Akteozid v čínskej prírodnej rastline-Cistanche na zmiernenie ochorenia obličiek--Časť I

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Prirodzený produkt akteozidov zlepšuje poškodenie obličiek u diabetických db/db myší a buniek HK{0}} prostredníctvom regulácie signálnej dráhy NADPH/oxidáza-TGF-/Smad

Qinwen Wang|Xinxin Dai a kol

Táto štúdia bola navrhnutá tak, aby skúmala ochranné účinky a mechanizmyakteozidna DKD u samcov db/db myší s cukrovkou a buniek HK-2 indukovaných vysokou glukózou. Diabeteskové db/db myši boli rozdelené náhodne do modelovej skupiny, metformínovej skupiny, irbesartanovej skupiny aakteozidskupina. Pozorovali sme prírodný produkt oakteozidvykazujúci významný účinok vochrana obličiekprostredníctvom analýzy biochemických indikátorov a endogénnych metabolitov, histopatologických pozorovaní a Western blottingu. Bunky HK-2 vystavené vysokej hladine glukózy sa použili v experimentoch in vitro. Molekulárne mechanizmy boli skúmané pomocou RT-PCR a Western blotu.akteozidzabraňuje bunkám HK-2 indukovaným vysokou glukózou a cukrovke db/db myší inhibíciou signálnej dráhy NADPH/oxidáza-TGF-/Smad.akteozidregulovali narušenú metabolickú dráhu metabolizmu lipidov, metabolizmu glyoxylátov a dikarboxylátov a metabolizmu kyseliny arachidónovej. Objavili sme prírodný produkt zakteozidvykazuje významný vplyv naochrana obličiek.Táto štúdia pripravila pôdu pre ďalšie skúmanie patogenézy, včasnú diagnostiku a vývoj nového terapeutického činidla pre DKD.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ akteozid, diabetikochorenie obličiek, metabolické profilovanie, signálna dráha NADPH/oxidáza-TGF-/Smad, ROS

Časť I

Akteozid lieči ochorenie obličiek

1|ÚVOD

akteozidje reprezentatívna zložka fenyletanoidných glykozidov, široko rozšírená v 79 rodoch rastlín, ako je Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticolaa iné liečivé rastliny.akteozidsa vyznačuje tým, že kyselina kávová a hydroxytyrozol sú naviazané na glukózovú časť prostredníctvom esterových a glykozidických väzieb s ramnózovou jednotkou pripojenou k molekule glukózy (Zhao et al., 2015). Uvádza sa, žeakteozidmá rozsiahle farmakologické aktivity, ako naprobličkyochrana (Gan et al., 2018), antioxidácia (He et al., 2011), neuroprotekcia (Li, Zhou, Xu, Song, & Lu, 2018), ochrana pečene (Lee et al., 2004), protirakovinová (Ohno , Inoue, Ogihara a Saracoglu, 2002) a tak ďalej. Avšak ochranné účinkyakteozidpri cukrovkepoškodenie obličieksú nejasné.

