Izolácia fenolových kompozícií zo steny Anneslea Fragrans riadená aktivitami. A ich cytoprotektívny účinok proti oxidačnému stresu indukovanému peroxidom vodíka v bunkách HepG2, časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05), zatiaľ čo 6 vykazovalo najlepšiu antiapoptóznu aktivitu. Výsledky naznačujú, že A.fragrans by mohol slúžiť ako cenný antioxidačný fytochemický zdroj pre vývoj funkčných potravín a zdravotných nutraceutických produktov.

Kľúčové slová:Anneslea fragrans; antioxidant; riadená izolácia; oxidačný stres; flavonoidové glykozidy

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod

Reaktívne formy kyslíka (ROS) vznikajú ako vedľajšie produkty oxidatívnym dýchaním pri normálnych fyziologických a biochemických procesoch [1]. Ako endogénne voľné radikály hrá ROS dôležitú úlohu v bunkovej signalizácii a udržiavaní telesnej stálosti v normálnom rozsahu [2]. Ak by sa ROS nepodarilo účinne vychytať, nadmerný ROS by mohol viesť k výskytu oxidačného stresu, ktorý môže ovplyvniť bunkovú proliferáciu a apoptózu [3]. Oxidačný stres úzko súvisí s rôznymi chorobami vrátane cukrovky, hyperlipémie, obezity, rakoviny a kardiovaskulárnych a neurodegeneratívnych chorôb [4]. Nedávno mnohé štúdie preukázali, že strava obohatená o antioxidanty má rad priaznivých účinkov vďaka ich schopnosti zachytávať nadmerné ROS [5,6].

Prírodné antioxidanty obsahujú rôzne molekuly, ako sú polyfenoly[], karotenoidy [8], vitamíny [9], zlúčeniny obsahujúce dusík [10] a kumaríny [9]. Polyfenoly sú široko distribuované v celej rastlinnej ríši a podporujú zdravotné prínosy vďaka svojim antioxidačným vlastnostiam [11]. Mnohé z nich, ako napríklad resveratrol a niektoré deriváty [12], antokyanidíny [13, izoflavóny [14 l, katechín [15 l a kvercetín [16] sú dobre známe pre svoj ochranný účinok vychytávaním ROS [1]. V posledných rokoch priťahujú polyfenoly pozornosť pri prevencii rakoviny[17], kardiovaskulárnych dysfunkcií[18], neurodegeneratívnych ochorení [19] a starnutia [20]. Preto je hľadanie účinných antioxidantov naliehavou potrebou podpory ľudského zdravia.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Anneslea fragrans Stena. je vždyzelená rastlina, ktorá sa vyskytuje najmä na juhu Číny [21]. Okrem okrasného účelu sa listy A.fragrans používajú aj ako ľudový liek na liečbu horúčky, ochranu pečene, povzbudenie žalúdka a čriev v Číne a Kambodži [22], čo bolo zaznamenané v "Yunnan Simao Chinese Herbal Medicine" .Okrem toho boli listy tiež spracované ako čajový nápoj, ktorý je známy ako "Pangpo Tea". V predchádzajúcich správach [23] extrakt z A.fragrans preukázal antioxidačné a antimalarické účinky. Doteraz však neboli hlásené jeho antioxidačné fenolové zlúčeniny z A. vonných látok.

Účelom tohto výskumu teda bolo izolovať a identifikovať antioxidačné zlúčeniny z listov A. fragrans, ktoré sú zodpovedné za ich tradičné použitie na liečbu ochorení pečene. Štyri frakcie, dichlórmetánová frakcia (DF), etylacetátová frakcia (EAF), n-butanolová frakcia (BF) a zvyšková vodná frakcia (RWF) vodného etanolového extraktu, boli hodnotené z hľadiska ich celkového obsahu fenolov (TPC) a celkového obsahu flavonoidov. (TFC) a pre ich antioxidačnú kapacitu. Frakcia n-butanolu (BF) mala najvyššie TPC a TFC s najsilnejšou antioxidačnou aktivitou. Biologicky riadená frakcionácia BF umožnila čistenie zlúčenín. Okrem toho sa cytoprotektívny účinok izolovaných zlúčenín uskutočnil na oxidačný stres indukovaný peroxidom vodíka (H, O,) v bunkách ľudskej rakoviny pečene HepG2. Intracelulárna produkcia ROS a bunková apoptóza boli stanovené pomocou prietokovej cytometrie. Tento výskum teda poskytol cennú antioxidačnú fytochemickú zložku pre vývoj a využitie listov A.fragrans ako funkčného doplnku (zdravého čaju) v potravinárskom a zdravotníckom priemysle.

