Akútne od dávky závislé neuroprotektívne účinky poly(pro-17 estradiolu) v myšom modeli poranenia kontúzie chrbtice

Abstraktné

17 -Estradiol (E2) poskytuje neuroprotekciu v predklinických modeloch poškodenia miechy, keď sa podáva systémovo. Cieľom tejto štúdie bolo aplikovať E2 lokálne na poranenú miechu počas trvalého trvania s použitím poly(pro-E2) filmových biomateriálov.

Keď sa ľudia dozvedajú viac o poranení miechy, začíname si uvedomovať, aký vplyv má na fyzické a duševné zdravie ľudí. Hoci poranenia miechy môžu spôsobiť mnohé nepriaznivé účinky, ich vplyv na pamäť sa dá našťastie kontrolovať.

Najprv si musíme ujasniť, čo je poranenie miechy. Miecha je nerv chránený v chrbtici, ktorý je zodpovedný za prenos pokynov z mozgu do rôznych častí tela. Ak dôjde k poraneniu miechy, niektoré časti tela stratia dobré spojenie s mozgom, čo má za následok ovplyvnený pohyb končatín, pocit a autonómnu kontrolu.

Poranenia miechy môžu mať určitý vplyv na pamäť ľudí, najmä v počiatočných štádiách rehabilitácie pacientov s poranením miechy. Poranenia miechy môžu spôsobiť zhoršenie pozornosti, pracovnej pamäte a schopnosti spracovávať emócie, čo ovplyvní pamäťovú schopnosť osoby.

Tieto negatívne vplyvy sa však budú postupne znižovať, keď pacienti podstúpia rehabilitačnú liečbu. Pacienti si môžu zlepšiť pamäť účasťou na pamäťových hrách a iných kognitívnych tréningoch. Fyzická rehabilitácia zároveň prispieva aj k obnove motorických a zmyslových funkcií tela, čím sa zlepšujú emocionálne a kognitívne funkcie.

Pacientov s poranením miechy by sme mali povzbudzovať k aktívnej účasti na rehabilitačnej liečbe a zotrvaniu v rehabilitačných tréningoch na zlepšenie fyzického a duševného zdravia. Verte prosím, že pomocou správneho poznania a pooperačnej liečby môžu pacienti prekonať vplyv poranenia miechy na pamäť a pokračovať v aktívnom živote. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov, ktoré sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže Cistanche tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, aby mozog získal dostatočnú výživu a energiu, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Po kontuzívnom poranení miechy u dospelých samcov myší boli poly(pro-E2) filmy implantované subdurálne a neuroprotekcia bola hodnotená pomocou imunohistochémie 7 dní po poranení a implantácii. V týchto štúdiách poly(pro-E2) filmy mierne zlepšili neuroprotekciu bez ovplyvnenia zápalovej odpovede v porovnaní so zranenými kontrolami.

Na zvýšenie uvoľnenej dávky E2 boli vyrobené poly(pro-E2) filmy uvoľňujúce bolus začlenením neviazaného E2 do poly(proE2) filmov.

V porovnaní so zranenými kontrolami však poly(pro-E2) filmy uvoľňujúce bolus významne nezvýšili neuroprotekciu ani neobmedzili zápal 7 alebo 21 dní po poranení. Budúca práca sa zameria na vývoj poly(pro-E2) biomateriálov schopných presnejšie uvoľňujúce terapeutické dávky E2.

ÚVOD

Traumatické poranenie miechy (SCI) je vysiľujúci stav, ktorý v Spojených štátoch amerických každý rok postihne viac ako 18{1}} ľudí1, pričom celosvetová prevalencia SCI sa odhaduje na 236 až 1 009 na milión.2

Pacienti postihnutí SCI trpia závažnými neurologickými deficitmi vrátane straty citlivosti, zhoršenej funkcie čriev/močového mechúra a paralýzy.3,4 Primárny dopad na miechu vedie k smrti neurónov v mieste poranenia, čo sa ďalej zhoršuje niekoľkými sekundárnymi kaskádami poranení zahŕňajúcimi astrocyty a makrofágy .

