Adenovírusová vakcína obsahujúca skrátený SARS-CoV-2 vrcholový proteín S1 podjednotky vedie k špecifickej imunitnej odpovedi u myší

AbstraCT:Vývoj účinnej a bezpečnej vakcíny proti koronavírusovému ochoreniu 2019 (COVID-19) je kľúčovým prístupom k zvládnutiu pandémie koronavírusu 2 závažného akútneho respiračného ochorenia (SARS-CoV-2) vzhľadom na súčasné podmienky. V tejto štúdii sme vytvorili skrátený segment optimalizovaného génu spike SARS-CoV-2 (2043 bp, nazývaný S1), ktorý bol schopný kódovať skrátený proteín S1. Proteín bol testovaný, aby sa zistilo, či môže vyvolať účinnú imunizáciu u myší proti SARS-CoV-2. Prítomnosť proteínu S1 bola potvrdená imunofluorescenciou a Western blotovaním. Adenovírusová vakcína nesúca fragment génu S1 (Ad-S1) sa myšiam podávala intramuskulárne štyrikrát počas 4 týždňov. Humorálna imunita proti proteínu SARS-CoV-2 S1 bola preukázaná u všetkých imunizovaných myší. Sérum z imunizovaných myší preukázalo vynikajúcu antiinfekčnú aktivitu in vitro. Po očkovaní Ad-S1 bola u myší pozorovaná silná humorálna imunitná odpoveď proti SARS-CoV-2, čo naznačuje, že vakcína proti adenovírusu môže pomôcť pri vývoji vakcín proti SARS-CoV-2 a iným geneticky odlišným vírusy.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kľúčové slová: SARS-CoV-2; vakcíny; adenovírusový vektor; gén S1; imunita

1. Úvod

Koronavírusová choroba 2019 (COVID-19) sa často spája so zlyhaním viacerých orgánov a vysokou úmrtnosťou [1] a predstavuje veľkú hrozbu pre verejnú bezpečnosť na celom svete. K 15. júlu 2022 pandémia COVID{5}} celosvetovo pretrváva, pričom Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) nahlásila 557 917 904 potvrdených prípadov vrátane 6 358 899 úmrtí. Okrem toho bolo k 11. júlu 2022 podaných celkovo 12 130 881 147 dávok vakcíny. Preto je navrhovanie a vývoj nových vakcín proti koronavírusu (nCoV) veľmi dôležité a je jednou z hlavných priorít globálneho zdravia. Proteín S je kľúčovým faktorom pri vstupe SARS-CoV-2 závažného akútneho respiračného ochorenia koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) do hostiteľských buniek [2,3]. Proteín sa viaže na hostiteľský receptor a umožňuje vírusu bezproblémový vstup do hostiteľskej bunky [4]. N-viazané glykány vyčnievajú z povrchu triméru a značne zdobia proteín S, čím ovplyvňujú skladanie proteínu S, humorálnu imunitu a spracovanie proteázy hostiteľskej bunky [5]. SARS-CoV-2 S proteín má nižšiu N-glykánovú hustotu ako iné ľudské patogénne koronavírusom indukované S proteíny [6]. Preto môže byť proteín S vysoko imunogénny a je hlavným cieľom neutralizačných protilátok. Proteín S má tri štrukturálne domény, medzi ktorými je najdôležitejším povrchovým antigénom proteínu S1 doména S1 [4]. Kvôli obtiažnosti produkcie veľkých rekombinantných proteínov (extracelulárna doména proteínu S je asi 1300 aminokyselín) a riziku zosilnenia infekcie závislého od protilátok (ADE) sa S1 (asi 700 aminokyselín) a jeho doména viažuca receptor (RBD, asi 200 aminokyselín) sú všeobecne považované za najatraktívnejšie potenciálne ciele pre vakcínu proti koronavírusu [7,8]. Ľudský adenovírus sérotyp 5 (HAdV-C5) je široko používaný v základnej virológii ako génová terapia a vektor na dodávanie vakcín [9]. HAdV-C5 má prirodzenú diverzitu a môže parazitovať na väčšine hostiteľov, čo tvorí základ pre rozvoj pokusov na zvieratách. Rekombinantné adenovírusové vektory s replikovateľnosťou a replikačnými defektmi skonštruované z HAdV-C5 boli široko používané pri podávaní vakcín a génovej terapii [9,10]. V súčasnosti boli adenovírusy schválené ako vakcíny proti akútnym respiračným infekciám a bolo vykonaných mnoho testov takýchto vakcín, napríklad proti malárii a HIV-1 [9]. V tomto článku popisujeme ľudskú replikačne deficitnú adenovírusovú vakcínu proti SARS-CoV{56}} a jej prípravu a aplikáciu. V tejto štúdii bola adenovírusová vakcína skonštruovaná nasledovne: vektorom bol ľudský replikačne defektný adenovírus HAdV-C5 s deléciou E1 a E3, kostrovým plazmidom bol rekombinantný adenovírus s pBHGlox∆E1,3Cre, zbaľovacia bunková línia boli bunky HEK293, a cieľovým génom bol skrátený gén proteínu S1 SARS-CoV-2. Expresia proteínu S1 vo vakcíne bola identifikovaná pomocou Western blot a imunofluorescenčných testov. Aby sa určila kvalita imunitných reakcií vyvolaných kandidátmi vakcín na báze hrotov, bola podrobne skúmaná postvakcinačná protilátková odpoveď. Imunitný prínos vakcíny bol hodnotený testom na viazanie protilátok (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]) a testom neutralizačných protilátok. Naše zistenia poskytujú základ pre vývoj a hodnotenie vakcín a liečby COVID{73}} na základe proteínu S1.

