Časť 1 Akteozid potláča osteoklastogenézu sprostredkovanú RANKL inhibíciou indukcie C-Fos a dráhy NF-kB a oslabením produkcie ROS

Časť 1 Ako akteozidy podporujú rast kostí?

Ďalšie informácie:{0}}

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Výskumný ústav klinickej medicíny Národnej univerzity v Chonbuku, Ústav biomedicínskeho výskumu Národnej univerzity v Chonbuku Nemocnica, Jeonju, Chonbuk, Južná Kórea, 2 Katedra ortodoncie, Ústav orálnych biologických vied a Škola zubného lekárstva, Národná univerzita Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Južná Kórea, 3 Katedra vied o bioaktívnych materiáloch, Výskumné centrum bioaktívnych materiálov, Národná univerzita Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Južná Kórea

Abstraktné

Početné štúdie uvádzajú, že zápalové cytokíny sú dôležitými mediátormi pre osteoklastogenézu, čím spôsobujú nadmernú kostnú resorpciu a osteoporózu.akteozid, hlavná aktívna zlúčenina Rehmannia glutinosa, ktorá je široko používaná v tradičnej orientálnej medicíne, má protizápalový a antioxidačný potenciál. V tejto štúdii sme zistili, že strana CTE výrazne inhibovala diferenciáciu a tvorbu osteoklastov z makrofágov kostnej drene (BMM) a makrofágov RAW264.7 stimulovaných receptorovým aktivátorom ligandu jadrového faktora-kappaB (NF-kB) (RANKL). Predbežná liečba akteozidmi tiež zabránila kostnej resorpcii zrelými osteoklastmi spôsobom závislým od dávky. Akteozid (10 mM) zoslabil RANKL-stimulovanú aktiváciu p38 kinázy, extracelulárny signál regulované kinázy a c-Jun N-terminálnu kinázu a tiež potlačil aktiváciu NF-kB inhibíciou fosforylácie podjednotky p65 a inhibítora kBa. Okrem toho RANKL sprostredkované zvýšenie expresie c-Fos a jadrového faktora aktivovaných T-buniek, cytoplazmatického 1 (NFATc1) a produkcie tumor nekrotizujúceho faktora-a, interleukínu (IL)-1b a IL-6 boli zjavne inhibované predbežnou liečbou akteozidmi. Ďalej orálny akteozid znížil stratu kostnej hmoty vyvolanú ovariektómiou a produkciu zápalových cytokínov na kontrolné hladiny. Naše údaje tomu nasvedčujúakteozidinhibuje diferenciáciu a dozrievanie osteoklastov z osteoklastických prekurzorov potlačením aktivácie mitogénom aktivovaných proteínkináz a transkripčných faktorov, ako sú NF-kB, c-Fos a NFATc1 indukovanej RANKL. Súhrnne tieto výsledky naznačujú, žeakteozidmôže pôsobiť ako antiresorpčné činidlo na zníženie úbytku kostnej hmoty blokovaním aktivácie osteoklastov.

