialenosť medzi kontrolou a vzorkami AKI. Štatistická separácia medzi AKI a kontrolnými vzorkami znázornená v (A) bola testovaná pomocou permutačnej analýzy variačného testu (PERMANOVA). Sú znázornené boxplochy, ktoré sumarizujú výsledky pri porovnávaní vzdialeností kontrolných vzoriek alebo vzoriek AKI s kontrolnými vzorkami.

Ďalej, binárne porovnania medzi V-AKI a kontrolnými vzorkami poskytli 42 proteínov významne asociovaných s AKI fenotypom a 26 proteínov asociovaných s kontrolným fenotypom (Pi skóre > 1) (doplnková tabuľka S1). Graf sopky ilustrujúci významnosť a násobnú zmenu spojenú s každým proteínom je znázornený na obrázku 5A. Najlepšími diskriminačnými proteínmi pre prípady V-AKI boli fibrinogén, komplement C3, komplement C4, galektín{10}}viažuci proteín, alfa{11}} makroglobulín, imunoglobulínový ťažký konštantný mu a sérotransferín (obrázok 5B). Analýza obohatenia génovej sady sa uskutočnila medzi významnými proteínmi na identifikáciu kategórií proteínov zmenených u pacientov s V-AKI a výsledky sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke S1. Ukázalo sa, že niekoľko proteínov, ktoré boli spojené s AKI-fenotypom, má funkcie viazané na zápal a/alebo sprostredkovanie zápalového fenotypu. Aby sa otestovalo, či tieto zmeny proteínov môžu súvisieť so zmenami v základnej cytokínovej signalizácii, vykonala sa cytokínová inferencia, ktorá naznačovala silný vzťah medzi proteínmi spojenými s AKI a cytokínmi IL10, IL6 a TNF. Tieto cytokíny obsahovali 2,8, 2,3 a 2.{24}}krát viac spojení s AKI-asociovanými proteínmi ako kontrolné-asociované proteíny, v tomto poradí, ako je zhrnuté na obrázku 5C. Interakčné siete proteín-proteín proteínov spojených s AKI a odvodených cytokínov vykazovali prevažne prozápalové spojenia medzi proteínmi spojenými s AKI, ako je zhrnuté na obrázku 5D.

Obrázok 5. Asociácie na úrovni proteínov k V-AKI. (A) Graf sopky zobrazujúci násobok zmeny a význam t-testu každého proteínu na stav V-AKI. Top 10 proteínov spojených s AKI a kontrolným stavom je zobrazených modrou a červenou farbou. Ďalšie asociované proteíny na základe Pi skóre > 1 sú znázornené žltou farbou. (B) Pre každý proteín sa vypočítalo skóre Pi, ktoré zodpovedá násobnej zmene a významnosti t-testu, a vynesú sa do grafu proteíny s najsilnejšími asociáciami. (C) Topcytokíny spojené s AKI alebo kontrolnými proteínmi. Použil sa prístup založený na sieťovom odvodení cytokínov a sú znázornené cytokíny vykazujúce najsilnejšie skóre obohatenia smerom k AKI alebo kontrolným proteínom. Červené stĺpce predstavujú cytokíny súvisiace s proteínmi spojenými s AKI, modré stĺpce predstavujú cytokíny súvisiace s proteínmi spojenými s kontrolou. (D) Interakčná sieť proteín-proteín proteínov spojených s AKI a odvodených cytokínov obohatených o AKI. Vonkajší okraj proteínových uzlín je sfarbený v závislosti od asociácií s pro alebo protizápalovými cytokínmi. Veľkosť každého uzla predstavuje silu štatistickej asociácie každého proteínu so stavom AKI.

Cistanche tubulosamôže liečiť poškodenie obličiek

3. Diskusia

Uvádzame nový prístup k využitiu močových exozómov na informovanie o patofyziologických mechanizmoch zapojených do liekovej indukcieobličkyzraneniepoužitím vankomycínu ako prototypovej renálnej toxickej látky. Jednou zo silných stránok tejto štúdie je začlenenie dobre charakterizovaných údajov na úrovni pacienta zo štúdie DIRECT [10] vyvinutej na objasnenie mechanizmov vrátane genomiky liekov vyvolanýchobličkyzranenie. Jedinci so štádiom 2 alebo vyšším AKI boli na začiatku vystavení konvenčným rizikovým faktorom. Všetci jedinci štúdie mali signifikantne zvýšené plazmatické koncentrácie vankomycínu napriek tomu, že dostávali denné dávky nižšie ako všeobecne akceptovaný prah nefrotoxicity 4 g denne [13]. Mnoho subjektov sa pri prepustení z nemocnice úplne nezotavilo z V-AKI a mesiac po úraze mali akútne ochorenie obličiek. Ako sa dalo očakávať, len málo pacientov dostalo biopsiu obličky.