V priebehu času tieto astrocyty vytvoria gliálnu jazvu, ktorá bráni rozšíreniu axónov za okraj lézie.5 Doteraz neexistujú žiadne neuroprotektívne lieky schválené FDA na liečbu SCI.

Výskum trvajúci niekoľko desaťročí sa zameral na systémové podávanie biomolekúl s cieľom zabrániť strate neurónov v dôsledku sekundárneho poškodenia a/alebo podporiť regeneráciu axónov, čo v konečnom dôsledku vedie k obnoveniu stratenej funkcie.6 Jedna biomolekula, ktorá preukázala významný prísľub v predklinických modeloch SCI, je ženská pohlavný hormón, 17 -estradiol (E2).

Podávanie E2 je všeobecne prospešné pre centrálny nervový systém tým, že znižuje zápal,7–9 zmierňuje reaktivitu gliových buniek,10 obmedzuje oxidačný stres11–14 a zmierňuje glutamátom indukovanú excitotoxickú neurónovú smrť.15 E2 zlepšuje funkčnú obnovu v rôznych modeloch SCI na hlodavcoch.10, 16,17 Je zaujímavé, že viacdávkové systémové podávanie E2 indukuje funkčné zotavenie rýchlejšie18,19 v porovnaní so zvieratami, ktoré dostali iba jednu dávku.17

Pretože E2 podporuje funkčnú obnovu efektívnejšie prostredníctvom režimov s viacerými dávkami, naším cieľom bolo stabilne uvoľňovať E2 lokálne v mieste poranenia (aby sa predišlo akýmkoľvek mimocieľovým účinkom), aby sa obišli problémy vyplývajúce z viacerých dávok/systémových injekcií E2.

Na tento účel sme použili stratégiu poly(prekurzorového) biomateriálu, v ktorej bolo natívne liečivo (E2) najprv funkcionalizované reaktívnymi alylovými skupinami a potom polymerizované pomocou fotoiniciovanej adície tiol-énového radikálu s flexibilným oligo-(etylénglykol)ditiolom, ako už bolo opísané. .20 Získali sme polymérne reťazce s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré pozostávajú z E2 proliečiva ako opakujúcej sa jednotky v polyméri.

Pri hydrolytickej degradácii polymér postupne uvoľňuje E2 do okolitého média. Jedinými ďalšími vedľajšími produktmi z tohto uvoľňovania sú oxid uhličitý a oligo(etylénglykol) (oEG) (obrázok 1). Poly(pro-E2) reťazce vyrobené do filmov alebo mikrovlákien môžu uvoľňovať E2 v nanomolárnych koncentráciách in vitro v časovom rozmedzí mesiacov až rokov .20

E2 uvoľnený z týchto poly(pro-E2) skeletov je bioaktívny a tieto skelety podporujú neurotrofizmus a neuroprotekciu in vitro tým, že chránia neuróny pred oxidatívnym stresom vyvolaným peroxidom vodíka. Tu sme aplikovali poly(pro-E2) filmy na myšom modeli pomliaždeniny SCI, bezprostredne po poranení, a hodnotili sme ich neuroprotektívnu schopnosť in vivo.

Náš pôvodný dizajn poly(pro-E2) filmu akútne zvýšil neuroprotekciu (7 dní po poranení) v mieste poranenia bez ovplyvnenia zápalovej odpovede. Keďže poly(pro-E2) filmy uvoľňujú nanogramy E2 za deň, vyvinuli sme inú stratégiu uvoľňovania, kde bol neviazaný E2 začlenený do poly(pro-E2) matrice. Predpokladali sme, že bolusové uvoľnenie neviazaného E2 môže poskytnúť ďalšie neuroprotektívne výhody.

Poly(pro-E2) filmy uvoľňujú E2 nárazovým spôsobom, po ktorom nasleduje predĺžené uvoľňovanie E2 z polyméru pri nižších koncentráciách. Imunohistologické farbenie hodnotilo neuróny, astrocyty a makrofágy/mikroglie prítomné v mieste poranenia akútne (7 dní po poranení) a chronicky (21 dní po poranení) po SCI v prítomnosti týchto poly(pro-E2) filmov uvoľňujúcich bolus.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Poly(pro-E2) filmy uvoľňujú E2 v nanomolárnych koncentráciách, podporujú rast neurónov z ganglií dorzálnych koreňov a chránia neuróny pred oxidatívnym stresom vyvolaným peroxidom vodíka in vitro.20 Tu prezentovaná štúdia sa snaží určiť schopnosť poly(pro-E2) filmy na poskytnutie neuroprotekcie in vivo s použitím myšacieho modelu kontúzie SCI.

U dospelých samcov myší bola indukovaná stredná kontúzia SCI a bezprostredne po poranení sa poly(pro-E2) filmy umiestnili priamo nad poranenie (obrázok 2A). Aby sa zabezpečilo, že poly(pro-E2) filmy zostanú na svojom mieste po implantácii, poly(pro-E2) filmy naplnené rodamínom B sa implantujú do miechy zranených zvierat. Sedem dní po implantácii sa odobrali miechy a zobrazili sa pomocou svetelného mikroskopu (obrázok 2B). U všetkých zvierat zostali implantované poly(pro-E2) filmy naplnené rodamínom B na mieste, čím sa validoval implantačný protokol.

Aby sa otestovala schopnosť poly(pro-E2) filmov poskytnúť neuroprotekciu a zmierniť zápal, poly(pro-E2) filmy (bez rodamínu B) sa implantovali po poranení kontúzie chrbtice a miechy sa odobrali 7 dní po poranení a implantácii. Pozdĺžne rezy (hrúbka 10 μm) boli narezané, sústredené okolo epicentra poranenia a imunoznačené na vizualizáciu neurónov a makrofágov v mieche (obrázok 3).

Rezy boli označené pre NeuN, aby sa vyhodnotila prítomnosť neurónov a kvantitatívna analýza farbenia odhalila, že poly(pro-E2) filmy významne zvýšili NeuN pozitívnu oblasť okolo epicentra poranenia v porovnaní s poranenými kontrolami, ktoré nedostali filmové implantáty (obrázok 3A; p=0.0002). Dodatočné farbenie axónov pomocou NFH (neurofilamentový ťažký reťazec) tiež odhalilo akútny neuroprotektívny účinok implantovaných poly(pro-E2) filmov (obrázok 3B; p=0.0017).

Pozorovali sme, že táto zmena v neuroprotekcii nebola spôsobená zmenou apoptózy (kaspáza 3) v mieste poranenia (podporný obrázok S1; p=0.9966). Farbenie na aktivované makrofágy (CD68) tiež neodhalilo žiadne významné rozdiely medzi zvieratami ošetrenými poly(pro-E2) filmom a neošetrenými zvieratami (obrázok 3C; p= 0.7207).

Celkovo možno povedať, že poly(pro-E2) filmy mierne zvyšujú neuroprotekciu bez toho, aby menili zápalovú odpoveď. Poly(pro-E2) filmy akútne zvýšili hustotu neurónov o takmer 20 %, ale filmy nemali žiadne zjavné protizápalové účinky (na základe kvantifikácie plocha obsadená aktivovanými makrofágmi) (obrázok 3).

Tento nedostatok zníženia zápalu môže naznačovať, že protizápalové a neuroprotektívne dávky E2 sú odlišné a že obe neboli dosiahnuté súčasným zložením filmu.20 Predpokladali sme, že zvýšenie uvoľňovania E2 z poly(pro-E2) filmov môže akútne znížiť zápal a umožňujú silnejšiu neuroprotektívnu reakciu.

Na zvýšenie dávky akútne uvoľneného E2 boli poly(pro-E2) filmy modifikované tak, aby uvoľnenie bolusu E2 nastalo bezprostredne po implantácii. Po bolusovom uvoľnení E2 by nasledovala degradácia polyméru na uvoľnenie E2 v rovnakej koncentrácii ako predtým. Vyššie opísaný experiment sa opakoval s použitím týchto poly(pro-E2) filmov uvoľňujúcich bolus a neuroprotekcia a zápal sa hodnotili 7 dní po poranení (dpi).