Ak chcete získať ďalšie informácie, kontaktujte:{0}}

Kliknite na produkty Cistanche účinky

Úvod

Kosť je neustále remodelovaná vyváženou aktivitou osteoklastov a osteoblastov [1]. Osteoklasty vznikajú z hematopoetických prekurzorových buniek monocytovej/makrofágovej línie, zatiaľ čo osteoblasty sú mezenchymálnej línie [2]. Abnormálna aktivácia osteoklastov alebo znížená osteoblastogenéza môžu narušiť kostnú homeostázu, prípadne spôsobiť ochorenia, ako je osteoporóza, artritída a rakovina kostí [3,4]. Osteoporóza je bežné ochorenie kostí, ktoré vedie k zvýšenému riziku zlomenín. Najčastejšia forma osteoporózy je spôsobená nedostatkom estrogénu u žien v menopauze. Lieky ako kortikosteroidy a antiepileptiká môžu tiež spôsobiť nerovnováhu medzi resorpciou a tvorbou kostí, čo môže viesť k osteoporóze [5]. Na liečbu osteoporózy sa používa mnoho antiresorpčných inhibítorov vrátane bisfosfonátov, kalcitonínu, estrogénu a selektívnych modulátorov estrogénových receptorov. Tieto inhibítory udržujú kostnú hmotu inhibíciou funkcie osteoklastov [6]. Estrogénová substitučná liečba je najpopulárnejšou liečbou na prevenciu a liečbu postmenopauzálnej osteoporózy. Dlhodobá estrogénová substitučná liečba však môže zvýšiť riziko rakoviny endometria a prsníka. Preto mnohí výskumníci zamerali svoje úsilie na vývoj nového antiresorpčného činidla, ktoré nemá vedľajšie účinky [7–10]. Pretože osteoklasty fungujú pri resorpcii kostí, špecifická inhibícia osteoklastov bola považovaná za hlavný cieľ v mnohých štúdiách. Osteoklasty sú viacjadrové obrovské bunky tvorené mononukleárnymi progenitormi z rodiny monocytov/makrofágov prostredníctvom sekvenčnej proliferácie, diferenciácie a fúzie hematopoetických prekurzorových buniek [11]. Faktor stimulujúci kolónie makrofágov (M-CSF) a receptorový aktivátor jadrového faktora (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) sú základnými faktormi diferenciácie osteoklastov[12]. Okrem toho niekoľko zápalových cytokínov, ako je tumor nekrotizujúci faktor (TNF) a interleukín (IL)-1b, prispieva k osteoklastogenéze moduláciou indukcie RANKL, osteoprotegerínu a M-CSF [7,13]. Väzba RANKL na bunkový povrchový RANK receptor vedie ku komplexom RANKL/RANK/TNFR asociovaných faktorov (TRAF), ktoré sekvenčne aktivujú NF-kB a mitogénom aktivované proteínkinázy (MAPK), vrátane c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK), p38 kináza a kináza súvisiaca s extracelulárnym signálom (ERK) [14]. Táto aktivácia hrá kľúčovú úlohu pri sprostredkovaní diferenciácie, aktivácie a prežitia osteoklastov. RANKL tiež aktivuje expresiu transkripčných faktorov, ako je nukleárny faktor aktivovaných T-buniek, cytoplazmatický 1 (NFATc1) a-Fos, ktoré sú nevyhnutné pre vývoj osteoklastov [ 7,9]. Preto sa signalizácia RANKL považuje za hlavný cieľ antiresorpčných činidiel, ktoré potláčajú aktiváciu osteoklastov a stratu kostnej hmoty.

akteozidje hlavnou účinnou látkou Rehmannia glutinosa, ktorá je široko používaná v tradičnej orientálnej medicíne [15,16]. Akteozid je silný antioxidant a má antihepatotoxické, protizápalové a antinociceptívne účinky [17–20]. Predtým sme to zistiliakteozidznižuje aktivitu tyrozinázy a biosyntézu melanínu reguláciou signalizácie ERK [21], chráni pred poškodením ďasien sprostredkovaným reaktívnymi druhmi kyslíka (ROS)[22] a potláča poškodenie buniek sprostredkované mykotoxínmi [23]. Tieto účinky spolu úzko súvisiaakteozidovschopnosť odstraňovať ROS a regulovať signalizáciu sprostredkovanú MAPK. Najmä sa navrhuje, aby ROS sprostredkovali RANKL-indukované signálne dráhy a bunkové udalosti v osteoklastoch. Predbežná liečba antioxidantmi inhibovala RANKL-indukovanú aktiváciu NF-kB, ERK a IkBa, čím sa potlačila osteoklastogenéza [24]. Tieto zistenia silne naznačujú, že okrem protizápalovej aktivity je pre antiresorpčnú látku rozhodujúca aj antioxidačná aktivita, tedaakteozidmôže potlačiť RANKL-indukovanú osteoklastogenézu.

V tejto štúdii sme skúmali, čiakteozidmá terapeutický účinok na úbytok kostnej hmoty. Preskúmali sme účinkyakteozidna diferenciáciu osteoklastov a kostnú resorpciu a súvisiace bunkové mechanizmy s použitím in vitro a in vivo experimentálnych systémov.

Materiály a metódy

Etické vyhlásenie

Postupy starostlivosti o zvieratá a ich používania boli schválené Výborom pre etiku v starostlivosti a používaní laboratórnych zvierat ChonbukNational University (Povolenie č. CBU 2010-0007). Všetky experimenty v tejto štúdii sa uskutočňovali podľa smerníc Výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na univerzite.