2. Výsledky a diskusia

2.1. Výnosová účinnosť frakcií a podfrakcií

Delenie kvapalina-kvapalina organickými rozpúšťadlami a kolónová frakcionácia sú dôležité techniky na obohatenie bioaktívnych zlúčenín zo surového extraktu [24]. Použitím rozdelenia kvapalina-kvapalina sa etanolový extrakt (CE) z listov A. fragrans postupne frakcionoval s dichlórmetánom, etylacetátom a n-butanolom, čím sa získali štyri frakcie (DF, EAF, BF a RWF). Zistilo sa, že percentá výťažku frakcií sa pohybujú od 11 do 27 percent. Najvyšší výťažok mala zvyšková vodná frakcia (RWF, 27 percent) a výťažky ostatných frakcií boli v poradí: n-butanolová frakcia (BF, 24 percent), etylacetátová frakcia (EAF, 21 percent), dichlórmetán frakcia (DF, 11 percent).

Zistilo sa, že percento výťažku subfrakcií (BF-A až E) sa mení od 3,82 do 48,4 percent. BF-E predstavoval najvyšší výťažok 48,4 percenta, za ním nasledoval BF-D (24,96 percenta), ktorý má výrazne vyššie výťažky ako ostatné frakcie.

2.2. HPLC analýza

Detekcia vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) sa ukázala ako účinná technika kvantitatívneho stanovenia. HPLC analýza odhalila, že BF mal najviac zlúčenín s najsilnejšou antioxidačnou aktivitou. Pod vedením antioxidačných testov a HPLC analýzy sa antioxidačná frakcia ďalej chromatografovala na izoláciu subfrakcií. BF sa podrobil kolóne s hydratovanou živicou D101, čím sa získalo päť subfrakcií (BF-A až E). HPLC analýza odhalila, že BF-Cto E má najviac antioxidačných zlúčenín. Biologicky riadená frakcionácia týchto frakcií (BF-C až E) umožnila čistenie siedmich čistých zlúčenín.

Ako je znázornené na obrázku 1, BF a sedem čistých zlúčenín sa profilovalo pomocou HPLC analýzy. Na základe porovnania s retenčnými časmi a UV absorpčnými krivkami bolo týchto sedem zlúčenín potvrdených retenčnými časmi pri 7,51 min (žieravý, 7), 7,92 min ((epi)-katechín, 6), 9,38 min (konfusozid, 1), 9,57 min. min((S)-naringenín-7-O- -D-glukopyranozid, 4), 10,32 min (vakcíny folín, 2), 12,64 min (2',3,4,4'-tetrahydroxydidihydrochalkón, 5) a 13,95 min (1-[4-(-D-glukopyranozyloxy)-2-hydroxyfenyl]-3-(4-hydroxy-3-metoxyfenyl) -1-propanón,3)(obrázok 1A). Medzi nimi zlúčeniny 1-6 patria medzi flavonoidy a zlúčenina 7 je benzochinoletanoid.

2.3. Celkový obsah fenolov (TPC) a celkový obsah flavonoidov (TFC)

Listy A.fragrans sa tradične používajú ako spracovaný zdravotný čaj a bolo preukázané, že sú dobrým zdrojom fenolov a flavonoidov [25]. Podľa spektrofotometrických testov boli TPC a TFC testované v rôznych frakciách a subfrakciách z listov A. fragrans. Ako je uvedené v tabuľke 1, BF mala najvyššiu hodnotu TPC s 238,12 ± 12.05 mg GAE/g extraktu nasledovaného EAF. DF vykazoval najnižšiu hodnotu TPC ako 66,52 ± 0,57 mg GAE/g extraktu. Podobne boli najvyššie koncentrácie TFC tiež zistené v BF s hodnotou TFC 165,19 ± 5,21 mg RE/extrakt. Pokiaľ ide o RWF a EAF (66,92 ± 1,38 a 116,12 ± 2,89 mg GAE/extrakt), mali tiež nižšie koncentrácie TFC ako extrakt BF (165,19 ± 5,21 mg RE/g extrakt), zatiaľ čo DF mal najnižšiu koncentráciu TFC ako 47,94 ± 2,84 mg RE/g extraktu. Obsah TPC a TFCin BF bol približne štyrikrát vyšší ako obsah v DF.

Údaje znázorňovali prítomnosť najvyššieho TPC a TFC v BF-E s hodnotami ako 262,03 ± 1,72 mg GAE/g extraktu; 180,52 ± 6,30 mg extraktu RE/g, v uvedenom poradí, nasledovaného BF-D (219,84 ± 4,01 a 157,01 ± 2,50 mg extraktu RE/g, v tomto poradí), BF-C (210,69 ± 6,31 a 151,01 ± 4,33 mg extraktu RE/g, v uvedenom poradí), zatiaľ čo BF-B a BF-A mali najnižšie hodnoty TPC a TFC (tabuľka 1).

2.4. Antioxidačná aktivita

Väčšina polyfenolov, najmä flavonoidov a fenolových kyselín, sa využíva v populárnych antioxidačných potravinách (nutraceutiká) a predstavuje rad výhod pre človeka [17]. V našej predchádzajúcej štúdii sa ukázalo, že listy A.fragrans sú dobrým zdrojom polyfenolov[26]. Antioxidačná aktivita extraktu z listov A. fragrans a jeho fytochemikálie však zatiaľ neboli preskúmané. Kvôli rôznym mechanizmom antioxidačnej reakcie sa skombinovali tri testy ABTS, DPPH a FRAP na vyhodnotenie antioxidačnej aktivity frakcií a subfrakcií z listov A. fragrans.

Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>BF-D. Redukčná aktivita v teste FRAP odhalila, že BF-D mal najsilnejšiu antioxidačnú aktivitu, po ktorej nasledovali BF-C a BF-E. Je pozoruhodné, že tri subfrakcie (BF-C až E) vykazovali vyššiu antioxidačnú aktivitu ako materská frakcia (BF). Celkovo sa BF-C až E podrobili stĺpcovej chromatografii na izoláciu a identifikáciu antioxidačných fytochemikálií.

2.5. Antioxidačná aktivita izolovaných zlúčenín

Všetky izolované zlúčeniny (zlúčeniny 1-7) boli hodnotené na antioxidačnú kapacitu pomocou ABTS, aktivity zachytávania radikálov DPPH a antioxidačnej aktivity FRAP. Všetky údaje sú popísané v tabuľke 2. Najvyššiu antioxidačnú aktivitu vykazovali zlúčeniny 6 a 2, po ktorých nasledovala zlúčenina 5. Zlúčenina 4 vykazovala miernu antioxidačnú aktivitu a zlúčeniny 1, 3 a 7 sa považovali za neaktívne s aktivitami na zachytávanie radikálov ABTS a DPPH nižšími ako 200 μmol TE/g extrakt. Pri použití Vc (aktivity zachytávania radikálov s 2932,91 ± 93,63 a 1 873,56 ± 121,68 umol TE/g extraktu, v danom poradí) ako pozitívnej kontroly, zlúčenina6 mala najsilnejšiu antioxidačnú aktivitu v testoch ABTS a DPPH na zachytávanie radikálov s 1580,307 ± 89,3 μmol ± . TE/g extrakt (str<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

Okrem toho, vzťah medzi štruktúrou a aktivitou antioxidantov flavonoidov (1-6) je diskutovaný rôznymi stupňami inhibičných účinkov. Zlúčenina 2 vykazovala väčšiu antioxidačnú aktivitu ako zlúčeniny 1, 3 a 5, čo naznačuje, že 3,{8}}dihydroxyskupiny v dihydrochalkónoch v 2 môžu hrať rozhodujúcu úlohu proti ABTS, aktivite zachytávania radikálov DPPH a antioxidantu FRAP a glukózová časť substituovaná na C-4'v 2 môže hrať dôležitú úlohu pri jej antioxidačnej kapacite [4]. Okrem toho zlúčenina 6 vykazovala najvyššiu antioxidačnú aktivitu v porovnaní s inými zlúčeninami, čo naznačuje, že flavan-3-oly (katechín) pravdepodobne vykazujú lepšiu aktivitu na zachytávanie radikálov ako dihydrochalkóny a flavanóny [27]. Stručne povedané, zlúčeniny 2, 5 a 6 s dobrou antioxidačnou aktivitou boli v ďalšej štúdii ďalej vybrané pre cytoprotektívne účinky proti oxidačnému stresu H2O2.

2.6. Vzťah medzi antioxidačnou aktivitou a obsahom TPC/TFC

Koncentrácie TPC a TFC vysoko korelovali s antioxidačnou aktivitou z hodnôt FRAP (r{0}},982 a 0,977) a ABTS (r=0,959 a 0,965). Korelačná matica tiež ukázala silnú koreláciu medzi hodnotami ABTS a FRAP (r =0,992). Ďalej bola vykonaná multivariačná analýza (PCA), ktorá bola extrahovaná z údajov v tabuľke 1. Ako je znázornené na obrázku 2, PCA vysvetlila 94,44 percenta celkovej variácie, v ktorej PC1 predstavovalo 84,73 percenta rozptylu a PC2 predstavovalo 9,71 percenta. Testy FRAP, ABTS a DPPH s EAF a RWF sú umiestnené v pravých horných kvadrantoch a koncentrácie TPC a TFC s BF a BF-Cto E sú umiestnené v pravých dolných kvadrantoch v pozitívnych skóre PC1. Medzitým sú DF a BF-A až B s nízkymi koncentráciami TPC a TFC umiestnené pozdĺž osi negatívnych skóre PC1. Tieto zistenia ukázali, že koncentrácie TPC a / alebo TFC sú úzko spojené s antioxidačnou kapacitou a čím vyššie sú koncentrácie TPC alebo TFC vo frakciách a subfrakciách, tým vyššie sú hodnoty ich antioxidačnej kapacity. Tieto výsledky ukázali, že vysoký obsah fenolov a flavonoidov v rôznych frakciách a podfrakciách listov A. fragrans môže prispieť k antioxidačnej aktivite.

Obrázok 2. Analýza PCA na celkové fenolické látky, flavonoidy a antioxidačnú aktivitu. Prostriedky s rôznymi písmenami označujú významné rozdiely (s<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules