Aktívny prechod fázy pamäte strachu od opätovného zjednotenia k zániku prostredníctvom ERK-sprostredkovanej prevencie opätovného zjednotenia

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZískavaniestrachPamäťvyvoláva dva protichodné pamäťové procesy, tj rekonsolidáciu a zánik. Krátke vyhľadávanie vyvoláva opätovnú konsolidáciu na udržanie alebo posilnenie strachuPamäť, zatiaľ čo dlhšie vyhľadávanie túto spomienku zhasne. Aj keď boli skúmané mechanizmy opätovného upevnenia a zániku, zostáva neznáme, ako sa fázy pamäte strachu prepínajú z opätovného konsolidácie na zánik počas získavania pamäte. Tu ukazujeme, že proces prechodu pamäte závislý od extracelulárnej signálom regulovanej kinázy (ERK) po vyhľadávaní reguluje prepnutie pamäťových fáz z rekonsolidácie do zániku tým, že bráni indukcii rekonsolidácie v úlohe inhibičného vyhýbania (IA) u samcov myší. Po prvé, fáza prechodovej pamäte, ktorá ruší indukciu rekonsolidácie, ale je nedostatočná na získanie extinkcie, bola identifikovaná po rekonsolidácii, ale pred fázami extinkcie. Po druhé, fáza rekonsolidácie, prechodu a zánikunačítanie pamätevykazovali odlišné molekulárne a bunkové podpisy prostredníctvom proteínu viažuceho na cAMP (CREB) a fosforylácie ERK v amygdale, hipokampe a mediálnom prefrontálnom kortexe (mPFC). Fáza rekonsolidácie ukázala zvýšenú fosforyláciu CREB, zatiaľ čo fáza extinkcie vykazovala v týchto oblastiach mozgu niekoľko nervových populácií s rôznymi kombináciami fosforylácie CREB a / alebo ERK. Je zaujímavé, že tri pamäťové fázy, vrátane prechodnej fázy, vykazovali prechodnú aktiváciu ERK ihneď po načítaní. Najdôležitejšie je, že blokáda ERK v amygdale, hipokampe alebo mPFC vo fáze prechodovej pamäte dezinhibovala posilnenie IA pamäte vyvolané rekonsolidáciou. Tieto pozorovania naznačujú, že signálna dráha ERK aktívne reguluje prechod pamäťovej fázy od opätovného upevnenia k zániku a tento proces funguje ako prepínač, ktorý ruší opätovné upevnenie strachu.Pamäť.

Kľúčové slová: ERK; vyhynutie; pamäť strachu; rekonsolidácia; prechod

1Katedra biologických vied, Fakulta prírodných vied, Tokijská poľnohospodárska univerzita, Tokio 156-8502, Japonsko a

2 Graduate School of Agriculture and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokio 113-8657, Japan

Vyhlásenie o význame

Obnovenie pamäte strachuvyvoláva dva opačné pamäťové procesy; opätovná konsolidácia a zánik. Rekonsolidácia zachováva/zvyšujepamäť strachu, zatiaľ čo vyhynutie oslabuje pamäť strachu. Zostáva neznáme, ako sa fázy pamäte prepínajú z rekonsolidácie na zánik počas vyhľadávania. Tu sme identifikovali aktívny proces prechodu pamäte fungujúci ako prepínač, ktorý bráni opätovnému zjednoteniu. Táto fáza prechodu pamäte ukázala prechodné zvýšenie fosforylácie kinázy regulovanej extracelulárnym signálom (ERK) v amygdale, hipokampe a mediálnom prefrontálnom kortexe (mPFC). Je zaujímavé, že inhibícia ERK v týchto oblastiach v prechodnej fáze dezinhibovala rekonsolidáciou sprostredkované zvýšenie inhibičnej vyhýbacej (IA) pamäte. Tieto zistenia naznačujú, že proces prechodovej pamäte aktívne reguluje prepínanie fáz pamäte strachu v pamäti strachu tým, že bráni indukcii opätovnej konsolidácie prostredníctvom aktivácie signálnej dráhy ERK.

Úvod

Pamäťvyhľadávanie nie je pasívny proces, ale je to skôr dynamický proces, ktorý umožňuje udržanie, posilnenie, oslabenie alebo zmenu/aktualizáciu pôvodnej pamäte (Misanin a kol., 1968; Schneider a Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus a kol. ., 1979; Gordon, 1981; Nader a kol., 2000; Nader a Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima a kol., 2014). Dôležité je, že získaná podmienená pamäť strachu krátkym opätovným vystavením podmienenému stimulu (CS) sa stáva labilnou a na jej udržanie alebo vylepšenie vyžaduje rekonsolidáciu závislú od génovej expresie (Nader a kol., 2000; Dudai, 2002; Kida a kol., 2002; Suzuki a kol., 2004; Tronel a kol., 2005; Fukushima a kol., 2014). Naopak, kontinuálna alebo opakovaná expozícia CS vyvoláva zánik pamäti, čo oslabuje pamäť strachu (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers a Davis, 2002). Obnovenie pamäte strachu teda indukuje dva opačné pamäťové procesy, tj rekonsolidáciu a zánik, hoci oba procesy sú vyvolané opätovným vystavením identickému CS, ale líšia sa podľa trvania opätovného vystavenia CS.