Diabetes je jednou z najrýchlejšie rastúcich globálnych zdravotných núdzových situácií 21. storočia. Odhaduje sa, že v roku 2019 má cukrovku 463 miliónov ľudí a predpokladá sa, že tento počet dosiahne 578 miliónov do roku 2030 a 700 miliónov do roku 2045. Globálna prevalencia cukrovky rýchlo rastie, najmä v rozvojovom svete, a prevalencia cukrovkyochorenie obličiek(DKD) a koncová fázaobličkové ochorenie(ESRD) naďalej stúpa (Hu, 2011). DKD je jednou z najobávanejších diabetických chronických mikrovaskulárnych komplikácií a hlavnou príčinou ESRD. Úmrtnosť zo všetkých príčin u jedincov s DKD je približne 30-krát vyššia ako u diabetických pacientov bez nefropatie. Nedávne štúdie to naznačujúobličkovétubulárny epiteliálno-mezenchymálny prechod (EMT) a akumulácia extracytoplazmatickej matrice (ECM) vobličkovéinterstitium hrá kľúčové faktory v patogenéze DKD (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Čoraz viac štúdií uvádza, že progresiaobličkovéfibróza pri diabetickej nefropatii bola sprostredkovaná mnohými signálnymi dráhami. TGF- sa považuje za kľúčový patogénny faktor vo väčšine typov CKD spojených s fibrózou, vrátane DKD (Lv & Zhang, 2019). Heteromérny signálny komplex, ktorý je výsledkom väzby TGF- 1 na receptor typu II a následne na receptor typu I, prenáša signály prostredníctvom receptorom regulovaných Smad (Smad2/3) a spoločného partnera Smad (Smad4), čo vedie k transkripčnú reguláciu cieľových génov (Sierra et al., 2015). Akumulácia ROS môže viesť k oxidačnému stresu v bunke, čo vedie k poškodeniu bunkových komponentov vrátane proteínu a DNA. V konečnom dôsledku oxidačný stres vedie kobličkovéfibróza a poklesfunkcie obličiek. NADPH oxidázy (NOX) sú akceptované ako hlavné zdroje tvorby ROS pri diabetickej a chronickej nefropatiiochorenie obličiek. Up-regulácia a hyperaktivácia NOX tiež pravdepodobne prispievajú k oxidačnému stresu v patofyziologických štádiách. Nadmorská výškaobličkovéHladina ROS prostredníctvom aktivácie NOX sprostredkovanej hyperglykémiou vedie k oxidačnému stresu, ktorý vyvoláva poškodenieobličkové tkanivá, čo spôsobuje DKD (Lee, An, Kim a Bae, 2020).

Metabolomika je nová a dôležitá omická technológia pre kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu všetkých malých molekulárnych metabolitov v živých bunkách, tkanivách a telesných tekutinách. Ako nová disciplína na identifikáciu celkových metabolických zmien živých organizmov poskytuje metabolomika nové pohľady na štúdium diabetu a diabetických komplikácií (Lu, Xie, Jia, & Jia, 2013).

Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať ochranný účinok prírodného produktuakteozidna DKD diabetických samcov db/db myší a buniek HK{0}} indukovaných vysokou hladinou glukózy in vitro a jej mechanizmus. Takže v tejto štúdii boli na vyhodnotenie db/db myšiobličkovéochranné účinkyakteozida analyzovala sa regulácia rôznych metabolitov v sére, aby sa objasnili mechanizmyakteozid. Okrem toho in vitro model HK-2 indukovaný vysokou glukózou hodnotí účinnosťakteozidna db/db myšiach stanovením hladín expresie signálnej dráhy NADPH/oxidáza-TGF-/Smad.

2|MATERIÁLY A METÓDY

2,1|Chemikálie a nástroje

Acetonitril kvality UPLC bol zakúpený od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko); kyselina mravčia bola zakúpená od Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).akteozid(Čistota väčšia alebo rovná 98 percent) bola zakúpená od Národného inštitútu pre kontrolu potravín a liečiv (Peking, Čína). Štruktúraakteozidje znázornené na obrázku 1A. Reagenčná súprava močovinového dusíka (BUN) v sére, reagenčná súprava pre aspartátaminotransferázu (GOT), reagenčná súprava alanínaminotransferázy (GPT), reagenčná súprava na celkový cholesterol (TCHO), reagenčná súprava na triglyceridy (TG), reagenčná súprava na kreatinín v sére (Scr), močový mikroalbumín (mALB) reagenčná súprava a inzulínová (INS) reagenčná súprava boli zakúpené od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Tablety hydrochloridu metformínu boli zakúpené od Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartan bol zakúpený od Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. DMEM a F12 boli zakúpené od GIBCO, Amerika; NOX1 (katalógové číslo: ab121009), NOX2 (katalógové číslo: ab129068), NOX4 (katalógové číslo: ab154244) a Smad7 (katalógové číslo: ab216428) prvá protilátka bola zakúpená od Abcam (Cambridge, Spojené kráľovstvo). -SMA (katalógové číslo: 19245), E-cadherin (katalógové číslo: 3195), NF-κB p65 (katalógové číslo: 8242), TGF- 1 (katalógové číslo: 3711), Smad2 (katalógové číslo: 5339) Smad3 (katalógové číslo: 9523), Smad4 (katalógové číslo: 46535) a prvá protilátka PSmad2/3 (katalógové číslo: 8828) boli zakúpené od CST. Všetky ostatné chemikálie a činidlá použité v tejto štúdii boli analytickej kvality a vyrobené v Číne.

Waters Acquity™ Ultra Performance LC systém (Waters) vybavený spektrometrom Quattro Micro MS a Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). Deionizovaná voda sa čistila na systéme Milli-Q (Millipore, Bedford, Massachusetts). Na analýzu údajov bola prijatá pracovná stanica Mass Lynx v4.1 a bola použitá ultra-vysokorýchlostná centrifúga pri nízkej teplote (Thermo Scientific, Spojené kráľovstvo) a mikroskop DMI3000M (Leica, Nemecko).

2,2|Experimentálne podmienky na zvieratách

Všetky experimentálne postupy a protokoly použité v tejto štúdii boli preskúmané a schválené Inštitucionálnym výborom pre etiku zvierat Nanjingskej univerzity čínskej medicíny (Nanjing, Čína). Protokoly opísané v tejto štúdii boli v súlade s inštitucionálnymi usmerneniami pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat. Myši boli zakúpené od Výskumného centra zvieracích modelov Univerzity Nanjing (certifikát č. Su 2015–0001). Všetky experimenty sa uskutočňovali s 8-týždňovými samcami myší db/db a vekovo zodpovedajúcimi db/m súrodencami myší divokého typu s počiatočnou telesnou hmotnosťou 30 40 g. Model diabetickej myši db/db je medzinárodne uznávaný zvierací model diabetu. Štúdie ukázali, že mechanizmus DKD u db/db myší je podobný ako u ľudí. Zvieratá boli umiestnené v klietkach s konštantnou vlhkosťou (asi 60 percent ± 2 percentá) a teplotou (asi 23 ± 2 stupne) as cyklom svetlo/tma 12 hodín. Zvieratá prechádzali adaptačným obdobím 3 týždňov, počas ktorých mali neobmedzený prístup k potrave a vode z vodovodu. Po aklimatizačnom období boli db/db myši náhodne rozdelené do štyroch skupín so šiestimi v každej skupine: modelová skupina (normálny fyziologický roztok, M), skupina s metformínom (250 mg kg^-1 d^-1, EJSG), irbesartanová skupina (50 mg kg^-1 d^-1, EBST),akteozidskupina (70 mg kg^-1 d^-1, MRHTG), raz denne (Gao, Peng, Huo, Liu a Yan, 2015). Okrem toho boli v tejto štúdii metformín a irbesartan vybrané ako pozitívne kontrolné liečivá. Bolo hlásené, že irbesartan môže znižovať krvný tlak, hladinu lipidov v krvi aobličkový lipid.Nemá žiadny vplyv na hladinu glukózy v krvi a pečeňové lipidy. Môže zlepšiť funkciu a patologické zmenyobličkydb/db myší. Ochranný účinok metformínu naobličkysa odráža v znížení proteinúrie u diabetických potkanov a pacientov s diabetom 2. typu. Dávka metformínu a irbesartanu pre zvieratá sa extrapolovala z dennej dávky pre ľudí pomocou metódy normalizácie plochy povrchu tela. Potom sa myšiam podával zodpovedajúci liek raz denne výplachom žalúdka počas 6 týždňov a myši db/m sa použili ako kontrolná skupina, ktorým sa v rovnakom čase podával rovnaký objem fyziologického roztoku.

2,3|Zbierka vzoriek

Počas experimentálneho obdobia sa telesná hmotnosť a hladiny glukózy v krvi nalačno (FBG) zaznamenávali týždenne, hladiny FBG sa merali systémom monitorovania glukózy v krvi One Touch Ultra II (Life Scan, Milpitas, Kalifornia) chvostovou žilou každý pondelok (o 8:00 hod. ). Po 6 týždňoch podávania boli myši nalačno v metabolických klietkach s voľným prístupom k vode na zber moču počas 24 hodín. Všetky vzorky moču boli ihneď po odbere centrifugované pri 3000 ot./min. počas 10 minút a supernatanty boli oddelené a uskladnené pri -80 stupni až do analýzy. Na konci štúdie sa myši usmrtili pod anestéziou 10 percentným chloralhydrátom (3 mg/kg) a odobrala sa krv na koncentráciu biochemických parametrov a štúdiu metabolomiky. Potom sa vzorky krvi centrifugovali pri 3000 otáčkach za minútu počas 10 minút a vzorky séra sa oddelili a skladovali pri -80 stupni až do analýzy. Pravá oblička bola odstránená s jedným kusom fixovaným 10 percentným neutrálnym pufrovaným formalínom na histologické vyšetrenie. Theobličkovékôra bola izolovaná z druhého kusu a zmrazená v tekutom dusíku na western blot.

Cistanche na liečbu zlyhania obličiek

2,4|Bunková kultúra a liečba

Ľudská RTEC línia HK{{0}} bola získaná od Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Kompletné médium bolo nízkoglukózové DMEM s 10 percentami FBS a 1 percentami roztoku penicilín-streptomycín. Bunky HK-2 boli kultivované pri 37 stupňoch, 5 percentách CO2 a nasýtenej vlhkosti. Bunky sa subkultivovali pri 80-percentnej konfluencii, ktorá sa odstránila z inkubátora a pôvodné médium v ​​miske sa vyhodilo. Bunky sa premyli s použitím 0,5 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrom (PBS) a štiepili sa pôsobením 0,5 ml trypsínu počas 1 až 2 minút pri 37 stupňoch. Štiepenie sa ukončilo použitím 2 ml média DMEM a bunková suspenzia sa následne centrifugovala pri 450 g počas 5 minút pri 4 °C. Supernatant sa odstránil a bunky sa resuspendovali v 2 ml zodpovedajúceho média DMEM, čím sa získala jednobunková suspenzia. Bunky sa naočkovali do rôznych misiek/mikroplatní pri rôznych hustotách na následné experimentovanie, ako je opísané nižšie. Bunky HK-2 boli nanesené na 96-jamkové platne a misky, vopred ošetrené DMEM s nízkym obsahom glukózy (5 mmol/l), inkubované pri 37 °C a 5 percentách CO₂6 hodín a potom boli synchronizované. Experimentálne skupiny boli rozdelené nasledovne: kontrolná skupina (C), bez intervenčného faktora; modelová skupina (M), v ktorej boli bunky kultivované v roztoku DMEM s vysokým obsahom glukózy (30 mmol/l); skupina kontrolujúca osmotický tlak (DMEM plus 24,5 mmol/l manitolu, GLC); irbesartanová skupina (25 mmol/l) aakteozid(MRHTG) v piatich dávkach (5, 10, 25, 50 a 100 μmol/l).

2,5|Morfológia buniek

Bunky HK{0}} sa dvakrát premyli PBS a prezreli sa pod inverzným mikroskopom (OLYMPUS IX51). Morfológia buniek bola pozorovaná pri 100-násobnom zväčšení.

2,6|Meranie biochemických indikátorov

Terapeutická účinnosťakteozidna db/db myšiach sa hodnotili hladiny mALB v moči a FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT a BUN v sére, ktoré boli detegované nasledované popisom dodaným výrobcom súpravy.

2,7|Patologická analýza

Časťobličkovékortexu sa uskutočnilo farbenie hematoxylín-eozín (HE) a kyselina jodistá-Schiff (PAS) s cieľom pozorovať patologické zmeny vobličkové tkanivo, stupne fibróznej tkanivovej hyperplázie, štruktúry glomerulov a tubulov cez elektrónový mikroskop (400). Pri fotografovaní sa snažte vyplniť celé zorné poleobličkové tkanivoaby sa zabezpečilo, že pozadie každej fotografie bude rovnaké. Softvér Image-Pro Plus 6.0 bol použitý na výber rovnakej červeno-fialovej farby ako jednotného kritéria na hodnotenie kladnosti všetkých fotografií. Analýzou každej fotografie sa získala akumulovaná optická hustota (IOD) pozitívnej expresie bazálnej membrány a plocha pixelov glomerulárneho vaskulárneho plexu (AREA) a vypočítala sa priemerná optická hustota (IOD/AREA).

2,8|Western blotting

Obličkové tkanivoa bunky sa extrahovali lyzačným pufrom; lyzáty sa odstredili. Po úplnej pyrolýze odstreďujte 5 minút pri 12 000 ot./min. a odoberte supernatant a supernatanty sa zhromaždili. Na stanovenie koncentrácie proteínu sa použila súprava na koncentráciu proteínu kyseliny bicinchonovej (BCA). Po kvantifikácii sa proteín rozdelil pomocou 10% SDS-PAGE, preniesol sa na PVDF membrány, potom sa blokoval v 5% BSA v TBST a inkuboval sa s primárnymi protilátkami, po ktorých nasledovali zodpovedajúce sekundárne protilátky. Reaktivita protilátky sa potom detegovala pomocou ECL a kvantifikovala sa softvérom ImageJ.Obličkové tkanivávzorky sa analyzovali westernovým prenosom na detekciu hladín expresie -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500 proteíny Smad4 (1:1000) a Smad7 (1:1000).

2,9|ELISA analýza

Sekrécia monocytového chemoatraktantu proteínu -1 (MCP-1), interleukínu –1 (IL-1), tumor nekrotizujúceho faktora- (TNF-) a interleukínu-6 (IL -6) v supernatante každej bunky sa merali pomocou súpravy ELISA.

2,10|PCR v reálnom čase

Okrem toho boli tieto bunky pripravené na PCR v reálnom čase na preskúmanie hladín expresie NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-kadherínu, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 a Smad7 mRNA. Bunky v každej skupine (približne 1 107 buniek) sa zhromaždili. Celková RNA sa extrahovala podľa Trizolovej jednostupňovej metódy a stanovila sa jej čistota a koncentrácia. S GAPDH ako internou referenciou bola sekvencia priméru nasledujúca. TGF- 1, sense primer: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, antisense primer: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3;E-kadherín, sense primer: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, antisense primer: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, sense primer: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, antisense primer: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, sense primer: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, antisense primer: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, sense primer: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, antisense primer: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, sense primer: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, antisense primer: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, sense primer: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, antisense primer: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, sense primer: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, antisense primer: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, sense primer: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, antisense primer: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, sense primer: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, antisense primer: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, sense primer: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, antisense primer: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, sense primer: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, antisense primer: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.

2.11|Štatistická analýza

Údaje a štatistické analýzy sú v súlade s odporúčaniami pre experimentálny dizajn a analýzu vo farmakológii. Všetky experimenty boli randomizované a zaslepené. Výsledky sú vyjadrené ako M ± SD/SEM uvedeného počtu (n) nezávislých experimentov. Údaje v súčasnej štúdii sú prezentované ako M ± SD/SEM z aspoň troch nezávislých experimentov. Významnosť rozdielov bola analyzovaná jednosmernou ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho test (viac ako dve skupiny) alebo Studentov t-test (dve skupiny). Post hoc testy sa vykonávajú iba vtedy, keď F dosiahol p < .{6}}5="" a="" nezistila="" sa="" žiadna="" významná="" nehomogenita="" rozptylu.="" všetky="" testy="" boli="" obojstranné="" a="" p="">< 0,05="" sa="" považovalo="" za="" štatisticky="" významné.="" štatistická="" analýza="" sa="" uskutočnila="" pomocou="" softvéru="" graphpad="" prism="">

Akteozid Cistanche na zlepšenie funkcie obličiek

2,12|Podmienky UPLC-QTOF/MS a analýza údajov

Všetky vzorky séra boli pred prípravou rozmrazené pri teplote miestnosti. 300 ul acetonitrilu sa pridali do 100 ul vzoriek séra k vyzrážanému proteínu a intenzívne sa miešali 60 s. Všetky vzorky sa centrifugovali pri 13 000 ot./min. počas 10 minút pri 4 stupňoch. Nakoniec sa supernatant vstrekol do analýzy UPLC-QTOF/MS. Separácia metabolitov sa uskutočnila pomocou systému Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) vybaveného zariadením Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). Alikvotná časť 2 ul roztoku vzorky sa vstrekla na Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2,1 mm, 1,7 um, Waters Corporation, Milford, Connecticut) pri 35 stupňoch a prietoková rýchlosť bola 0,4 ml/min. Optimálna mobilná fáza pozostávala z vody (A) (obsahujúcej 0,1 percenta kyseliny mravčej) a acetonitrilu (B). Optimalizované UPLC elučné podmienky pre analýzu séra boli 0 3 min, 95 percent 55 percent A; 4 13 min, 55 percent 5 percent A; 13 14 min, 5 percent A. Autosampler bol udržiavaný na 4 stupňoch.

Hmotnostná spektrometria sa uskutočňovala pomocou Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), kvadrupólu a tandemového hmotnostného trometra s ortogonálnym zrýchlením. Leucín-enkefalín sa použil ako zámková hmota vytvárajúca [M plus H]^plusión (m/z 556,2771) a [MH]^-ión (m/z 554,2615) v pozitívnom a negatívnom režime. Koncentrácia leucín-enkefalínu bola 200 pg/ml a rýchlosť prietoku infúzie bola 100 ul/min, aby sa zabezpečila presnosť počas analýzy MS pomocou injekčnej pumpy. Údaje sa zbierali v režime ťažiska od 100 do 1,000 m/z. Pre pozitívny aj negatívny elektrosprejový režim bolo napätie kapiláry a kužeľa nastavené na 3,0 kV a 30 V, v danom poradí. Desolvatačný plyn bol nastavený na 600 l/h pri teplote 350 stupňov, kužeľový plyn bol nastavený na 50 l/h a teplota zdroja bola nastavená na 120 stupňov. Rýchlosť získavania údajov bola nastavená na 30 ms s oneskorením medzi skenmi 0,02 s.

Okrem toho sa z každej skupiny náhodne vybralo 10 vzoriek séra, ktoré sa zmiešali ako vzorky na kontrolu kvality (QC). Vzorka QC sa použila na optimalizáciu stavu UPLCQTOF/MS, pretože obsahovala väčšinu informácií z celej vzorky. Vzorky QC boli vstreknuté šesťkrát na začiatku behu, aby sa systém upravil alebo ekvilibroval, a potom každých 10 vzoriek, aby sa ďalej monitorovala stabilita analýzy. Každý deň, po kalibrácii prístroja, sa najprv analyzovala QC vzorka, aby sa otestovala stabilita prístroja, aby sa zabezpečil konzistentný výkon systému.

Všetky získavanie údajov a analýzy údajov boli riadené softvérom Waters MassLynx v4.1. Viacrozmerná dátová matica bola analyzovaná softvérom EZinfo 2.0 (Waters Corp.). Medzi hlavné parametre patrí rozsah doby uchovávania 0 14 min; hmotnostný pomer m/z 100 1,000, rozsah tolerancie hmotnosti 0.{{10}}1 Da, prah maximálnej intenzity 50, okno kvality 0,05 Da, retencia časové okná 0,20 min a automatická detekcia 5 percent výšky špičky a šumu. Intenzita každého iónu sa normalizovala vzhľadom na celkový počet iónov, aby sa vytvorila dátová matica, ktorá pozostávala z retenčného času, hodnoty m/z a normalizovanej plochy píku.

Výsledné dátové matice boli zavedené do softvéru EZinfo 2.0 na analýzu hlavných komponentov, čiastočnú diskriminačnú analýzu najmenších štvorcov (PLS-DA) a analýzu ortogonálnej projekcie na latentné štruktúry (OPLS-DA). Z OPLS-DA bolo možné identifikovať rôzne metabolity, ktoré sú zodpovedné za oddelenie medzi kontrolnou skupinou a modelovou skupinou, a preto sa považovali za potenciálne markery. Potenciálne markery záujmu boli extrahované z S-grafov vytvorených po analýze s OPLS-DA a premenné, ktoré významne prispeli k diskriminácii medzi skupinami, boli podrobené ďalšej identifikácii molekulového vzorca.

Dôležitosť premennej (VIP) v hodnote projekcie je vážený súčet štvorcov váh PLS a premenné s VIP > 1 sa považovali za ovplyvňujúce pri separácii vzoriek v grafoch skóre generovaných z analýzy OPLS-DA. Vo všetkých experimentoch bola úroveň spoľahlivosti nastavená na 95 percent, aby sa určila významnosť rozdielu (p <.{10}}5). tieto="" premenné="" boli="" nakoniec="" vybrané="" ako="" potenciálne="" biomarkery.="" grafy="" skóre="" pls-da="" boli="" opísané="" parametrom="" krížovej="" validácie="" r2y="" a="" q2,="" ktorý="" predstavuje="" celkovú="" vysvetlenú="" variáciu="" pre="" maticu="" x="" a="" predvídateľnosť="" modelu.="" vynikajúce="" modely="" sa="" získajú,="" keď="" sú="" kumulatívne="" hodnoty="" r2y="" a="" q2="" vyššie="" ako="" 0,8.="" relatívne="" vzdialenosti="" medzi="" podávanými="" skupinami="" a="" kontrolnou="" skupinou="" z="" grafu="" skóre="" pls-da="" sa="" vypočítali="" s="" priemernou="" hodnotou="" (os="" x="" a="" os="" y)="" všetkých="" vzoriek="" kontrolnej="" skupiny="" ako="" referenčný="">

Vybrané potenciálne metabolity sa identifikovali podľa určenia presného m/z, retenčného času a typického fragmentu MS/MS a vzoru potenciálnych biomarkerov vyššie, ktoré sa získali v pozitívnom a negatívnom iónovom móde. Konštrukcia metabolickej dráhy bola vykonaná pomocou Metabo Analyst, čo je webový nástroj na vizualizáciu metabolomiky (https://www. metaboanalyst.ca/) na základe databázových zdrojov vrátane KEGG (HTTP:// www.genome .jp/kegg/) a databázy HMDB (http://www.hmdb. ca/) na vyhľadávanie. Retenčný čas a typický fragment a vzor MS/MS mali veľký význam na zúženie rozsahu možných molekúl.

Akteozid v Cistanche môže zlepšiť funkciu obličiek

3|VÝSLEDKY

Kliknutím sem získate informácie o časti II (výsledky) tohto článku.

Výňatok z: ' Prírodný produkt zakteozidzlepšiťpoškodenie obličieku diabetických db/db myší a buniek HK-2 prostredníctvom regulácie signálnej dráhy NADPH/oxidáza-TGF-/Smad' -----od Qinwen Wang|Xinxin Dai a kol

----Fytoterapeutický výskum. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196