Avšak namiesto ďalšej výhody poly(pro-E2) filmy uvoľňujúce bolus významne nezväčšili pozitívnu oblasť NeuN v porovnaní s poranenými, neošetrenými kontrolami (obrázok 4A; p=0,6770). Poly(proE2) filmy uvoľňujúce bolus zvýšili expresiu CD68, ale zvýšenie nebolo štatisticky odlišné (p= 0.1780).

V prítomnosti poly(pro-E2) filmov uvoľňujúcich bolus v dôsledku zvýšenej expresie GFAP (astrocyty) a Iba1 (mikroglie) boli tiež pozorované rastúce trendy v gliálnej reaktivite a mikrogliálnom zápale; tieto zvýšenia však neboli štatisticky väčšie ako to, čo bolo pozorované u zranených, neliečených kontrol (p=0 0,3233 a p=0 0,3053, v tomto poradí). Celkovo možno povedať, že poly(pro-E2) filmy uvoľňujúce bolus nezvýšili neuroprotekciu a reaktivita astrocytov a prítomnosť makrofágov/mikroglií sa neznížili, ako sa pôvodne predpokladalo.

Keďže rozdiely medzi zranenými, neošetrenými zvieratami a zranenými zvieratami ošetrenými poly(proE2) filmom uvoľňujúcim bolus neboli pozorované v akútnom časovom bode 7 dpi, na ďalšie skúmanie sa vybral chronický časový bod, pretože filmy poly(pro-E2) môžu uvoľňovať E2 dlhodobo.20 Vyššie opísaný experiment sa opakoval s poly(pro-E2) filmom uvoľňujúcim bolus, ale zvieratá sa hodnotili chronicky pri 21 dpi (obrázok 5).

Miechy boli označené pre rovnaké typy buniek, ktoré boli uvedené vyššie. Po analýze bola tendencia k zvýšeniu plošného podielu NeuN u zvierat s implantovaným poly(pro-E2)filmom uvoľňujúcim bolus v porovnaní s poranenými, neliečenými zvieratami (obrázok 5A; p=0,0897) Okrem toho boli pozorované trendy, keď poly(pro-E2) filmy uvoľňujúce bolus znížili plošný podiel expresie CD68 a GFAP v porovnaní s údajmi z kontrol neliečených zranených zvierat (obrázok 5B, C; p=0.0859 a p=0.2780).

Žiadny z trendov sa však štatisticky nelíšil. Na druhej strane, tkanivové rezy označené Iba1 zo zvierat liečených poly(pro-E2) uvoľňujúcim bolus vykazovali zvýšenú expresiu v porovnaní s údajmi z neliečených zranených kontrol (p < 0,0001). Naša predchádzajúca práca ukazuje, že poly(pro -E2) filmy naliate na krycie sklíčka s rozmermi 15 mm × 15 mm uvoľňujú približne 266 ng E2 za deň,20 čo znamená približne 2 ng E2 za deň z filmov (1 mm × 1,8 mm), ktoré sa tu používajú. Poly(pro-E2) filmy uvoľňujúce bolus uvoľňujú ďalších 40 ug neviazaného E2 akútne po implantácii.

Výskum zameraný na použitie E2 v modeloch SCI na hlodavcoch ukazuje, že nízka dávka estrogénu (10 ug/kg) podávaná intravenózne tlmí reaktívnu gliózu a poskytuje neuroprotekciu, pričom zmierňuje zápalové udalosti, inhibuje apoptózu a zvyšuje angiogenézu.21 Naopak, vysoké systémové dávky estrogénu nežiaduce účinky, medzi ktoré patrí zvýšený výskyt hlbokej žilovej trombózy a rakoviny22,23 a rozvoj ženských fyzických čŕt u mužov. Toto je pozoruhodné, pretože väčšina výskumu E2 sa zamerala na dodávanie E2 systémovo buď intravenózne alebo intraperitoneálne.

Vzhľadom na bezpečnostné obavy spojené s používaním vysokých dávok E2 systémovo je dôležité optimalizovať koncentráciu E2 na lokálne dodanie do poškodenej miechy, aby sa predišlo vedľajším účinkom. K dnešnému dňu iba jedna štúdia dodala E2 z biomateriálu pomocou nanočastíc na fokálne dodanie E2 (2,5 ug alebo 25 ug). Uvoľňovanie z nanočastíc rýchlo akútne znížilo zápal v potkanom modeli kontúzie SCI.9 Nedostatok štatisticky významnej odpovede v našich údajoch (obrázky 4 a 5) môže byť spôsobený nerovnováhou v množstve E2, ktoré dodávame lokálne do miechy príliš veľa E2 (40 ug) sa uvoľňuje akútne, zatiaľ čo veľmi málo (2 ng) sa uvoľňuje chronicky.

Hoci to, čo pozorujeme z týchto údajov, sú skromné ​​trendy, táto štúdia zdôrazňuje dôležitosť dávkovania E2 na podporu neuroprotekcie in vivo. Zníženie počiatočnej dávky E2 a úprava kinetiky degradácie biomateriálu poly(pro-E2) by mohlo pomôcť zmierniť tento problém a potenciálne poskytnúť lepšie neuroprotektívne výsledky.

Hoci táto štúdia bola vykonaná výlučne u mužov, je dôležité posúdiť účinok týchto poly(pro-E2) filmov u oboch pohlaví, aby sa stanovil platný translačný potenciál pre tento biomateriál. Výskum ukázal, že po SCI môžu byť zvýšené hladiny estrogénu u žien čiastočne zodpovedné za ich zlepšené funkčné výsledky v porovnaní s mužmi.24 Keďže u žien je zvýšená prítomnosť estrogénu, každá biomateriálová stratégia využívajúca estrogén musí túto zvýšenú hladinu brať do úvahy a modifikovať materiál. kinetiky uvoľňovania, aby sa zabezpečilo, že podaná dávka zostane rovnaká pre mužov a ženy.

METÓDY

Výroba poly(pro-E2) fólií.

Poly(pro-E2) polymér P1 bol syntetizovaný a charakterizovaný tak, ako bolo podrobne opísané vyššie.20 Polymér má hmotnostný priemer molekulovej hmotnosti MW ~ 80 kDa a disperzitu Đ ~ 3 podľa gélovej permeačnej chromatografie (GPC). Poly(pro-E2)filmy boli vyrobené rozpustením polyméru v chloroforme (5 % hmotn./hmotn.; polymér/chloroform), naliatím roztoku na sklenené krycie sklíčka s rozmermi 15 mm × 15 mm (100 μl roztoku na krycie sklíčko) a ich ponechaním. sušiť cez noc vo vákuu (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Na vytvorenie poly(pro-E2) filmov s nenaviazaným E2 boli filmy vyrobené pridaním nenaviazaného E2 (Abcam, Cambridge, MA) do roztoku polyméru (0,0625 hmotn. %/hmotn.; E2/chloroform) pred odlievaním roztok na krycie sklíčka. Pred implantáciou boli krycie sklíčka s filmami sterilizované ultrafialovým (UV) žiarením počas 30 minút a filmy boli odlúpnuté z krycích sklíčok v sterilnej biologickej bezpečnostnej skrini. Poly(pro-E2) filmy sa potom narezali na kúsky s rozmermi 1 mm x 1,8 mm, vhodné na implantáciu do dospelej myši, ako je opísané nižšie.

Kontúzia Poranenie miechy a implantácia poly(pro-E2) filmov.

Všetky postupy chirurgickej a pooperačnej starostlivosti boli schválené Rensselaerovým polytechnickým inštitútom a Výbormi pre inštitucionálnu starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat (IACUC) na Štátnej univerzite v Ohiu. Na vyvolanie pomliaždeniny SCI boli dospelí samci myší C57BL/6 (vo veku 10- až 12-týždeň), zakúpení od Jackson Laboratory (číslo akcie 000664; Bar Harbor, ME), anestetizovaní intraperitoneálnou injekciou ketamínu (80 mg/kg) a xylazínu (10 mg/kg). Chrbát zvierat bol oholený a asepticky pripravený s použitím 70 % etanolu a betadínu.

Po umiestnení zvieraťa na vyhrievaciu podložku udržiavanú pri 37 stupňoch sa otvorili kožné a svalové vrstvy, aby sa obnažil chrbtica, a na hrudnom deviatom (T9) stavci sa vykonala dorzálna laminektómia, aby sa obnažila miecha. Na tejto úrovni bola vyvolaná mierna (75 kedyn) kontúzia SCI pomocou impaktora Infinite Horizons (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Po dosiahnutí hemostázy sa tvrdá plena otvorila (obrázok 2) a pod tvrdú plenu a nad miechu sa umiestnil poly(pro-E2) film alebo bolus uvoľňujúci poly(pro-E2) film (1 mm x 1,8 mm), ktorý zakrýval miechu. miesto poranenia. U kontrolných zvierat sa tvrdá plena otvorila, ale poly(pro-E2) filmy sa neimplantovali. Svalové vrstvy sa potom uzavreli pomocou sterilných stehov a koža sa uzavrela pomocou sterilných kovových svoriek na rany.

Myši dostali 2 ml sterilného fyziologického roztoku injikované subkutánne a vrátili sa do svojich klietok a umiestnili na ohrievač sklíčok nastavený na 37 stupňov cez noc. Aby sa zabezpečila správna hydratácia a aby sa zabránilo infekciám, myšiam sa podávali subkutánne injekcie 1–2 ml sterilného fyziologického roztoku a Gentocin (1 mg/kg) denne počas prvých 5 dní po poranení (dpi). Počas trvania experimentov boli močové mechúre manuálne exprimované dvakrát denne. Všetky zvieratá boli chované v konvenčných podmienkach v 12-hodinovom cykle svetlo-tma s ad libitným prístupom k potrave a vode.

Zber tkaniva.

V určených terminálnych časových bodoch 7 alebo 21 dpi bola myšiam injikovaná letaldóza ketamínu/xylazínu (1,5-násobok chirurgickej dávky) a transkardiálne perfundované 0.1 Mfosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS; pH 7,4) nasledovaný 4 % paraformaldehydom (PFA; pH 7,4). Miechy sa odstránili, následne sa fixovali 2 hodiny v 4 % PFA a potom sa preniesli do 0 0,2 M fosfátového pufra (PB; pH 7,4) cez noc.

Miechy boli chránené kryoprotekciou v 30% sacharóze počas 48 hodín pri 4 stupňoch a potom boli blokované do 10 mm segmentov sústredených okolo miesta poranenia s dorzálnymi stĺpcami smerom nahor. Tieto rezy boli vložené do média Tissue-Tek s optimálnou teplotou rezania (VWR International, Radnor, PA) a rýchlo zmrazené na suchom ľade. Všetky miechy boli narezané na 10 μm na kryostate Microm HM505E, umiestnené na sklíčkach ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a potom sa skladujú pri teplote -20 stupňov, kým sa nepoužijú na imunofarbenie.

Imunohistochémia a kvantifikácia.

Sklíčka sa rozmrazili na ohrievači sklíčok počas 1 hodiny a potom sa 3-krát opláchli v 0,1 MPBS. Aktivita endogénnej peroxidázy bola zastavená inkubáciou sklíčok v 6% H202 zriedenej v metanole počas 15 minút pri teplote miestnosti. Po trojnásobnom premytí v 0,1 M PBS boli rezy inkubované s 4 % BSA a 0,1 % Triton X-100 v 0,1 M PBS počas 1 h, po ktorej nasledovala cez noc inkubácia primárnych protilátok pri 4 stupňoch alebo RT (tabuľka 1).

Sklíčka sa inkubovali s vhodnými biotinylovanými sekundárnymi protilátkami (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Na vizualizáciu naviazanej protilátky boli sklíčka inkubované s Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) počas 1 hodiny a vyvíjané so substrátom ImmPACT3,3'-diaminobenzidín (DAB) alebo Vector SG (Vector Laboratories) počas 10 minút.