Proteomika močového exozómu/extracelulárneho vezikula (EV) preukázala, že cielené diskriminačné proteíny pre prípady V-AKI zahŕňali C3 komplement, C4 komplement, galektín-3-viažuci proteín, fibrinogén, alfa-2 makroglobulín, imunoglobulínový ťažký konštantný mu a sérotransferín. Tieto nálezy exozómov informujú o mechanizmoch poškodenia na subcelulárnej/supramolekulárnej úrovni pre V-AKI a potenciálne slúžia ako biomarkery pozdĺž kontinua procesu ochorenia vyvolaného liekmi.

Exozómy prítomné v krvi a moči majú dôležitú úlohu v medzibunkovej komunikácii, koagulácii a odpadovom hospodárstve [14]. Po akútobličkyzranenieexozómy uvoľnené z tubulárnych epiteliálnych buniek môžu prenášať signály poranenia s cieľom získať infiltráciu makrofágov a podporiť tubulointersticiálny zápal [15]. Usúdili sme, že obsah proteínov v exozómoch sa bude líšiť medzi prípadmi V-AKI a zdravými kontrolami. Dvestopäťdesiatjeden proteínov bolo dysregulovaných vo V-AKI a zdá sa, že tieto sa prevažne podieľajú na zápalových a koagulačných dráhach. Spomedzi týchto 251 proteínov naša analýza preukázala, že komplement C3, komplement C4, proteín viažuci galektín{7}}, fibrinogén, alfa-2 makroglobulín, imunoglobulínový ťažký konštantný mu a sérotransferín boli významne spojené s prípadmi V-AKI.

Na základe našich výsledkov, že C3 a C4 patrili medzi najlepšie rozlišujúce exozómové proteíny V-AKI, navrhujeme, aby sa aktivácia komplementového systému podieľala na vankomycínom indukovanom renálnom tubulárnom poškodení. To je tiež v dobrej zhode s publikovanou literatúrou, že aktivácia komplementového systému hrá úlohu pri glomerulonefritíde imunitného komplexu a pri rôznych ochoreniach obličiek [16]. Poškodenie obličiek sprostredkované aktiváciou komplementu pri AKI v dôsledku ischémie alebo expozície nefrotoxínom bolo spojené so systémovými zápalovými príhodami, ktoré spúšťajú a prispievajú k poraneniu vzdialených orgánov a úmrtnosti pacientov [17]. V modeloch ischemicko-reperfúzneho (IR) poškodenia vedie hypoxia, deplécia ATP a mitochondriálne poškodenie k tvorbe voľných kyslíkových radikálov po reperfúzii [18]. Cytokíny, chemokíny a aktivácia komplementu zosilňujú zápal, čo vedie k akútnemu tubulárnemu poškodeniu. Okrem toho sú myši s deficitom receptora C3a a C5a chránené pred poškodením IR [19,20]. Ukázalo sa, že IR poškodenie zvyšuje lokálnu produkciu komponentov komplementuobličkyendotelové a tubulárne bunky [16,21]. Niekoľko štúdií na zvieracích modeloch a ľudských subjektoch identifikovalo zvýšené ukladanie komplementových proteínových produktov, ako sú C3 a C4, pozdĺž tubulárnej bazálnej membrány po traume alebo poraneníobličky. Nezistilo sa, že by tieto zvýšené hladiny depozícií boli signifikantne prítomné v oblasti peritubulárnej alebo glomerulárnej oblasti, ale sú silne koncentrované v tubulárnej membráne, ako je vidieť v biopsiách ľudských a zvieracích modelových obličiek [17]. Exozómy a EV môžu transportovať komponenty komplementu v obehu, keď je aktivácia komplementu dysregulovaná [22,23]. Niekoľko bunkových experimentov a klinických pozorovaní potvrdilo, že uvoľnené EV nesú a modulujú proteíny komplementu a súčasne ich produkcia v zápalovom stave je tiež schopná ovplyvniť počet obehových vezikúl [23]. Táto vzájomná závislosť týchto dvoch procesov vedie k záveru, že EV vykazujú potenciál byť zdrojmi biomarkerov, cieľmi a terapeutickými prostriedkami na dodávanie komplementu a imunomodulačných zlúčenín, ktoré sú vysoko relevantné v rozsahu zápalových mechanizmov AKI. Naše zistenie, že vzorky V-AKI v porovnaní so zdravými kontrolami, demonštruje úlohu imunitných reakcií na priamu toxicitu vankomycínu v tubulárnych bunkách obličiek. Okrem vyššie uvedeného obsahu proteínov predstavujú exozómy/EV odvodené z moču aj potenciálne neinvazívne biomarkery ako alternatívy k biopsii obličiek na detekciu a informovanie o úlohe komplementového systému v liekmi indukovanejobličkyzranenie.