Myši, chemikálie a laboratórne potreby

Štvortýždňové samice myší ICR boli zakúpené od OrientBio Inc. (Seoul, Kórea) a umiestnené pri 2261 uC a 5565 percentách vlhkosti v 12-hodinovom cykle svetlo/tma s voľným prístupom k potrave a vode. Akteozid (3,4-dihydroxy-b-fenetyl-Oa-ramnopyranóza-Syl-(1R3)-4-O-kafeoyl-bD-glukopyranozid; C29H36O15) (obr. S1) bol izolovaný z listov Rehmannia glutinosa. Akteozid sa pred použitím rozpustil vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 a M-CSF boli zakúpené od R & D systems (Minneapolis, MN, USA). Protilátky špecifické pre c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATcl, IkBa, p-IkBa a b-aktín boli získané od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Protilátky pre p-p38 a p38 boli zakúpené od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Súpravy Calcium Assay a Osteocalcin (OC) EIA Kit boli zakúpené od BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) a Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), v danom poradí, na stanovenie biochemických parametrov séra. Na meranie hladiny TRAP5b v sére sa použila aj súprava myšieho tartrát-rezistentnej kyslej fosfatázy (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). Pokiaľ nie je uvedené inak, ďalšie chemikálie boli získané od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) a laboratórny tovar bol od SPL Life Sciences (Pochun, Južná Kórea).

Bunkové kultúry

Bunky kostnej drene sa získali z holennej kosti a stehennej kosti 6 týždňov starých samíc myší ICR podľa metód opísaných vyššie [25]. Suspenzia kostnej drene sa inkubovala v 100-mm kultivačnej miske v prítomnosti 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dňoch sa adherentné bunky použili ako makrofágy kostnej drene (BMM) na vyvolanie osteoklastickej diferenciácie. Niektoré bunky kostnej drene sa tiež inkubovali 48 hodín bez M-CSF a adherentné bunky sa kultivovali v médiu na diferenciáciu osteoblastov, ako je opísané inde [25]. Makrofágové bunky RAW264.7 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra (FBS), 2 mM L-glutamínu a antibiotikami. Tieto bunky sa použili ako náprotivná bunková línia pre BMM na preskúmanie účinku akteozidu na osteoklastogenézu.

Osteoklastická diferenciácia a farbenie TRAP

BMM boli vopred ošetrené rôznymi koncentráciami (0-50 mM) akteozidu počas 2 hodín pred stimuláciou 100 ng/ml RANKL. Kultivačné médium bolo nahradené čerstvým médiom na 2. a 5. deň. Po 7 dňoch inkubácie boli kultúry fixované v 4% PBS-pufrovanom paraformaldehyde a zafarbené TRAP s použitím sigma Aldrich kit podľa inštrukcií výrobcu. TRAP-pozitívne bunky sa spočítali pomocou optickej mikroskopie a bunky obsahujúce 3 alebo viac jadier sa považovali za osteoklasty. Bunky RAW 264.7 boli tiež vystavené 100 ng/ml RANKL po predbežnom ošetrení akteozidom počas 2 hodín a po 7 dňoch inkubácie, bunky boli spracované na farbenie TRAP.

Meranie životaschopnosti buniek

Životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou činidla vo vode rozpustnej tetrazóliovej soli (WST)-8. Stručne povedané, bunky BMM alebo RAW264.7 kultivované v rastovom médiu obsahujúcom 10 percent FBS a antibiotiká boli ošetrené 10 mM akteozidom alebo fenolovou zlúčeninou, ako je kvercetín, luteolín, apigenín alebo epigalokatechín-3-galát (EGCG). Činidlo WST-8 bolo pridané do kultúr po 48 hodinách inkubácie. Po inkubácii počas ďalších 4 hodín sa merala špecifická absorbancia WST{10}} pri 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Test kostnej resorpcie

BMM (16105 buniek/ml) sa suspendovali v a-MEM obsahujúcom 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL, potom sa rozdelili na 24-jamkovú platňu potiahnutú nanokryštálmi fosforečnanu vápenatého (OAAS{6} Substrát pre test aktivity osteoklastov, Oscotec Inc., Choongnam, Južná Kórea) pri hustote 26 104 buniek/cm2 s a bez akteozidu. Po inkubácii počas 7 dní boli bunky odstránené z platní s 5 % chlórnanom sodným a informácie boli pozorované pod optickým mikroskopom. Resorbovaná plocha bola tiež meraná obrazovým analyzátorom a vyjadrená ako percento kontrolnej hodnoty.