Spoločným a kritickým biochemickým znakom rekonsolidácie a zániku je požiadavka na génovú expresiu sprostredkovanú proteínom viažucim elementy (CREB) reagujúcim na cAMP (Mamiya et al., 2009). Je zaujímavé, že sme ukázali kontrastné molekulárne, anatomické a behaviorálne podpisy medzi fázami rekonsolidácie a zániku kontextovej pamäte strachu (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Blokovanie syntézy bielkovín počas fázy rekonsolidácie narúša pôvodný strachPamäť, zatiaľ čo blokovanie syntézy proteínov počas fázy vyhynutia to nedokáže, hoci kontextová pamäť strachu bola reaktivovaná. Požiadavka oblastí mozgu vykazujúcich aktiváciu génovej expresie sprostredkovanej CREB sa líši medzi rekonsolidáciou a zánikom; rekonsolidácia závisí od amygdaly a hipokampu, zatiaľ čo zánik závisí od amygdaly a mediálneho prefrontálneho kortexu (mPFC). Časový priebeh aktivácie amygdaloidného CREB sa však medzi fázou rekonsolidácie a extinkčnej pamäte líši. Tieto pozorovania naznačujú, že fázy znovukonsolidácie a zániku nie sú nezávislé, ale skôr sa navzájom ovplyvňujú. Je zaujímavé, že nedávne štúdie identifikovali časové okno (prechodnú fázu), ktoré nevykazuje žiadnu aktiváciu kinázy regulovanej extracelulárnym signálom (ERK) v amygdale po rekonsolidácii, ale pred fázami zániku po získaní pamäte sluchového strachu (Merlo et al., 2018 ). Celkovo tieto zistenia naznačujú možné mechanizmy, ktorými sa fázy pamäte prepínajú z rekonsolidácie na zánik počas získavania pamäte strachu. Inými slovami, je možné, že proces prechodu pamäte aktívne reguluje tento prepínač.

V úlohe inhibičného vyhýbania (IA) myši dostanú elektrický šok do nohy potom, čo vstúpia do tmavého priestoru zo svetlého priestoru a vytvoria saPamäťaby ste sa vyhli tmavému oddeleniu. Predtým sme pomocou tejto úlohy ukázali, že fázy opätovného upevnenia a zániku možno rozlíšiť v čase, keď myš vstúpi do tmavého priestoru zo svetlého priestoru počas relácie opätovnej expozície (Fukushima et al., 2014). Táto úloha nám preto umožňuje charakterizovať perspektívne molekulárne podpisy fáz rekonsolidácie a zániku, na rozdiel od klasickej kontextovej paradigmy podmieňovania strachu, v ktorej reaktivácia podmienenej pamäte strachu opätovným vystavením CS iniciuje rekonsolidáciu aj zánik; krátka (3 min) opätovná expozícia podmienenému kontextu vyvoláva rekonsolidáciu, zatiaľ čo dlhá (30 min) alebo opakovaná opätovná expozícia tomuto kontextu vyvoláva zánik (Eisenberg a kol., 2003; Pedreira a Maldonado, 2003; Suzuki a kol., 2004; Lee a kol., 2008; Mamiya a kol., 2009). Ďalej sme zistili, že získaná pamäť IA je v tejto úlohe vylepšená rekonsolidáciou pamäte (Fukushima et al., 2014).

Pochopiť mechanizmus prechodu od opätovného upevnenia k zániku počas obnovy strachuPamäťsme sa zamerali na identifikáciu a charakterizáciu molekulárnych, bunkových a behaviorálnych podpisov fáz rekonsolidácie, prechodu a zániku pamäte IA. Analyzovali sme aktiváciu CREB a ERK v amygdale, hipokampe a mPFC vo fázach rekonsolidácie, prechodu a zániku a skúmali sme úlohy aktivácie ERK v týchto pamäťových procesoch.

Materiály a metódy

Myši Všetky experimenty sa uskutočňovali podľa Príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat (Japan Neuroscience Society a Tokyo University of Agriculture). Všetky pokusy na zvieratách uskutočnené v tejto štúdii boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie Tokijskej poľnohospodárskej univerzity (autorizácia č. 280037). Všetky chirurgické zákroky sa uskutočňovali v anestézii Nembutalom a bolo vynaložené maximálne úsilie na minimalizáciu utrpenia. Samce myší C57BL/6N boli získané od Charles River. Myši boli umiestnené v klietkach po piatich alebo šiestich, udržiavané v cykle 12/12 h svetlo/tma a bol im umožnený prístup k potrave a vode ad libitum. Pri testovaní mali myši najmenej osem týždňov. Testovanie sa uskutočnilo počas svetelnej fázy cyklu. Všetky experimenty sa uskutočňovali naslepo vzhľadom na liečebné podmienky myší.

IA test Prechodový IA prístroj (OHARA Pharmaceutical) pozostával zo škatule s oddelenými svetlými a tmavými priehradkami (obe 15,5 12,5 11,5 cm). Svetelný priestor bol osvetlený fluorescenčným svetlom (2500 luxov; Fukushima a kol., 2008, 2014; Zhang a kol., 2011; Ishikawa a kol., 2016). Pred začiatkom IA tréningu sa s myšami zaobchádzalo individuálne počas 2 minút každý deň počas jedného týždňa. Počas tréningu sa každej myši umožnilo privyknúť si na svetlú priehradku na 30 s a dvierka gilotíny sa zdvihli, aby sa umožnil prístup do tmavého oddelenia. Latencia vstupu do tmavého kompartmentu sa považovala za meradlo akvizície. Len čo myš vošla do tmavého priestoru, dvierka gilotíny sa zatvorili. Po 5 s bol aplikovaný šok do nohy (0,2 mA) na celkovú dobu 2 s (tréning). 24 hodín po tréningu bola myš umiestnená späť do svetlej priehradky, kým nevstúpila do tmavej priehradky (priemer 459 6 15,49 s). Ihneď potom, čo myš vstúpila do tmavého oddelenia, sa dvierka gilotíny zatvorili a myš zostala v tmavom oddelení rôzne dlhý čas (0, 1 alebo 10 minút) bez šoku do nohy (reaktivácie). Pamäť sa hodnotila o 48 hodín neskôr [test dlhodobej pamäte po aktivácii (PR-LTM)] ako krížová latencia myši na vstup do tmavého priestoru, keď je nahradený svetlom, ako pri reaktivácii.