Hoci mnohé predchádzajúce štúdie (pozri niekoľko nasledujúcich viet pre konkrétne odkazy) sa zamerali na úlohu galektínu-3 (Gal-3) vobličkyzranenieexistuje len málo údajov o proteíne viažucom galektín-3 (Gal-3-bp). Gal-3 je exprimovaný v zberných tubuloch obličiek a funguje tak, že podporuje nefrogenézu, moduluje interakcie bunka-bunka a bunka-matrica a reguluje zápal [24–26]. Henderson a kol. preskúmali úlohu Gal-3 pri zápale a zistili, že Gal-3 je kľúčovou zložkou pri chronickom zápale a pri opakovanom poranení tkaniva. Uľahčuje „zamurovanie“ poranenia tkaniva, čím odďaľuje šírenie poranenia [27]. Okrem toho Nishiyama a kol. preukázali na potkanoch s ischemickou AKI, že Gal-3 mRNA bola upregulovaná a nasledujúca reperfúzia, imunohistochémia odhalila zvýšenie Gal-3 naprieč segmentmi nefrónov [25]. Tsuchiyama a kol. zistili, že podávanie Gal-3 potkanom s nefrotoxickou sérovou nefritídou viedlo k zníženiu vylučovania bielkovín močom, tvorbe polmesiaca a zníženiu infiltrácie makrofágov do glomerulov [28]. To naznačuje, že po ischemickom alebo imunitne sprostredkovanom poranení hrá Gal-3 úlohu pri regenerácii. Ako príbuzný partner Gal-3, základná úloha Gal-3-bp a dôvod jeho zvýšenej regulácie pri nefrotoxickom poškodení v dôsledku vankomycínu a iných látok by sa mali v budúcich výskumoch nevyhnutne zamerať.

Naša štúdia tiež zistila, že všetky tri podjednotky fibrinogénu sú dysregulované, v dobrej zhode s predtým publikovanými údajmi. Fibrinogén je rozpustná dimérna molekula plazmy a každý dimér sa skladá z troch polypeptidov: alfa, beta a gama [29]. Hrá kľúčovú úlohu pri hemostáze a koagulácii, ale ukázalo sa, že je tiež dôležitá pri regulácii zápalových stavov [30–32]. Ajay a kol. ukázali, že dostupnosť fibrinogénu je dôležitá pre funkciu obličiek, zápal a prežitie [33]. Okrem toho môže mať fibrinogén antiadhezívny účinok na obličkové epitelové bunky, čo môže byť prospešné tým, že pomáha predchádzať tubulárnej obštrukcii [34]. Fibrinogén je významne zvýšený a upregulovaný v AKI a už predtým bol hodnotený ako potenciálny biomarker pre včasnú detekciu AKI [29]. Hoffman et al. študovali zmenu fibrinogénu po ischémii/reperfúzii a podaní cisplatiny u potkanov a mRNA bola zvýšená 30 minút po bilaterálnom IR poranení a dosiahla vrchol po 48–72 hodinách, zatiaľ čo pri podávaní cisplatiny bola expresia fibrinogénu mRNA detekovaný po 24 hodinách [29]. Fibrinogén v moči bol detegovaný už 3 hodiny po ischemickom-reperfúznom poškodení a 24 hodín po podaní cisplatiny, čo zodpovedá veľkému zvýšeniuobličkyzraneniemolekula 1 (KIM-1) [29].