Western Blot analýza

Celé proteínové lyzáty boli pripravené v lyzovacom pufri, ako je opísané inde [26]. Cytosolické a jadrové proteíny boli pripravené tak, ako bolo opísané vyššie [25]. Rovnaké množstvá proteínového extraktu boli oddelené 12-15 percentami SDS-PAGE a blotované na polyvinyldifluoridové membrány. Bloty sa sondovali s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 uC a potom sa inkubovali so sekundárnou protilátkou v blokovacom pufri počas 1 hodiny. Bloty boli vyvinuté so zvýšenou chemiluminiscenciou (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) a exponované na rôntgenový film (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

Test aktivity MAPK

Bunky boli vopred ošetrené akteozidom počas 2 hodín a potom stimulované RANKL počas ďalšej -30 minúty. Aktivity MAPK sa stanovili pomocou imunometrických testovacích súprav, ako je súprava na testovanie p-p38kinázy (Assay Designs, Inc., MI, USA), súprava na enzýmový test p-ERK (Assay Designs) a sendvičová súprava ELISA p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, MA, USA). Všetky postupy sa riadili pokynmi výrobcu a absorbancia sa merala pomocou čítačky mikrodoštičiek.

Elektroforetický test posunu mobility (EMSA)

Väzbové reakcie DNA-proteín sa uskutočňovali 30 min pri izbovej teplote s 10–15 mg proteínu v 20 ml pufra obsahujúcom 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dl-dC), 5 percent glycerolu 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM oligonukleotidov značených [a-32P] dCTP a Klenowov fragment DNA polymerázy. Vzorky boli separované na 6-percentných polyakrylamidových géloch, ktoré boli vysušené a vystavené röntgenovému filmu (Eastman Kodak Co.) počas 12–24 hodín pri 270 uC. Oligonukleotidové primérové ​​sekvencie špecifické pre NF boli 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 a 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB luciferázový test

Makrofágy RAW264.7 v 24-jamkových doštičkách boli transfekované 0,8 mg kB-luciferázovým reportérovým vektorom s použitím 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. 24 hodín po transfekcii boli bunky stimulované RANKL v prítomnosti a neprítomnosti akteozidu počas 24 hodín. Bunky boli resuspendované v 100 ml reportérového lyzačného pufra (Promega, Madison, WI, USA). Rovnaké množstvá proteínových vzoriek sa umiestnili do 96-jamkových mikrodoštičiek a zmiešali sa s luciferázovým substrátom. Luminiscencia sa merala pomocou mikroplatňového luminometra (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemecko). V tomto experimente sa ako pozitívny kB inhibítor použil permeabilný NF-B inhibičný peptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).

Meranie cytokínov

Bunky BMM alebo RAW264.7 boli stimulované RANKL v prítomnostiakteozidv 24-jamkových kultivačných platniach. Po 48 hodinách inkubácie sa supernatanty kultúr odobrali a vyhodnotili pomocou testu ELISA s použitím súprav OptEIATM špecifických pre TNF-a, IL-1b- a IL-6- podľa pokynov výrobcu.

Reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (RT-PCR)

Expresia mRNA osteoklastických markerov, ako je c-Fos, NFATc1 a TNF-a, bola stanovená pomocou RT-PCR v reálnom čase. Stručne povedané, celková RNA bola extrahovaná z makrofágov pomocou Trizolreagent podľa pokynov výrobcu (Invitrogen). cDNA bola syntetizovaná s 1 mg celkovej RNA s použitím SuperScriptReverse Transcripatase II a primerov (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sa použil na detekciu akumulácie produktu PCR počas cyklovania so systémom detekcie sekvencie ABI 7500 (aplikované pomocou štyridsiatich 3-krokových cyklov denaturácie pri 95 uC po dobu 15 s, aneláciu pri 60 uC po dobu 1 s a predĺženie pri 72 uC po dobu 30 s. Všetky PCR reakcie sa uskutočnili aspoň trojmo a hladiny expresie sa normalizovali na prevádzkový génHPRT v rovnakej reakcii. V tejto štúdii sa použili rovnaké opísané sekvencie primérov inde [7].