V prvom experimente sme skúmali účinok inhibície syntézy proteínov po reaktivácii (opätovné vystavenie tmavému kompartmentu na 0, 1 alebo 1 0 min; Obr. 1). Inhibítor proteínovej syntézy anisomycín (ANI; Wako) bol rozpustený vo fyziologickom roztoku (pH upravené na 7.0-7,4 pomocou NaOH). Myši boli trénované, ako je opísané vyššie, a o 24 hodín neskôr dostali vehikulum (VEH) alebo ANI (150 mg/kg, ip) ihneď po opätovnom vystavení tmavému kompartmentu na 0, 1 alebo 10 minút bez šoku do nohy. (reaktivácia). Pri tejto dávke ANI inhibuje 0,90 percent proteínovej syntézy v mozgu počas prvých 2 hodín (Flood et al., 1973). 48 hodín po reaktivačnej relácii boli jednotlivé myši opäť umiestnené do svetelného priestoru a bola hodnotená krížová latencia.

Pre druhý experiment [fosforylovaný CREB (pCREB) a fosforylovaný ERK (pERK) imunohistochémia; Obr. 2–5] sme skúmali oblasti mozgu, ktoré boli aktivované po opätovnom vystavení svetlu (kým myši nevstúpili do tmavého priestoru, znovu sa vystavili tmavému priestoru na 0 min) alebo tmavého priestoru (opätovné vystavenie vystavenie tmavému priestoru na 1 alebo 1 0 min). Myši boli rozdelené do štyroch Fukushima et al. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 10. február 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289groups. 24 hodín po tréningu boli jednotlivé myši znovu vystavené svetlému kompartmentu a potom zostali v tmavom kompartmente po ich vstupe z tmavého kompartmentu [reaktivácia: 0 min v tmavom kompartmente, rekonsolidačná (Recon) skupina; 1 min, prechodná (Tran) skupina; 10 min, vyhynutie (Ext) skupina]. Ďalšia skupina myší sa nevrátila do priestoru svetlo/tma [nereaktivovaná (NR) skupina]. Myši sa potom anestetizovali Nembutalom (750 mg / kg, ip) 5, 15 alebo 30 minút po reaktivácii.

Pre tretí experiment (mikroinfúzia U0126; obr. 6, 7) sme skúmali účinky inhibície ERK v amygdale, hipokampe alebo mPFC naPamäťrekonsolidácia/vylepšenie, prechod a zánik. Inhibítor MEK U0126 (Sigma-Aldrich) sa rozpustil v umelom cerebrospinálnom moku obsahujúcom tri kvapky Tween 80 (Sigma) v 2,5 ml 7,5 % dimetylsulfoxidu (Wako) a upravil sa na pH 7,4 s NaOH. Myši boli trénované, ako je opísané vyššie, a o 24 hodín neskôr boli umiestnené späť do svetelného oddelenia (reaktivácia). Myšiam bola okamžite podaná mikroinfúzia U0126 (1 mg) alebo VEH do rôznych oblastí mozgu (obr. 6A, C, E–H, 7A–C) alebo 30 minúty po (obr. 6B, D) reaktiváciu. 48 hodín po reaktivácii boli jednotlivé myši opäť umiestnené do svetelného priestoru a bola hodnotená krížová latencia (PR LTM). Mikroinfúzie do hipokampu a mPFC (0,5 ml) sa uskutočňovali rýchlosťou 0,25 ml/min. Mikroinfúzie do amygdaly (0,2 ml) sa uskutočňovali rýchlosťou 0,1 ml/min. Injekčná kanyla sa po mikroinfúzii nechala na mieste 2 minúty a myši sa potom vrátili do svojich domácich klietok. Inhibítor MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) sa rozpustil v dimetylsulfoxide a zriedil fyziologickým roztokom. Myši boli trénované, ako je opísané vyššie, a o 24 hodín neskôr boli jednotlivé myši umiestnené späť do svetelného oddelenia (reaktivácia). Myšiam bol systémovo injikovaný SL327 (10 alebo 20 mg/kg) alebo VEH ihneď po reaktivácii (obr. 7D-F). 48 hodín po reaktivácii boli jednotlivé myši opäť umiestnené do svetelného priestoru a bola hodnotená krížová latencia (PR-LTM).

Imunohistochémia sa uskutočnila tak, ako je opísané vyššie (Mamiya a kol., 2009; Suzuki a kol., 2011; Zhang a kol., 2011; Fukushima a kol., 2014; Ishikawa a kol., 2016; Hasegawa a kol., 2019). Po anestetizácii boli všetky myši perfundované 4 percentami paraformaldehydu. Mozgy boli vybraté, fixované cez noc, prenesené do 30-percentnej sacharózy a uskladnené pri 4 stupňoch. Koronálne rezy (30 mm) boli narezané v kryostate.