Výhody Cistanche: dokáže liečiťpoškodenie obličiek

Historicky boli všeobecne akceptované dva rôzne patofyziologické mechanizmy pre V-AKI, akútna tubulárna nekróza z priamych toxických účinkov a akútna intersticiálna nefritída. Renálny proximálny tubulárny epitel podlieha strate cytoskeletálnej integrity, nekróze a apoptóze pri akútnej tubulárnej nekróze [35]. Nekrotické bunky uvoľňujú molekuly, ktoré upregulujú vrodený imunitný systém, čo vyvoláva zápal a urýchľuje tubulárne poškodenie [35]. V súčasnej štúdii sme preukázali zápalové markery v močových EV pacientov s V-AKI. Okrem toho sme našli prozápalový vzťah medzi cytokínmi IL10, IL6 a TNF a našimi špičkovými AKI rozlišujúcimi proteínmi. Celkovo tieto údaje naznačujú, že patofyziológia V-AKI je jedna z tubulárnej toxicity s upreguláciou zápalu počas obdobia 24–72 hodín po poranení.

Naša štúdia má niekoľko obmedzení. Malá veľkosť vzorky 22 pacientov, ktorí boli muži a prevažne kaukazskí, obmedzuje zovšeobecnenie našich zistení na iné pohlavia, rasy a etniká. Druhým obmedzením našej štúdie bolo, že exozómová vzorka moču každého pacienta mala rôzne množstvá celkového proteínu, čo sťažovalo meranie špecifických proteínov, najmä u tých s nižšími absolútnymi množstvami. Aj keď to nie je nevyhnutne obmedzenie tejto štúdie ako také, pretože schopnosť každého jednotlivca zabaliť proteíny do exozómov moču je prirodzene premenlivá, nižšie množstvá proteínov u niektorých jednotlivcov obmedzujú našu schopnosť ďalších analýz a vyvodzovania zmysluplných záverov, ktoré možno zovšeobecniť. väčšie populácie. Tretím obmedzením je vzorka v jednom časovom bode, ktorá obmedzuje naše chápanie bunkových zmien vyskytujúcich sa v rôznych fázach kontinua AKI, napr. fáza okamžitého poranenia, fáza opravy atď. Sekvenčný odber vzoriek prehĺbi naše pochopenie časového priebehu obsahu exozómov zmeny, oxidačný stres vyvolaný akumuláciou liečiva a upregulácia imunitných dráh v oprave. Súčasná štúdia zahŕňala pacientov definovaných prahovými hodnotami Scr. Sérový kreatinín je nedokonalým funkčným biomarkerom obličiek, pretože zvýšenie Scr často zaostáva za poranením [36]. To obmedzuje citlivosť a špecifickosť Scr na včasnú detekciuobličkyzranenie[36] a objavili sa štúdie identifikujúceobličkyzraneniebiomarkery ako naprobličky zraneniemolekula 1 (KIM1) a lipokalín spojený s neutrofilnou gelatinázou (NGAL) na včasnú detekciu nefrotoxicity [37,38]. Ako už bolo uvedené, biomarkery majú potenciál na detekciu zjavných aj subklinických hladín vyvolaných liekomobličkyzranenie[39,40].