Meranie intracelulárnych ROS

Zásobný roztok 29,79-dichlórdihydrofluoresceín-diacetátu (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Nemecko) bol pripravený v DMSO a uložený pri 220 uC v tme. Stručne povedané, BMM (106 buniek/ml v 6-jamkových doštičkách) sa kultivovali s 50 ng/MLM-CSF počas 24 hodín a potom sa ošetrili rôznymi koncentráciami (0–10 mM) akteozidu 2 hodiny pred stimuláciou 100 ng/mlRANKL. Po 1 hodine spoločnej inkubácie sa tieto bunky následne inkubovali s 25 mM DCFH-DA počas 30 minút. Zelená fluorescencia 29,79-dichlórfluoresceínu (DCF) bola zaznamenaná pri 515 nm (FL 1) pomocou systému FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) a 10000 udalostí boli spočítané na vzorku

Indukcia osteoporózy vyvolanej ovariektómiou

Na túto štúdiu sa použili samice myší ICR (vo veku 6 týždňov). Myši podstúpili simulovanú operáciu (Sham, n=10) alebo chirurgickú ovariektómiu (OVX, n=20) v anestézii. Jeden týždeň po chirurgickom zákroku boli OVX myši náhodne rozdelené do 2 skupín po 10 myšiach: bilaterálne OVX a bilaterálne OVX doplnené 200 ml PBS obsahujúceho 1 mM akteozid orálne (AC skupina). Ústneakteozidsa podávalo raz za 3 dni počas 8 týždňov po chirurgickom zákroku a rovnaké množstvo PBS sa podávalo skupinám Sham a OVX. Po 1 dni od posledného podania sa myši usmrtili a potom sa analyzovali biochemické parametre v sére a 3-rozmerná kostná štruktúra.

Stanovenie biochemických parametrov séra

Vzorky krvi sa odobrali srdcovou punkciou a sérum sa zozbieralo centrifugáciou. Vzorky séra sa skladovali pri 280 uC na analýzu biochemických parametrov. Sérové ​​hladiny IL-1b a IL-6 sa odhadli pomocou súpravy ELISA, ako je opísané vyššie, zatiaľ čo aktivita alkalickej fosfatázy (ALP) sa stanovila pomocou biochemického kolorimetrického testu, ktorý meria množstvo p -nitrofenol vyrobený z p-nitrofenolfosfátového substrátu, ako je opísané inde [27]. Na odhadnutie biomarkerov tvorby a resorpcie kostí sa tiež stanovili hladiny OC, vápnika a TRAP5b v sére podľa pokynov výrobcu.

Analýza štruktúry kostí a morfometrických parametrov

Stehenné kosti myší (Sham, OVX a AC skupiny) boli vypreparované a naplnené fyziologickým roztokom na mechanické testovanie. Mechanická pevnosť stehennej kosti sa merala tak, ako je opísané inde [28]. Zaťaženie zlomeniny bolo zaznamenané ako maximálna sila v newtonoch v bode zlomeniny strednej časti pravej stehennej kosti. Okrem toho sa svetlo stehenná kosť každého zvieraťa analyzovala histomorfometricky pomocou systému mikropočítačovej tomografie (mikro-CT) (mikrofokusový röntgenový systém SkyScan 1076, Kontich, Belgicko). Stručne povedané, kosti v sklade so 4 percentami formaldehydu boli povrchovo vysušené na papierovej tkanine pred zabalením do plastovej „priľnavej fólie“ alebo do parafilmu, aby sa zabránilo vysychaniu počas skenovania. Každá kosť obalená plastom sa umiestnila do trubíc z plastu/polystyrénovej peny, ktoré boli namontované vertikálne horizontálne vo vzorkovej komore skenera 1076 na mikro-CT zobrazovanie. Skenovanie sa uskutočnilo s použitím 100 kV zdrojového napätia a 140 mA zdrojového prúdu s rozlíšením 35 mm. Trojrozmerné modely trabekulárnych kostí stehennej kosti boli rekonštruované pomocou SkyScan CT Analyzer verzie 1.11. Štrukturálne parametre, ako je hustota trabekulárnej kosti (BMD, g/cm3), percentuálny objem kosti (objem kosti (BV)/objem tkaniva (TV), percentá), hrúbka (Tb.Th, mm), separácia (Tb.Sp Potom sa zmerali , mm) a počet (Tb.N, 1/mm).