Na farbenie pCREB a pERK boli voľne plávajúce rezy ošetrené 1 percentom H2O2 a inkubované cez noc s králičou polyklonálnou anti-fosfo-CREB (serín 133; S133) protilátkou (1:1000; #{{10 }}, Millipore) a/alebo králičej monoklonálnej anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) protilátky (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) v blokovacom roztoku (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom plus 1 % kozí sérový albumín, 1 mg/ml hovädzieho sérového albumínu a 0,05 % Triton X-100). Rezy sa premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom a inkubovali sa s chrenovou peroxidázou konjugovanou oslím anti-králičím IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch) pre pCREB alebo kozím anti-králičím IgG konjugovaným s chrenovou peroxidázou pre pERK počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Signály pCREB boli amplifikované biotín tyramidom a vizualizované pomocou streptavidínu konjugovaného s Alexa Fluor (Invitrogen). Signály pERK sa amplifikovali pomocou TSA-FCM (Invitrogen). Rezy boli namontované na podložné sklíčka a zakryté krycím sklíčkom pomocou montážneho média (Millipore).

Kvantifikácia sa uskutočnila tak, ako je opísané vyššie (Frankland a kol., 2006; Fukushima a kol., 2014; Mamiya a kol., 2009; Zhang a kol., 2011; Suzuki a kol., 2008). Štruktúry boli definované anatomicky podľa atlasu Franklina a Paxinosa (1997). Všetky imunoreaktívne neuróny boli spočítané experimentátorom, ktorý nevidel liečebný stav

Výsledky

Charakterizácia pamäťových fáz po vyhľadaní v úlohe IA

Úloha IA nám umožňuje rozlíšiť fázy znovukonsolidácie a zániku v čase, keď myš vstúpi do tmavého priestoru zo svetlého priestoru (Fukushima et al., 2014). Aby sme pochopili mechanizmus, ktorý je základom prepínania pamäťových fáz z rekonsolidácie na zánik, charakterizovali sme IA pamäťové fázy po získaní pamäte skúmaním účinkov inhibície proteínovej syntézy, ktorá je potrebná na opätovné konsolidovanie a zánik IA pamäte (Fukushima et al., 2014). Myši sa najskôr umiestnili do svetelného oddelenia. 5 s po tom, čo vstúpili do tmavého priestoru, bol zasiahnutý krátky elektrický šok (tréning). Myši boli znovu vystavené svetlému kompartmentu 24 hodín po tréningu (reaktivačná relácia; obr. 1A) a bola hodnotená ich krížová latencia na vstup do tmavého priestoru (obr. 1B). Myši boli vrátené do svojich domácich klietok ihneď po tom, ako vstúpili do tmavého oddelenia zo svetlého oddelenia (0-min. opätovné vystavenie tmavému oddeleniu; fáza rekonsolidácie) alebo zostali v tmavom oddelení 1, 3, resp. 10 minút bez šoku do nohy (fáza extinkcie; obr. 1C–E). Ihneď po reaktivačnej relácii dostali myši systémovú injekciu VEH alebo inhibítora proteínovej syntézy ANI. O 48 hodín neskôr sa latencia kríženia hodnotila PR-LTM.

V súlade s našou predchádzajúcou štúdiou (Fukushima et al., 20}14) opätovná expozícia svetelnému kompartmentu (skupina 0 min) vyvolala opätovnú konsolidáciu a zlepšenie pamäte IA. Dvojcestná analýza ANOVA odhalila významné účinky času (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), liek (F(1 ,24)=23.197, p, 0,0001) a časová lieková interakcia (F(1,24)=25,022, p, 0,0001; Obr. 1B). Post hoc Bonferroniho test a párový t-test odhalili, že skupiny VEH a ANI vykazovali signifikantne zvýšenú, resp. }} 5,134, p=0,0021, ANI, t(6)=4,804, p=0,003; Obr. 1B). Tieto pozorovania naznačujú, že získavanie pamäte IA v ľahkej kompartmente zlepšilo pamäť, zatiaľ čo inhibícia syntézy proteínov narušila získanú pamäť, čo potvrdzuje predchádzajúce pozorovanie, že získavanie pamäte IA zlepšuje pamäť prostredníctvom opätovnej konsolidácie spôsobom závislým od syntézy proteínov.

Na rozdiel od toho opätovné vystavenie tmavému kompartmentu vyvolalo dlhodobú extinkciu [obojsmerná ANOVA, čas (obr. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{101} {50}}04; Obr. 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), liek (Obr. 1C, F(1,28)=4,674, p=0,039; Obr. 1D, F(1,36)=12,285, p {{29 }}.0012), časová lieková interakcia (obr. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; obr. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], ako bolo pozorované skôr (Fukushima et al., 2014). Skupiny VEH, ktoré zostali v tmavom kompartmente 3 alebo 10 minút, vykazovali významne zníženú skríženú latenciu pri PR-LTM v porovnaní s reláciou reaktivácie, zatiaľ čo skupiny ANI vykazovali porovnateľnú latenciu kríženia pri PR-LTM v porovnaní s reláciou reaktivácie a s reaktiváciou. VEH skupiny (post hoc Bonferroniho test, ps , 0,05; párový t test, obr. 1C, VEH, t(7)=4,976, p=0,0016, ANI, t(7) { 0,05 ). Tieto pozorovania naznačujú, že opätovné vystavenie tmavému kompartmentu na 3 alebo 10 minút uhasilo pamäť IA a že inhibícia syntézy proteínov blokovala dlhodobé vyhynutie. Vyhľadanie IA pamäte v tmavom priestore teda uhasí IA pamäť spôsobom závislým od génovej expresie.