4. Materiály a metódy

4.1. Výber pacienta

Do analýzy boli zahrnuté vzorky moču od 10 pacientov s V-AKI, ktorí boli zaradení do štúdie DIRECT [10], a 12 zdravých kontrolných vzoriek moču z biorepozitára UAB-UCSD O'Brien Center. Kontrolné subjekty sa zhodovali podľa pohlavia, rasy a dekády veku so subjektmi štúdie a nemali žiadne expozície vankomycínu alebo známeobličkyzranenie. Štúdia DIRECT je medzinárodná štúdia skúmajúca farmakogenetické prediktory liekovobličkyzraneniepomocou celogenómovej asociačnej štúdie prípadov a populačných kontrol [10]. Štúdia DIRECT bola schválená inštitucionálnou výskumnou radou (IRB č. 121651) a pred zaradením do štúdie sa od všetkých účastníkov získal písomný informovaný súhlas, ktorý zahŕňal poskytnutie použitia uložených vzoriek na budúce analýzy. AKI bola definovaná v DIRECT ako náhle zníženie funkcie obličiek preukázané ktorýmkoľvek z nasledujúcich kritérií: (1) absolútne zvýšenie sérového kreatinínu (Scr) (väčšie alebo rovné 0,3 mg/dl alebo väčšie alebo rovné 26,4 µmol/ L) (v rámci 48-h časového okna) od referenčnej hodnoty Scr, (2) percentuálne zvýšenie Scr väčšie alebo rovné 50 percent (1,5-násobok oproti referenčnej hodnote) v priebehu siedmich dní, (3) zníženie množstva moču výstup (dokumentovaná oligúria).<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) napriek primeranej resuscitácii tekutinami, ak je to možné, (4) absolútny pokles Scr väčší alebo rovný 0,3 mg/dl alebo väčší alebo rovný 26,4 µmol/l (v rámci 48- h časové okno) od referenčného Scr a (5) relatívny pokles v Scr väčší alebo rovný 50 percent (1,5-násobok oproti referenčnému) v priebehu siedmich dní. Do štúdie boli zaradení pacienti so štádiom 2 AKI alebo vyšším po expozícii vankomycínu. Klinické údaje vrátane demografických údajov, lekárskej anamnézy, nálezov fyzických vyšetrení, vitálnych funkcií, chémie krvi a moču, výsledkov biopsie a údajov o dávkovaní liekov sa zbierali v nasledujúcich časových bodoch: (1) prijatie do nemocnice, (2) začatie liečby vankomycínom, ( 3) vrchol poranenia, (4) vysadenie lieku alebo zníženie dávky, (5) vymiznutie zranenia, (6) prepustenie z nemocnice, (7) 28 dní a (8) 90 dní po úraze. Epizóda dávkovania vankomycínu bola definovaná ako zmena v dávke alebo frekvencii. Akútne ochorenie obličiek (AKD) je definované ako pretrvávanie štádia 1 AKI alebo vyššie dlhšie alebo rovné 7 dňom po expozícii [41]. Pacienti boli kategorizovaní s AKD pri prepustení z nemocnice, ak AKI štádium 1 alebo vyššie pretrvávalo a čas od expozície do prepustenia z nemocnice bol dlhší ako sedem dní. Od všetkých účastníkov boli získané vzorky moču a plnej krvi. Všetky prípady V-AKI boli posúdené dvoma nezávislými nefrológmi (EM, JC, RL), aby sa určila kauzalita. Úplný popis metód už bol publikovaný [10].

4.2. Príprava exozómov a zber proteomických údajov

Vzorky moču a krvi sa odobrali od účastníkov štúdie DIRECT a vzorky sa pred prípravou exozómov zmrazili na -80 ◦C. Vzorky moču použité v tejto analýze boli vybrané z časového obdobia najbližšieho k poškodeniu obličiek v rozmedzí od 24 do 72 hodín poobličkyzranenie. Exozómy boli extrahované zo zmrazených vzoriek moču AKI pomocou interného protokolu vyvinutého na princípe vylúčenia rozpúšťadla s použitím polyetylénglykolu (PEG)-indukovaného zrážania, ako je opísané v Rao et al. nedávna publikácia [42] strana exozomálnych proteínov bola vykonaná pred gélovou trypsinizáciou s použitím NuPAGE bisTris10 percentných akrylamidových 12-jamkových gélov na rozlíšenie 40 µl proteínu z exozómov kontrolných vzoriek a vzoriek moču AKI.