Osteogénna diferenciačná a mineralizačná skúška

Bunky kostnej drene kultivované v 6-jamkových kultivačných platniach boli ošetrené DAG (10 nM dexametazón, 50 mM kyselina askorbová a 20 mM b-glycerofosfát) v prítomnosti 10 mMakteozid. Po 2 týždňoch diferenciácie boli bunky fixované ľadovo studeným 70 percentným (obj./obj.) etanolom počas 1 hodiny a zafarbené 0,2 percentami alizarínovej červenej Sin destilovanej vody počas 30 minút pri teplote miestnosti teplota. Potom, čo boli bunky odfarbené a vysušené na vzduchu, boli doštičky s bunkovou kultúrou hodnotené svetelnou mikroskopiou s použitím inverzného mikroskopu (Nikon TS100, Japonsko). Na kvantifikáciu množstva červeného farbiva sa farbivo eluovalo 10 percentným acetylpyridíniumchloridom trepaním počas 20 minút a absorbancia sa merala pri 560 nm. Množstvo vápnika uloženého v bunkových vrstvách sa tiež meralo pomocou súpravy Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonsko) podľa pokynov výrobcu. Okrem toho sa pomocou RT-PCR v reálnom čase stanovila expresia markerov mRNA špecifických pre kosti, ako je napríklad transkripčný faktor súvisiaci s runt{14}} (Runx2), osterix, kostný sialoproteín (BSP) a OC. Oligonukleotidové priméry týchto markerov boli navrhnuté s veľkosťou produktu menšou ako 200 bp pomocou PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems), ako je opísané inde[27].

Štatistická analýza

Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky údaje sú vyjadrené ako priemer 6 štandardnej odchýlky (SD) z 3 alebo viacerých nezávislých experimentov. Jednosmerná ANOVA sa použila na viacnásobné porovnania pomocou softvéru SPSS verzie 12.0. Hodnota p0.05 sa považovala za štatisticky významnú.

Výsledky

Akteozid inhibuje tvorbu osteoklastov makrofágmi spôsobom závislým od dávky

Aby sa overil účinok akteozidu na diferenciáciu BMM na osteoklasty, bunky sa kultivovali s rôznymi koncentráciami (0–20 mM) akteozidu počas 7 dní v prítomnosti 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL. Akteozid znižoval počet osteoklastov v závislosti od dávky. Keď boli bunky vopred ošetrené 10 mM akteozidom počas 2 hodín, počet osteoklastov sa znížil o 43 percent v porovnaní s bunkami doplnenými M-CSF a RANKL (obr. 1A). Obr. 1B ukazuje RANKL-sprostredkovanú diferenciáciu osteoklastov a ich inhibíciu kombinovanou liečbou s akteozidom. V súlade s týmto výsledkom predbežné ošetrenie akteozidmi znížilo RANKL-stimulovanú diferenciáciu buniek RAW264.7 a tvorbu osteoklastov (obr. 1C a D). Keď bol anti-osteoklastický potenciál akteozidu na BMM porovnaný s anti-osteoklastickým potenciálom niekoľkých fenolových zlúčenín v rovnakej koncentrácii (10 mM), luteolín vykazoval najvyššiu aktivitu (obr. 2A). Avšak samotný luteolín, kvercetín alebo apigenín znížili životaschopnosť buniek (obr. 2B). Všetky zlúčeniny inhibovali osteoklastickú diferenciáciu makrofágmi RAW264.7 s nasledujúcimi relatívnymi aktivitami: luteolín. kvercetín=apigenín .EGCG=akteozid (obr. 2C). Luteolín, kvercetín alebo samotný apigenín tiež vykazovali zníženú životaschopnosť buniek (obr. 2D). Na rozdiel od toho, liečba kvercetínom spôsobila iba významné zníženie životaschopnosti v bunkách BMM aj RAW264.7, keď boli tieto bunky vystavené 10 mM každej zlúčeniny počas 2 dní s 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, alebo oboje (údaje nie sú uvedené). Keď sa vyžaduje, aby koncentrácia týchto zlúčenín inhibovala 50 percent

tvorba osteoklastov v BMM (IC50) sa vypočítala pomocou kriviek koncentrácia-aktivita, IC50akteozidkvercetín, luteolín, apigenín a EGCG boli 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 a 6,6 mM, v tomto poradí (obr. 2E). Tento výsledok bol podobný prípadu, keď boli skúmané makrofágy RAW264.7. Tieto údaje naznačujú, že luteolín a kvercetín mali antiklastogénne účinky vyššie ako akteozid. Na rozdiel od toho, kvercetín pri IC50 mal tiež mierny toxický účinok na bunky (údaje nie sú uvedené).

Akteozid inhibuje kostnú resorpciu makrofágmi

Akteozid tiež zabránil resorpcii kostí sprostredkovanej RANKL spôsobom závislým od dávky, ako bolo merané in vitro modelovým systémom (obr. 3A). Kostná resorpcia bola významne inhibovaná, keď boli BMM inkubované s 1 mM akteozidom (obr. 3B). A 10 mMakteozidliečba takmer úplne oslabila informácie indukované RANKL prostredníctvom BMM. Podobne akteozid znížil kostnú resorpciu v bunkách RAW264.7 stimulovaných RANKL (obr. S2A a B). Schopnosť akteozidu inhibovať kostnú resorpciu závisela od načasovania liečby v porovnaní so stimuláciou RANKL. Akteozid (10 mM) pridaný 4 dni po stimulácii RANKL neznížil informácie v BMM, zatiaľ čo potlačil počet vytvorených osteoklastov (obr. 3C). Tento rozdielny výsledok bol čiastočne spôsobený oblasťou jamiek už vytvorenou po 4 dňoch tvorby stimulácie RANKL (obr. 3D).

Akteozid znižuje včasné signálne dráhy RANKL

RANKL indukuje aktiváciu 3 dobre známych MAPK a NF-kB v prekurzoroch osteoklastov a táto aktivácia je potrebná na skorú diferenciáciu osteoklastov. Aby sme pochopili možné mechanizmy, ktorými akteozid inhibuje osteoklastogenézu, skúmali sme účinokakteozidna MAPK a aktiváciu NF-B v makrofágoch. Bunky BMM a RAW264.7 boli vopred ošetrené 10 mM akteozidom počas 2 hodín a potom stimulované 100 ng / ml RANKL počas 30 minút. Fosforylácia MAPK sa skúmala Western blotom a imunometrickou analýzou. RANKL indukoval fosforyláciu p38, ERK a JNK inBMM (obr. 4A) a RAW264.7 buniek (obr. 4B). Akteozid zabránil týmto RANKL-indukovaným zvýšeniam p-p38, p-ERK a p-JNK. Tento výsledok bol podporený imunometrickou analýzou, ktorá bola predbežne ošetrená 10 mMakteozidvýznamne inhibovali hladiny fosforylovaných MAPK v týchto makrofágoch (obr. 4C). Ošetrenie RANKL zvýšilo DNA-viazanie NF-kB, zatiaľ čo akteozid inhiboval RANKL-indukovanú aktiváciu NF-kB-DNA väzby (obr. 5A). Táto inhibícia bola výraznejšia v BMM ako v bunkách RAW264.7. Akteozid tiež znížil fosforyláciu p65 a IkBa stimulovanú RANKL v bunkách BMM a RAW264.7 (obr. 5B a C). Pridanie 10 mMakteozidu takmer úplne inhibovalo degradáciu aj aktiváciu IkBa v BMM (obr. 5B). Aby sa ďalej potvrdilo, že aktivácia NF kB sa podieľa na pôsobení akteozidu, konštrukty promótor-luciferáza kB boli prechodne transfekované do buniek RAW264.7. Bunky inkubované so 100 ng/ml RANKL mali 3-krát vyššiu aktivitu kB promótora, ktorá bola významne oslabená 10 mM akteozidom (obr. 5D).

Akteozid potláča produkciu zápalových cytokínov a expresiu TNF-a, c-Fos a NFATc1 v RANKL-stimulovaných makrofágoch

TNF-a, IL-1b a IL-6 sú dôležité pri tvorbe a funkcii osteoklastov, ktorá je sprostredkovaná NF-kB signalizáciou v makrofágoch stimulovaných RANKL. RANKL stimuloval produkciu týchto cytokínov a táto produkcia bola výrazne znížená o 10 mMakteozidpredúprava v BMM (obr. 6A). Podobne akteozid zoslabil RANKL-indukovanú produkciu cytokínov, okrem IL -6, v makrofágoch RAW264.7 (obr. S3). Aby sme pochopili molekulárne mechanizmy účinku akteozidu pri osteoklastogenéze, ďalej sme skúmali účinok akteozidu na expresiu TNF-a, c-Fos a NFATc1. RANKL up-reguloval expresiu mRNA týchto faktorov v bunkách BMM a RAW264.7 (obr. 6B a C). Predbežné ošetrenie 10 mM akteozidom významne inhibovalo RANKL-indukovanú expresiu týchto faktorov v oboch

BMM a bunky RAW264.7. Predbežné ošetrenie akteozidom tiež výrazne znížilo hladiny proteínu c-Fos a NFATc1 v BMM stimulovaných RANKL (obr. 6D). Tieto výsledky naznačujú, že akteozid down-reguluje RANKL indukujúce mediátory tvorby osteoklastov na úrovni génov a proteínov.