Dôležité je, že skupina VEH vykazovala porovnateľnú skríženú latenciu pri PR-LTM v porovnaní s reláciou reaktivácie a so skupinou ANI, keď zostali v tmavom kompartmente 1 minútu [obojsmerná ANOVA, čas (F(1,36) {{ 5}}.03, s. 0.05), liek (F(1,36)=0.019, s . 0.05), časová interakcia lieku (F(1,36)=0.011, s. 0,05); post hoc Bonferroniho test, ps . 0,05; párový t-test, VEH, t(9)=0.091, s. 0,05, ANI, t(9)=0,328, s. 0,05; Obr. 1E]. Tieto pozorovania naznačujú, že skupina VEH nevykazovala ani zlepšenie, ani zánik IA pamäte a že skupina ANI nevykazovala žiadne narušenie pamäte IA. Preto opätovná expozícia tmavému kompartmentu na 1 minútu zablokovala vylepšenie aj ANI-indukované narušenie reaktivovanej IA pamäte, ale nezhaslo IA pamäť, čo naznačuje, že táto 1-minútová opätovná expozícia ruší indukciu rekonsolidácie , ale nestačí na zhasnutie pamäte IA.

V súhrne tieto výsledky ukázali, že opätovná expozícia svetlému kompartmentu indukuje fázu rekonsolidácie, zatiaľ čo dlhšia opätovná expozícia tmavému kompartmentu (3 alebo 10 minút) indukuje fázu extinkcie. Ešte dôležitejšie je, že zotrvanie 1 minúty v tmavom priestore vyvoláva prechodnú fázu od opätovného upevnenia k zániku, čo bráni opätovnému upevneniu pamäte strachu bez vyvolania zániku.

Molekulárne podpisy fáz rekonsolidácie, prechodu a zániku v amygdale, hipokampe a mPFC po načítaní pamäte IA

Opätovná konsolidácia a zánik kontextovej pamäte strachu ukazuje zvýšenie fosforylácie CREB na S133, markera aktivácie génovej expresie potrebnej na rekonsolidáciu a dlhodobé vyhynutie, ale vykazuje zreteľnú dynamiku fosforylácie CREB (Mamiya et al., 2009 ). Je zaujímavé, že nedávne štúdie ukázali, že nedochádza k zvýšeniu fosforylácie ERK, upstream regulátora CREB (Impey a kol., 1998; Wu a kol., 2001), v bazolaterálnej oblasti amygdaly pri prechode z rekonsolidácie. k zániku pamäte vyvolanej strachom, hoci táto fosforylácia je zvýšená v bazolaterálnej oblasti, keď je pamäť vyvolaná strachom znovu konsolidovaná a uhasená (Merlo et al., 2014, 2018). Ďalšia štúdia naznačila, že hipokampálna ERK sa aktivuje iba vtedy, keď kontextová pamäť strachu vyhasne, ale nie je znovu konsolidovaná (Tronson et al., 2009). Tieto zistenia naznačujú, že fázy rekonsolidácie, prechodu a zániku vykazujú odlišné molekulárne a bunkové podpisy. Preto sme pomocou imunohistochémie merali a porovnávali hladiny pCREB a pERK vo fázach rekonsolidácie, prechodu a zániku. Uskutočnili sme podobné experimentálne rozvrhy ako na obrázku 1B, D, E s použitím štyroch experimentálnych skupín. Myši boli znovu vystavené svetlému kompartmentu 24 hodín po tréningu a potom zostali v tmavom kompartmente [reaktivácia: 0 min v tmavom kompartmente, skupina na rekonsolidáciu (Recon); 1 min, prechodná (Tran) skupina; 10 min, vyhynutie (Ext) skupina]. Ďalšia skupina myší sa nevrátila do priestoru svetlo/tma (nereaktivovaná, skupina NR). Počítali sme pCREB-pozitívne (pCREB1) neuróny, pERK-pozitívne (pERK1) neuróny a dvojito pozitívne (pCREB1/pERK1) neuróny v amygdale, hipokampe a mPFC 30 minút po reaktivácii.

Amygdala (laterálna oblasť) CREB bola aktivovaná vo fáze zániku a konsolidácie, zatiaľ čo ERK bola aktivovaná iba vo fáze zániku (obr. 2A–C). Jednosmerná ANOVA odhalila významný vplyv skupiny (obr. 2B, F(3,29)=14.85, p, 0.0001). Podobne ako v predchádzajúcich zisteniach (Mamiya et al., 2009), post hoc Newman-Keulsov test odhalil, že skupiny Recon a Ext vykazovali významne viac neurónov pCREB1 ako ostatné skupiny (p, 0,05). Tieto pozorovania ukázali, že podobne ako pri pozorovaniach na úrovniach správania (obr. 1), vystavenie tmavému kompartmentu na 1 minútu (prechodná fáza) ruší „zapnutie“ fosforylácie CREB, ktorá by sa zvýšila vo fáze rekonsolidácie. Na rozdiel od toho bolo v skupine Ext pozorovaných výrazne viac neurónov pERK1 ako v iných skupinách, hoci v skupine Ext bolo oveľa menej neurónov pERK1 ako neurónov pCREB1 (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207, obr. 2C).