Gélové extrakty sa spojili s tlmivým roztokom na zabránenie proteolýzy, ktorý obsahoval 75 mM NaCl (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3 percentá dodecylsulfátu sodného (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, USA), 1 mM NaF (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM beta glycerofosfát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM beta-glycerofosfát (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM sodík ortovanadát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM pyrofosforečnan sodný (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma) a 1× Complete Mini EDTA voľná tableta inhibítora proteázy celá v 50 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 8,5. Na denaturáciu proteínov sa pridal rovnaký objem 8 M močoviny v 50 mM HEPES, pH 8,5 a uskutočnila sa sonikácia sondy s použitím dvoch 10-s intervalov pri 25 percentnej amplitúde. Proteíny boli redukované, alkylované a uhasené použitím ditiotreitolu a jódacetamidu, ako už bolo opísané [43]. Proteíny sa vyzrážali pridaním kyseliny trichlóroctovej (Sigma, St. Louis, MO, USA) do vzoriek na ľade a peletovaním proteínov centrifugáciou pri 4 °C. Proteínové pelety sa dvakrát premyli ľadovo studeným acetónom. Proteínové pelety sa sušili pri 56 °C počas 30 minút, potom sa resuspendovali v 1 M močovine v 50 mM HEPES a potom sa štiepili cez noc pri teplote miestnosti so 6 ug LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, USA) a následne {{27} }h štiepenie trypsínom sekvenčnej kvality (Promega, Fitchburg, WI, USA) pri 37 ◦C. Vzorky boli odsolené cez C18 Sep-Pak a proteíny boli kvantifikované [44]. Celkovo 1,0 ug proteínu na vzorku sa analyzovalo kvapalinovou chromatografiou-tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC-MS [2]) s použitím 85-minútového gradientu kvapalinovej chromatografie na Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) pripojený v rade k hmotnostnému spektrometru Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

Chromatografia sa uskutočňovala na doma ťahanej a naplnenej 30 cm kolóne, ktorá bola trikrát naplnená 0,5 cm, 0,5 cm a 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18, respektíve 1,8 µm C18 a zahriate na 60 ◦C. Peptidy sa najskôr naniesli pri 500 baroch, po čom nasledoval chromatografický gradient v rozsahu od 6 do 25 percent acetonitrilu počas 70 minút, po ktorom nasledoval 5-min gradient do 100 percent acetonitrilu, ktorý sa udržiaval 10 minút. Elektrosprejová ionizácia sa uskutočnila aplikáciou 2000 V cez nerezovú T-spojku spájajúcu analytickú kolónu a systém Easy-nLC. Po každej vzorke nasledovali dve premývania začínajúce s gradientom od 3 do 100 percent acetonitrilu počas 15 minút s ďalšími 10 minútami pri 100 percentách acetonitrilu. Rozsah hmotnosti na nabitie (m/z) 375–1500 sa skenoval na peptidy so stavmi nabitia medzi 2–6. Centroidované dáta sa použili na kvantifikáciu píkov. Akvizícia prebiehala v režime kladných iónov závislom od údajov. Nespracované spektrá boli prehľadávané v Proteome Discoverer Version 2.1 oproti referenčnej databáze UniProt (www.uniprot.org (prístup 5. novembra 2017)) pre Homo sapiens pomocou algoritmu Sequest [18] spolu s reverzným databázovým prístupom používaným na kontrolu peptidov a falošných objavov. sadzby (FDR) na 1 percento [17]. In silico trypsínové štiepenie, ako je špecifikované vo vyhľadávacích parametroch spolu s minimálnou dĺžkou peptidu šiestich aminokyselín. Nastavenia vyhľadávania zahŕňali aj dynamickú modifikáciu oxidácie metionínov a statickú modifikáciu karbamidometylácie cysteínov. Tolerancia hmotnosti prekurzora bola nastavená na 50 ppm a tolerancia hmotnosti fragmentu 0,6 Da.

Okrem toho, že sú obmedzené spektrálne zhody a proteíny<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analýza proteomických údajov