Rezy boli dehydratované postupnými 2 x 2 minútovými inkubáciami v 70% a 90% etanole, 2 x 3 minúty v 100% etanole, nasledovali 3 x 3 minúty v Histoclear a nakoniec prekryté krycím sklíčkom Permount (ThermoFisher Scientific). Na kvantifikačnú analýzu sa použilo šesť rezov na zviera, vzdialených od seba 100 μm od poranenej miechy.

Imunooznačené rezy sa zobrazili pomocou zobrazovacieho mikroskopu Axioplan 2 vybaveného kamerou AxioCamdigital a softvérom AxioVision verzie 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Nemecko) a objektívom 5x.

Počet pozitívnych pixelov v každom z rezov sa spočítal pomocou softvéru na analýzu obrazu MIPAR (MIPAR, Worthington, OH), aby sa vypočítal percentuálny podiel pozitívnej plochy na rez. Priemerná percentuálna pozitívna plocha šiestich rezov na zviera bola vypočítaná pre každé zo škvŕn a zaznamenaná.

Štatistická analýza.

Všetky údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka. Štatistická analýza sa uskutočnila s použitím štatistického softvéru GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA). Vo všetkých experimentoch sa použilo 5–6 zvierat na skupinu, pochádzajúcich z najmenej dvoch rôznych šarží zvierat. Na testovanie rozdielov medzi kontrolnou a poly(pro-E2) filmovou skupinou sa použil Studentov t-test (obrázky 3, 4 a 5). Významnosť bola stanovená na p Menšie alebo rovné 0,05.

Doplnkový materiál

Doplnkový materiál nájdete vo webovej verzii na PubMed Central.

POĎAKOVANIE

Autori ďakujú Wenmin Lai za jej pomoc pri operáciách myší.

Financovanie

Táto práca získala podporu od štipendia Craig H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) a Paralyzed Veteransof America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) pre MKG a od NIH R01 (Grant NS092754) a od NIH R01 (Grant NS092754) a od Rady pre kontrolu poranení miechy v štáte New York Inštitucionálna podpora Grant C32 R245GG Všetky práce na zvieratách boli vykonané s pomocou chirurgického oddelenia neurovedy na Štátnej univerzite v Ohiu s podporou grantu NINDS P30NS104177.

LITERATÚRA

(1). Národné štatistické centrum pre poranenia miechy. (2020) Fakty a čísla o poranení miechy na aGlance, University of Alabama v Birminghame, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J a Brown D (2011) Globálna mapa pre epidemiológiu traumatického poranenia miechy: Smerom k živému úložisku údajov na prevenciu zranení. Miecha. 49, 493-501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Poranenie miechy – minulosť, súčasnosť a budúcnosť. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ a Wilson DA (2010) Celoštátne vyšetrovanie medicínsky navštevovaných nepriaznivých zdravotných stavov osôb s poranením miechy. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221-231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J a Miller JH (2004) Regenerácia za gliálskou jazvou. Nat. Neurosci. 5 (2), 146-156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK a Banik NL (2013) Poranenie miechy: Prehľad súčasnej terapie, budúcich liečebných postupov a základných vedeckých hraníc. Neurochem. Res. 38, 895-905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M a Beyer C (2018) Estrogén zmierňuje lokálnu expresiu a aktiváciu zápalu po poranení miechy. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG a Yune TY (2018) Estrogén zmierňuje neuropatickú bolesť vyvolanú po poranení miechy inhibíciou mikroglie a aktivácie astrocytov. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Basis Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A a Banik N (2015) Nanočasticový estrogén pri poranení miechy u potkanov vyvoláva rýchle protizápalové účinky v plazme, cerebrospinálnej tekutine a tkanive.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK a Banik NL (2010) Estrogénová liečba chronického poranenia miechy po úraze zlepšuje lokomotorickú funkciu u potkanov. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H a Akaike A (2001) Negenomická antiapoptická transdukcia signálu estrogénom v kultivovaných kortikálnych neurónoch. J. Neurosci. Res. 64 (5), 466-475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK a Banik NL (2003) Estrogén ako neuroprotektívne činidlo pri liečbe poranení miechy. Ann. NY Acad. Sci. 993,125-133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com