V skupine Ext (F(3,29)=6.698, p=0 sa pozorovalo výrazne viac dvojito pozitívnych neurónov (pCREB1/pERK1).00 14; Obr. 2D), zatiaľ čo významne viac neurónov pCREB1/ pERK– (pCREB single positive) neurónov bolo pozorovaných v skupinách Recon a Ext (F(3,29)=13.689, p, 0 .0001; Obr. 2E). Fáza rekonsolidácie teda ukázala iba jednu populáciu neurónov pCREB1 / pERK–. Na rozdiel od toho, fáza extinkcie ukázala dve populácie neurónov pCREB1 / pERK– a pCREB1 / pERK1, čo naznačuje, že ERK je aktivovaná iba v podskupine neurónov pCREB1. Dôležité je, že podobné výsledky boli pozorované v bazolaterálnej oblasti amygdaly (obr. 2G, F(3,29)=13,042, p, 0,0001; obr. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Obr. 2I, F(3,29)=12.633, p, 0,0001; Obr. 2J, F(3,29)=12 0,505, p, 0,0001).

Dvojfázová aktivácia ERK vo fáze zániku ERK je aktivátorom proti prúdu CREB, a preto je aktivácia ERK potrebná na konsolidáciu a opätovnú konsolidáciu pamäte strachu (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci a kol., 2005). Nekonzistentne však nebola pozorovaná žiadna aktivácia ERK v amygdale, hipokampe alebo mPFC vo fáze rekonsolidácie, keď sa pERK meral 3 0 min po reaktivačnej relácii (obr. 2-4). Preto sme skúmali časové priebehy fosforylácie ERK a CREB. Uskutočnili sme podobný experiment ako na obrázkoch 2-4 s tým rozdielom, že hladiny pCREB a pERK boli merané 5, 15 a 30 min po reaktivačnej relácii (opätovné vystavenie tmavému kompartmentu počas {{ 66}}, 1 alebo 1 0 min, obr. 5A). V súlade s údajmi zobrazenými na obrázkoch 2-4 sa po relácii reaktivácie v Recon (amygdala, mPFC a hippocampus) a Ext (amygdala a mPFC) pozorovali významné zvýšenia neurónov pCREB1. ) skupiny, ale nie skupina Tran (obr. 5E, jednosmerná ANOVA, amygdala, 5 min, F(3,23)=0.346, s. 0,05, 30 min, F(3,23)=15,272, p, 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1,169, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001; hippocampus, 5 min, F(3,23)=0,154, p, 0,05, 30 min, F(3,23)=16,197, p, 0,0001; nepárový t test, amygdala, rekonsolidácia, 5 vs 30 min, t(12)=7,807, p , 0,0001, zánik, 5 vs 30 min, t(12)=5,405, p { {73}}.0002; mPFC, rekonsolidácia, 5 vs 30 min, t(12)=5,727, p , 0,0001, zánik, 5 vs 30 min, t(12)=4,188 , p=0,0013; hipokampálna oblasť CA1, rekonsolidácia, 5 vs 30 min, t(12)=2,339, p=0,0374).

Je zaujímavé, že významné zvýšenie neurónov pERK1 bolo pozorované v amygdale, mPFC a hipokampe skupín Recon, Tran a Ext 5 minút po reaktivácii v porovnaní so skupinou NR (obr. 5F, amygdala, F(3,23)).=10.961, p=0.{28}}001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Tieto pozorovania ukázali, že ERK sa aktivuje ihneď po reaktivácii vo všetkých fázach pamäte. Tieto zvýšenia počtu neurónov pERK1 sa však vrátili na bazálnu úroveň (porovnateľnú so skupinou NR) 15 minút po reaktivácii (obr. 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, s. 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, s. 0,05; hippocampus, F(3,20)=0,74, s. 0,05). Okrem toho, v súlade so zisteniami uvedenými na obrázkoch 2-4, významne viac neurónov pERK1 bolo pozorovaných v amygdale, mPFC a hipokampe 30 minút po reaktivačnej relácii iba v skupine Ext (obr. 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, s.=0.003). Rekonsolidačná a prechodná fáza teda vykazujú prechodnú aktiváciu ERK iba v skorom časovom bode (5 minút), zatiaľ čo fáza extinkcie ukazuje dvojfázovú aktiváciu ERK v skorých (5 min) a neskorých (30 min) časových bodoch po reaktivácii. relácie. Tieto pozorovania ukázali, že mechanizmy regulácie aktivácie ERK sa líšia vo fázach rekonsolidácie / prechodu a zániku. Súhrnne naše pozorovania ukázali, že fázy rekonsolidácie, prechodu a zániku vykazujú odlišné molekulárne podpisy.

Úlohy aktivácie ERK vo fázach rekonsolidácie a zániku pamäte IA

Fázy rekonsolidácie/prechodu a extinkcie vykazovali jednofázovú a dvojfázovú aktiváciu ERK. Ďalej sme skúmali a porovnávali úlohy skorej (5 minút) a neskorej (30 minút) aktivácie ERK v mPFC vo fázach rekonsolidácie a extinkcie skúmaním účinkov inhibície ERK (obr. 6).

Diskusia

V tejto štúdii sme skúmali mechanizmy prechodu pamäte z fáz rekonsolidácie do fáz zániku po získaní pamäte IA. Najprv sme charakterizovali behaviorálne podpisy fáz pamäte IA po získaní. V súlade s našou predchádzajúcou štúdiou (Fukushima et al., 2014) obnova a zánik vyvolaná IA obnovením pamäte opätovným vystavením svetlu (0 min v tmavom priestore) a tme ( 3 alebo 10 minút) priehradky. Je zaujímavé, že IA pamäť nebola ani posilnená, ani zhasnutá a vykazovala rezistenciu voči inhibícii syntézy proteínov, keď boli myši opätovne vystavené tmavému kompartmentu iba na 1 minútu. Preto tieto pozorovania naznačujú, že 1-minútová opätovná expozícia tmavému kompartmentu ruší indukciu rekonsolidácie, ale je nedostatočná na uhasenie pamäte IA. Ďalej sme zistili, že ERK bola aktivovaná v amygdale, hipokampe a mPFC v skorom časovom bode (5 minút) po opätovnom vystavení tmavému kompartmentu počas 0, 1 alebo 10 minút. V súlade s tým inhibícia ERK v týchto oblastiach mozgu blokovala rekonsolidáciu / posilnenie a zánik IA pamäte. Najdôležitejšie je, že inhibícia ERK v amygdale, hipokampe a mPFC po 1-minútovej opätovnej expozícii tmavému kompartmentu dezinhibovala rekonsolidáciou sprostredkované zlepšenie IA pamäte, čo naznačuje, že aktivácia ERK po krátkych (1 min) opätovných expozíciách do tmavého kompartmentu je potrebný na inhibíciu rekonsolidácie IA pamäte. Naopak, 1-minútová opätovná expozícia tmavému oddeleniu bola nedostatočná na zhasnutie pamäte IA, hoci predĺžená opätovná expozícia tmavému priestoru (3 alebo 10 minút) túto pamäť zhasla. Naše výsledky preto naznačujú, že 1-minútová opätovná expozícia tmavému kompartmentu vyvoláva proces prechodu pamäte, ktorý ruší rekonsolidáciu/vylepšenie, ale neiniciuje učenie zániku. Spoločne navrhujeme, aby proces prechodu pamäte prispieval k prepínaniu fáz pamäte z rekonsolidácie na zánik prostredníctvom ERK-sprostredkovanej prevencie rekonsolidácie.

Podobne ako v prípade našich súčasných pozorovaní, nedávna štúdia využívajúca kondicionovanie sluchového strachu ukázala, že jednotlivé (1) alebo predĺžené (10) CS prezentácie indukujú rekonsolidáciu pamäte a zánik, v uvedenom poradí, prostredníctvom zvýšenia hladín pERK v bazolaterálnej oblasti amygdaly. Na rozdiel od toho, stredné (4–7) CS prezentácie nemenia hladiny pERK v bazolaterálnej oblasti amygdaly. Dôležité je, že inhibícia ERK pri stredných prezentáciách CS neovplyvnila pamäť strachu. Táto štúdia naznačila, že po obnovení pamäte strachu dochádza k prechodu pamäťovej fázy z rekonsolidácie k zániku (Merlo et al., 2018). V tejto štúdii sme toto zistenie rozšírili a navrhli sme, že prechodná fáza aktívne prepína pamäťové fázy z rekonsolidácie na zánik prostredníctvom aktivácie dráhy prenosu signálu ERK. Na rozdiel od predchádzajúcich zistení (Merlo et al., 2018) sme zistili, že prechodná fáza zahŕňa fosforyláciu ERK v amygdale, hipokampe a mPFC. Tieto nezrovnalosti môžu byť spôsobené rozdielom v časových bodoch skúmajúcich fosforyláciu ERK; predchádzajúca štúdia merala hladiny pERK 12 minút po prezentácii CS (Merlo et al., 2018), zatiaľ čo naša štúdia ukázala, že zvýšené hladiny pERK sa vrátili na základnú úroveň približne v tomto časovom bode (15 minút po opätovnej expozícii). Okrem toho je dôležité poznamenať, že úloha IA umožňuje pozorovanie zlepšenia pamäte IA prostredníctvom opätovnej konsolidácie, čo vedie k nášmu zisteniu, že inhibícia ERK v prechodnej fáze dezinhibuje zlepšenie pamäte IA.

Predchádzajúce štúdie ukázali, že fosforylácia ERK sa zvyšuje v bazolaterálnej oblasti amygdaly po 20–60 minútach po učenia sa zániku pamäti vyvolanej strachom (Herry a kol., 2006; Merlo a kol., 2014, 2018), zatiaľ čo hipokampus ukazuje táto aktivácia po 1 hodine po učenia sa o zániku kontextovej pamäte strachu (Fischer a kol., 2007; Tronson a kol., 2009). V tejto štúdii sme získali podobné pozorovania, že pERK sa zvyšuje 30 minút po relácii reaktivácie vo fáze zániku. Tieto zistenia naznačujú, že fosforylácia ERK je bežným molekulárnym podpisom fázy neskorej extinkcie (20–60 minút).

Ďalej sme pozorovali, že aktivácia ERK nastáva bifázicky v skorých a neskorých časových bodoch (5 a 30 minút) po reaktivačnej relácii vo fáze extinkcie, zatiaľ čo táto aktivácia nastáva monofázicky v ranom časovom bode vo fáze rekonsolidácie (obr. 5). . Inhibícia ERK v oblastiach mozgu v týchto časových bodoch fáz rekonsolidácie a zániku blokovala rekonsolidáciu/posilnenie a dlhodobé vymieranie (obr. 6A, C–H). Tieto pozorovania naznačujú, že na posilnenie a zánik IA pamäte je potrebná monofázická a dvojfázová aktivácia ERK. Je dôležité poznamenať, že ERK funguje ako upstream regulátor fosforylácie CREB. Preto prechodná aktivácia ERK v ranej pamäťovej fáze môže aspoň čiastočne prispieť k tejto fosforylácii CREB, ktorá aktivuje expresiu génov potrebných na rekonsolidáciu a dlhodobé vyhynutie.