Záznamy analýzy proteomických údajov boli nahrané vo formáte jupyter notebooku do úložiska Github (prístup 3. marca 2021). Analýza princípov súradníc (PCoA) sa uskutočnila pomocou Qiime2 (verzia 2019-7) [45]. Príkaz časovej diverzity core-metrics sa použil na výpočet vzdialeností medzi vzorkami pomocou Bray-Curtisovej metriky a vizualizácie pomocou PCoA. Štatistická analýza vzdialeností medzi kontrolnými vzorkami a vzorkami V-AKI sa uskutočnila pomocou párového testu PERMANOVA pomocou príkazu "významnosť beta-skupiny diverzity qiime". Vizualizácia týchto výsledkov bola vytvorená prostredníctvom balíka seaborn (prístup 3. marca 2021)). Binárne porovnania prípadov V-AKI a kontrolných subjektov sa uskutočnili pomocou balíka scipy ((prístup 3. marca 2021)) pomocou nezávislého t-testu s nerovnakým rozptylom. Sila asociácie medzi každým proteínom a stavom V-AKI bola hodnotená pomocou metriky pi-hodnoty, ktorá kombinuje významnosť p-hodnoty s násobkom zmeny [12]. Ako už bolo opísané vyššie [46], významné asociácie boli definované ako majúce hodnotu pi > |1|. Každá asociácia proteínu so stavom V-AKI bola vynesená do grafu sopky, aby sa ešte viac zdôraznilo umiestnenie proteínov s najvyšším hodnotením. Analýza obohatenia génovej sady sa uskutočnila pomocou servera DAVID [47], pričom sa porovnávali významné proteíny (hodnota pi > |1|) s pozadím všetkých proteínov identifikovaných v súbore údajov. Zhluky súvisiacich funkčných obohatení sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Cytokíny boli najprv filtrované, aby mali aspoň päť spojení s významne zmenenými proteínmi. Potom sa pomer spojení medzi každým cytokínom a proteínmi spojenými s V-AKI alebo s kontrolou porovnal s celkovým počtom spojení medzi proteínmi spojenými s V-AKI alebo kontrolou. Aby sa zohľadnili rozdiely v počte spojení každého cytokínu s inými proteínmi, táto hodnota bola ďalej porovnaná s počtom spojení každého cytokínu so všetkými významne zmenenými proteínmi. Skóre obohatenia pre vybrané cytokíny sa vyniesli do grafu pre ich asociácie buď s proteínmi spojenými s V-AKI alebo s kontrolou. Nakoniec sa pomocou Cytoscape verzie 3.5.1 vizualizovalo rafinované vyhľadávanie proteínov spojených s V-AKI a cytokínov s obohatenými spojeniami s proteínmi spojenými s V-AKI z hľadiska ich interakcií [50]. Interakčné siete proteín-proteín boli zdobené veľkosťou každého proteínu asociovaného s V-AKI podľa ich asociácie pi-skóre k stavu V-AKI a zafarbené tým, že mali odvodené spojenie s obohatenými cytokínmi s pro alebo protizápalovými účinkami.

dračie byliny cistanchemôže liečiťpoškodenie obličiek

5. Závery

Snažili sme sa lepšie pochopiť mechanizmus poškodenia V-AKI z klinicky posudzovaných prípadov a čo je zaujímavé, zistili sme, že komplement, galektín-3 viažuci proteín a fibrinogén boli významne spojené s V-AKI. Výsledky predchádzajúcich a našich štúdií naznačujú úlohu komplementového systému a zápalových dráh vo V-AKI. Zatiaľ čo na overenie molekulárnych procesov pri poškodení indukovanom vankomycínom a následných opravných dráhach sú potrebné väčšie štúdie, výsledky naznačujú, že močové exozómy môžu prispieť dôležitými informáciami o patofyziologických mechanizmoch a môžu slúžiť ako biomarkery pre liekmi indukovanéobličkyzranenie.

Príspevky autora:

Konceptualizácia, LA a SPR, metodika, SV, SPR, DJG, RM; softvér, DJG, RHM, formálna analýza, LA, AL, RHM; šetrenie, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; písanie—pôvodná príprava návrhu, AL, JA, VJ, LA; písanie—recenzia a úprava, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; dozor, SV, SPR; administrácia projektov, LA; získavanie financií, LA Všetci autori si prečítali a súhlasili s uverejnenou verziou rukopisu.

Financovanie:

Tento výskum financovalo International Serious Adverse Events Consortium. MCT bolo podporené grantom na školenie T32 DK007202.

Vyhlásenie Inštitucionálnej revíznej rady: Štúdia bola vykonaná v súlade s pokynmi Helsinskej deklarácie a schválená Inštitucionálnou revíznou radou (alebo etickým výborom) univerzity v Kalifornii, San Diego Human Subjects Research Protections Program (IRB#121651).

Vyhlásenie informovaného súhlasu: Informovaný súhlas sa získal od všetkých subjektov zapojených do štúdie

Poďakovanie:

Chceli by sme oceniť príspevky PRIAMYCH vyšetrovateľov: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Konflikt záujmov:

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

Z: „Močové exozómy identifikujú zápalové cesty pri akútnom poškodení obličiek spojenom s vankomycínom“ od Lindy Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784