Akteozid znižuje intracelulárnu tvorbu ROS v BMM spôsobom závislým od dávky, pretože je známe, že intracelulárna produkcia ROS koreluje s osteoklastogenézou stimulovanou RANKL, skúmali sme, či akteozid inhibuje produkciu ROS počas diferenciácie osteoklastov sprostredkovanej RANKL pomocou bunkovo ​​permeabilnej oxidácie citlivej na farbivo DCFH-DA. Analýza prietokovou cytometriou ukázala, že priemerný fluorescenčný signál špecifický pre DCF v BMM bol zjavne posunutý doprava po stimulácii RANKL v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami (obr. 7A). Tento posun bol podobný ako v prípade, že makrofágy RAW264.7 boli pozorované po stimulácii RANKL (údaje nie sú uvedené). Liečba BMM akteozidom znížila intenzitu signálu DCF spôsobom závislým od dávky. Predbežné ošetrenie 10 mM akteozidom takmer úplne znížilo hladiny intracelulárneho ROS produkovaného počas diferenciácie osteoklastov na neošetrené kontrolné hladiny (obr. 7B).

Perorálne podávanie akteozidu inhibuje zmenu osteoporotických biochemických markerov a úbytku kostnej hmoty u myší po ovariektómii

Aby sme preskúmali účinok akteozidu na stratu kostnej hmoty, pripravili sme osteoporotický zvierací model pomocou ovariektómie. Počas experimentálneho obdobia bol významný rozdiel v telesnej hmotnosti medzi OVX a Shammice (údaje nie sú uvedené). Skupina mala významne vyššie sérové ​​hladiny IL-1b a IL-6 ako skupina Sham (obr. 8). Ovariektómiou indukované zvýšenia týchto zápalových cytokínov boli oslabené perorálnym podávaním akteozidu (AC skupina). Sérové ​​hladiny markerov kostného obratu, ako je ALP, vápnik, TRAP5b a OC, boli významne zvýšené v skupine OVX. Z týchto osteoporotických markerov boli zvýšené hladiny vápnika, TRAP5b a OC u OVX myší zjavne inhibované liečbou akteozidmi, zatiaľ čo hladina ALP v sére sa liečbou nezmenila. Priemerné maximálne zaťaženie zlomeniny do stredu pravého diafýzu stehennej kosti bolo významne nižšie v skupine OVX ako v skupine Sham (obr. 9A). Liečba akteozidmi zvýšila maximálnu zálohu zlomenín na úroveň skupiny Sham. Keď sa vyrezala kortikálna kosť stehennej kosti a pozorovala sa optickou mikroskopiou, osteoporotické znaky ukázané v skupine OVX u AC myší takmer úplne zmizli (obr. 9B). Na overenie účinku akteozidu na model osteoporózy indukovanej OVX sa pomocou mikro-CT analyzovali BMD a kostné morfologické parametre v trabekulárnej časti ľahkého proximálneho femuru. Ako je znázornené na obr. 9C, u OVX myší bola zistená zmena femorálnej trabekulárnej architektúry, zatiaľ čo táto zmena bola znížená liečbou akteozidom. Výsledky z mikro-CT analýzy odhalili, že BMD, miera sily kostí, bola u OVX myší dramaticky znížená (obr. 9D). V porovnaní so skupinou Sham OVX myši tiež vykazovali významné zmeny v BV/TV, Tb. Sp a Tb. N, ale nie v Tb.Th. Orálna liečba akteozidmi u OVX myší významne zabránila zmene BMD, ako aj BV/TV a Tb.N.

Akteozid neovplyvňuje osteoblastogenézu v bunkách kostnej drene

Úloha akteozidu na osteoblastickú diferenciáciu bola ďalej skúmaná pomocou buniek kostnej drene. Ako je znázornené na obr. 10A, ošetrenie DAG zvýšilo počet buniek zafarbených alizarínovou červenou a toto sa nezmenilo predošetrením 10 mM akteozidom. Množstvo prítomného farbiva ukázalo, že kombinovaná úprava akteozidom a DAG nezmenila mineralizáciu (obr. 10B). Podobne DAG-indukované zvýšenie obsahu intracelulárneho vápnika (obr. 10C) a hladín mRNA (obr. 10D) markerov špecifických pre kosti, ako sú Runx2, osterix, BSP a OC, nebolo ovplyvnené predošetrenímakteozid.