Podobne ako pri našich predchádzajúcich zisteniach s použitím kontextového podmieňovania strachu (Mamiya et al., 2009), CREB bol aktivovaný vo fázach rekonsolidácie (amygdala/hippocampus/mPFC) a extinkcie (amygdala/mPFC), zatiaľ čo ERK sa aktivoval iba vo fáze zániku. 30 minút po reaktivácii. V súlade s tým bola vo fáze rekonsolidácie pozorovaná iba jedna populácia neurónov pCREB1/pERK–, zatiaľ čo vo fáze zániku boli pozorované odlišné populácie neurónov: neuróny pCREB1/pERK– a pCREB1/pERK1 v amygdale (obr. 2); pCREB– /pERK1 neuróny v hipokampe (obr. 3); a neuróny pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 a pCREB1/pERK1 v mPFC (obr. 4). Tieto pozorovania, najmä kontrastné pozorovanie neurónov pCREB–/ pERK1 a pCREB1/pERK–, naznačujú, že aktivácia CREB a ERK je regulovaná odlišne v každej oblasti mozgu, keď je pamäť zhasnutá a že neskorá fáza aktivácie ERK hrá špecifickú a odlišnú úlohy pri zániku pamäte strachu v porovnaní s inými pamäťovými procesmi, ako je konsolidácia a opätovná konsolidácia, ako je uvedené nižšie. Zaujímavé je, že sme pozorovali, že neuróny pERK1 boli v mPFC hojnejšie v porovnaní s hipokampom a amygdalou, pretože mPFC vykazoval vyšší pomer neurónov pERK1 (fáza zániku) a neurónov pCREB1 (fáza rekonsolidácie) v porovnaní s hipokampom a amygdalou, čo naznačuje, že aktivácia ERK v mPFC hrá špecifickejšiu úlohu pri zániku pamäte.

Zostáva nejasné, či sa vo fázach rekonsolidácie, prechodu a zániku pamäte aktivujú rovnaké alebo rôzne populácie neurónov. Predchádzajúca štúdia identifikovala aktiváciu „neurónov strachu“ a „neurónov zániku“ v amygdale, keď je pamäť vyvolaná strachom reaktivovaná alebo uhasená (Herry et al., 2008). Preto je možné, že ERK a CREB sú aktivované v rôznych populáciách neurónov s rôznymi časovými profilmi (tj "rekonsolidačné neuróny" a neuróny zániku). Ako je uvedené vyššie, neuróny pCREB1, vrátane neurónov pCREB1 / pERK1, môžu regulovať rekonsolidáciu a dlhodobé vymieranie IA pamäte prostredníctvom aktivácie génovej expresie ako rekonsolidačných a extinkčných neurónov. Naopak, aktivácia ERK v neurónoch pCREB–/pERK1 môže prispieť k zrušeniu aktivácie transkripcie sprostredkovanej CREB, ktorá by bola potrebná na rekonsolidáciu, pretože táto aktivácia ERK je špecificky pozorovaná v neskorej fáze zániku; ERK sa aktivoval v rekonsolidačných neurónoch, aby zrušil aktiváciu génovej expresie vo fáze zániku. Je zaujímavé, že predchádzajúca štúdia ukázala, že aktivácia hippocampu ERK blokuje indukciu c-fos, keď je kontextová pamäť strachu zhasnutá (Guedea et al., 2011), čo zvyšuje možnosť, že táto aktivácia ERK antagonizuje signálnu dráhu CREB. Je dôležité identifikovať neurónové populácie, ktoré regulujú rekonsolidáciu, prechod a zánik, a preskúmať molekulárne podpisy a funkčný význam týchto neurónov. Okrem toho interakcie medzi nervovými populáciami identifikovanými v tejto štúdii zostávajú neznáme. Je možné, že „extinkčné (prechodné) neuróny“ modulujú funkciu rekonsolidačných neurónov, aby zrušili zabránenie rekonsolidácii prostredníctvom interakcií medzi nimi (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Preto je tiež dôležité preskúmať tieto interakcie v amygdale, mPFC a hipokampe a medzi nimi.

Predtým sme ukázali, že hipokampus nevykazuje žiadnu zmenu fosforylácie CREB a expresie Arc po učenia sa o zániku kontextového strachu a dôsledne inhibícia syntézy proteínov v hipokampe vo fáze zániku nedokáže blokovať dlhodobé zániku (Mamiya et al. , 2009). Tieto pozorovania zvýšili možnosť, že hipokampus nie je potrebný na dlhodobé vyhynutie. Ukázali sme však, že ERK sa aktivuje v hipokampe po zánikovom učení IA pamäte a dôsledne blokovanie aktivácie ERK v hipokampe zhoršuje dlhodobé vyhynutie. Naše súčasné pozorovania preto naznačujú zásadnú úlohu hipokampu pri zániku pamäte. Spolu s našimi predchádzajúcimi zisteniami navrhujeme, že hipokampus je potrebný na vyhynutie pamäte, ale nie na proces podobný konsolidácii na stabilizáciu „pamäti na vyhynutie“ prostredníctvom aktivácie génovej expresie.