2. Materiály a metóda

2.1. Bunky a zvieratá

V tejto štúdii sa použili bunkové línie opičích obličkových buniek HEK293 a Vero E6. Obe bunkové línie rástli v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) doplnenom 2 % fetálnym bovinným sérom (FBS) a 1 % penicilínom a streptomycínom pri 37 °C s 5 % CO2 a nasýtenou vlhkosťou. Dvadsať samíc myší C57BL/6 (6–8 týždňov) bolo zakúpených od Zhejiang Animal Experimental Center, provincia Zhejiang. Myši boli náhodne rozdelené do dvoch skupín s 10 myšou v každej skupine. Jedna skupina bola imunizovaná (100 ul intraperitoneálna injekcia) vektorom Ad5 exprimujúcim spike proteín SARS-CoV-2 (Ad5-S) a druhá skupina PBS (100 ul intraperitoneálna injekcia) ako kontrola. Celkové množstvo vírusu bolo 5 x 109 VP Všetky myši boli imunizované intramuskulárnou injekciou D0/D14 [11,12]. V D14 sa odobrala periférna krv 100 ul, sérum sa oddelilo a druhá injekcia sa podala dve hodiny po odbere krvi. V D28 sa krv odobrala retroorbitálnou punkciou a oddelilo sa sérum. Väzbové protilátky sa detegovali 3 dni po každom odbere krvi, neutralizačné protilátky sa detegovali 7 dní po každom odbere krvi a cytokíny sa detegovali 7 dní po druhom odbere krvi. Všetky myši boli usmrtené; všetky testy boli vykonané v prísnom súlade s "Pokynmi pre starostlivosť a používanie pokusných zvierat Čínskej ľudovej republiky" a schválené Etickou radou univerzity Zhejiang Shuren.

2.2. Vakcíny

Všetky kmene SARS-CoV-2 použité v tejto štúdii boli odobraté od pacientov s COVID-19 so súhlasom. Štátne kľúčové laboratórium pre diagnostiku a liečbu infekčných chorôb vyvinulo adenovírusovú vakcínu (bunka Vero, kmeň WuHan, číslo GISAID: EPI_ISL_415711) proti SARS-CoV-2 a následne vakcína bola vyrobená v súlade s úrovňou biologickej bezpečnosti (BSL). Špecifikácia vakcíny je 0,5 ml/dávka a obsahuje Tris, NaCl, trstinový cukor, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, absolútny etanol a proteín SARS-CoV-2 S1.

2.3. Konštrukcia rekombinantného adenovírusu

Sekvencia proteínu SARS-CoV-2 S1 (č. QRU91950.1) bola získaná od PubMed. Podľa génovej degenerácie bola optimalizovaná kodónová nukleotidová sekvencia vhodná na expresiu cicavčích buniek navrhnutá na základe predpokladu, že aminokyselinová sekvencia produktového proteínu kódovaného proteínom SARS-CoV-2 S1 zostala nezmenená. Celková dĺžka bola 2043 bp. 50 prekurzorová sekvencia bola syntetizovaná s aktivátorom tkanivového plazminogénu (tPA) a sekvencia kódujúca SARS-CoV-2 S1 aminokyselinu 2–688 a prekurzorová sekvencia tPA boli ligované. Kozakova sekvencia a reštrikčné miesto Spel sa pridali pred štartovací kodón a reštrikčné miesto Xbal sa pridalo za terminačný kodón. Nukleotidové sekvencie vyššie uvedených génov boli syntetizované a klonované do pUC18 spoločnosťou Sangon Biotech, aby sa získal klonovaný plazmid syntetického génu. Syntetizovaná sekvencia génu S1 a vektor pDC316 sa štiepili reštrikčnými endonukleázami Spel a Xbal. Cieľový fragment a vektor boli získané z gélu a spojené za vzniku kyvadlového plazmidu. Kyvadlový plazmid SARS-CoV-2 bol zabalený s skeletovým plazmidom adenovírusového systému AdMax pBHGloxd∆E1 a 3Cre kotransfekciou buniek HEK293. Primárny vírusový roztok sa získal po opakovanom zmrazení-rozmrazení a odstredení a vírus sa amplifikoval a kultivoval po čistení plakov.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Stanovenie titra adenovírusu

Bunky HEK293 v dobrom zdravotnom stave sa vybrali a resuspendovali, aby sa pripravila suspenzia buniek 5.0 × 105 buniek/ml, ktorá sa naočkovala na 24-jamkovú platňu (1 ml/jamku ) a kultivované pri 37 ◦C v prostredí s 5 % CO2. Vzorka bola sériovo nariedená desaťnásobne a zriedená vzorka (0,1 ml) 10-5 až 10-8 buniek bola naočkovaná na 24-jamkovú doštičku . Potom boli platne vystavené infekcii pri 37 ◦C s 5% CO2 počas 48 hodín. Následne sa kultivačné médium odstránilo, pridal sa vopred vychladený metanol (0,5 ml) a vzorky sa fixovali pri -20 °C počas 20 minút. Po fixácii boli vzorky premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a blokované 1% hovädzím sérovým albumínom (BSA, 0,2 ml) pri 37 °C počas 1 hodiny. Ďalej sa pridali primárne (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) a sekundárne (Kozí pAb k MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) protilátky a inkubovali sa 1 hodinu, počas ktorej PBS bola použitá na umývanie. Po inkubácii sa pridal novo pripravený pracovný roztok (0, 2 ml) a inkuboval sa 5 až 10 minút pri teplote miestnosti. Potom sa pracovný roztok zlikvidoval, vzorky sa premyli PBS a znova sa pridal PBS (1 ml). Bol vypočítaný priemerný počet pozitívnych buniek v mikroskopickom poli (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), kde sa vybral gradient s 5–50 pozitívnymi bunkami v zornom poli a náhodne sa vybralo najmenej päť oblastí na počítanie. . Vypočítal sa počet zorných polí v každej jamke 24-jamkovej platne. Potom sa titer vírusu vypočítal podľa nasledujúceho vzorca (1):

2.5. PCR v reálnom čase

Na detekciu expresie mRNA buniek HEK293 po vírusovej infekcii sme extrahovali medziproduktovú RNA podľa prevádzkových pokynov TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Celková RNA sa extrahovala s použitím TRIzol a spracovala sa DNázou I bez RQ1 RNázy (Promega, Madison, WI, USA), aby sa eliminovala zvyšková DNA. Komplementárna DNA (cDNA) sa získala reverznou transkripciou extrahovanej RNA s použitím súpravy PrimerScript™ RT reagent Kit s gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Japonsko). Fragmenty DNA sa generovali so špecifickými primérmi P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) a P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​cieľového génu (S1). Gén sa amplifikoval s primérmi P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) a P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) ako internou kontrolou (GAPHD).

2.6. Western Blot

Bunkový lyzát a supernatant sa oddelili elektroforézou na dodecylsulfátovom polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) a potom sa preniesli na polyvinylidénfluoridové (PVDF) membrány. Bloty sa vizualizovali pomocou zobrazovacieho zariadenia Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). V stručnosti, membrány sa preniesli do TBST (50 ml Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 ml], 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween -20) s 5 % odtučneným sušeným mliekom a pretrepávajte na odfarbovacom šejkri pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Membrány experimentálnej a kontrolnej skupiny boli odstránené z uzatváracieho roztoku a inkubované s primárnou protilátkou: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000), kat. #40591- T62, Sino Biological, Peking, Čína)] pri izbovej teplote. Primárne protilátky boli pretrepané a inkubované cez noc na odfarbovacej trepačke pri 4 °C. Blot sa prepláchol roztokom TBST a inkuboval sa 2 hodiny so sekundárnou protilátkou [kozí anti-králičí imunoglobulín G (IgG) H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Po opláchnutí sa bloty inkubovali 1 minútu so súpravou LumiBest ECL Substrate solution kit (kat. č. 4AW011-100, 4A Biotech) a potom sa pozorovali na zobrazovači.

2.7. Imunofluorescenčný test

Bunky HEK293 (3 x 106/jamka) sa naočkovali do 12-jamkových doštičiek. Po 48 hodinách boli bunky infikované adenovírusom obsahujúcim gén S1 (Ad-S1). Po 48 hodinách sa médium odsalo a bunky sa raz premyli PBS obsahujúcim 2% BSA a fixovali sa 15 minút metanolom, ktorý bol vopred ochladený 15 minút pri -20 °C. Po troch premytiach 2 % BSA v PBS boli bunky permeabilizované 0,5 % Tritonom X-100 počas 10 minút. Potom boli bunky blokované počas 1 hodiny s 2 ml 2% BSA, blokovací roztok bol odstránený a bunky boli trikrát premyté PBS. Následne sa do každej jamky pridali 2 ml primárnej protilátky [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] a inkubované pri teplote miestnosti počas 1 hodiny alebo 4 °C cez noc. Potom sa vzorka trikrát prepláchla 2 % BSA počas 5 minút na jedno opláchnutie. Ďalej sa do každej jamky pridali 2 ml sekundárnej protilátky [kozia anti-králičia IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. č. 550037, ZenBio)] a inkubovali sa pri teplote miestnosti 1 hodinu. Následne boli vzorky trikrát premyté 2% BSA počas 5 minút na jedno opláchnutie. 40,6-diamidino-2-fenylindolový (DAPI) roztok (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, kat. č. S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) sa pridal do každej jamky a nechala reagovať 10 minút v tme. Analýza sa pozorovala pomocou zobrazovacieho systému EVOS™ M7000 (kat. č. AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S proteín (1 ug/ml) bol cez noc potiahnutý v 96-jamkových doštičkách (100 ul/jamka) s 0. 05 M bikarbonátový pufor. Po premytí PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween-20 pridajte vodu na 1000 ml) päť krát sa pridal blokovací roztok a inkubovalo sa pri 37 °C počas 1 hodiny. Vzorka séra sa zriedila a pridala do každej jamky (100 ul/jamku). Po 1 hodine inkubácie pri 37 °C boli vzorky päťkrát premyté PBST. Pridala sa primárna protilátka [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] a inkubovala sa 1 hodinu, potom vzorky sa päťkrát premyli PBST, nasledovala 1 hodina inkubácie pri 37 °C so sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou [kozí anti-králičí IgG H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, abcam)] a päť premyje PBST. Po pridaní 3, 30, 5 a 50-tetrametylbifenylanhydridu počas 5 minút sa reakcia zastavila 2M kyselinou sírovou. Optická hustota sa merala pri 450 nm a 630 nm prístrojom na značenie enzýmov (Molecular Devices, SpectraMax 190) a potom sa preniesla do štandardnej krivky.

Výhody cistanche tubulosa-posilnenie imunitného systému

2.9. Stanovenie cytokínov 

Doštička (kat. #T-k15048D-1, MSD) sa trikrát premyla 150 ul/jamku premývacieho pufra a do každej jamky sa pridalo 50 ul pripravenej vzorky. Potom sa platňa utesnila adhéznym uzáverom platne a inkubovala sa pri teplote miestnosti s trepaním počas 2 hodín. Potom sa doštička trikrát premyla 150 ul/jamku premývacieho pufra a do každej jamky sa pridalo 25 ul roztoku detekčnej protilátky. Doštička sa znova uzavrela a inkubovala sa pri teplote miestnosti za trepania počas 2 hodín. Ďalej bola doštička trikrát premytá aspoň 150 ul/jamka premývacieho pufra; Do každej jamky sa pridalo 150 ul 2x Read Buffer T (MSD) a doštička sa analyzovala na prístroji MSD.

2.10. Neutralizujúca protilátka

2.10.1. Pseudovírusový neutralizačný test

Neutralizačná aktivita myšieho séra bola testovaná s použitím pseudovírusového systému vírusu vezikulárnej stomatitídy (VSV). Sérum sa inaktivovalo vo vodnom kúpeli počas {{0}},5 hodiny pri 56 ◦C a potom sa sériovo zriedilo na požadovaný rozsah. Bunky HEK293 boli nanesené na 96-jamkovú platňu. Zriedené sérum sa zmiešalo s 200 CCID50 (dávka vírusu, ktorá môže infikovať 50 % bunkovej kultúry)/100 µl vírusovej suspenzie v pomere 1:1 a umiestnilo sa do CO2 inkubátora (37 ± 1 ◦C). 2 h. Ďalej sa do každej jamky pridalo 100 ul roztoku na udržiavanie vírusu obsahujúceho 0,5 % dvojitú protilátku penicilín-streptomycín a neutralizovaná zmes sa naočkovala do 96-jamkovej platne obsahujúcej bunky v množstve 100 ul na jamku, s dvoma opakovanými jamkami na každé riedenie. Súčasne bola nastavená normálna bunková kontrola a bunky boli inkubované v CO2 inkubátore (37 ± 1 ◦C) počas 96 hodín. Potom sa 200 CCID50/100 ul vírusového roztoku zriedilo na 10-1~10-3. Bunkové kultivačné médium v ​​96-jamkovej doštičke sa vyhodilo, do každej jamky sa pridalo 150 ul roztoku na udržiavanie vírusu a zriedený roztok vírusu sa naočkoval v koncentrácii 10-1~{{33} } do jamiek 96-jamkovej platne (50 ul na jamku). Každé riedenie sa opakovalo v 8 jamkách; súčasne bola nastavená normálna bunková kontrola, po ktorej nasledovala kultivácia počas 96 hodín. Zmeny v CPE buniek boli pozorované pod inverzným mikroskopom. Normálna bunková kontrola by nemala mať žiadne cytopatické zmeny a pozitívna kontrola by mala mať zmeny CPE. Neutralizačné koncové body (riedenia séra prevedené na logaritmy) sa vypočítali pozorovaním CPE. Séronegatívne/pozitívne kritérium bolo 1:12 ako pozitívne/negatívne kritérium,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Živý neutralizačný test

Neutralizačná aktivita myšieho séra bola hodnotená živým neutralizačným testom. Zriedené sérum bolo zmiešané so SARS-CoV-2 a inkubované pri 37 ◦C počas 1 hodiny. Zmes sa pridala do 96-jamkovej platne, aby sa infikovali bunky Vero E6. Po 72- hodinovej inkubácii pri 37 ◦C sa pozoroval cytopatický efekt vírusu (CPE) pri 40-násobnom zväčšení a vypočítal sa neutralizačný titer (recipročná hodnota 50 % riedenia séra potrebného na neutralizáciu vírusovej infekcie). Všetky vyššie uvedené postupy sa uskutočňovali v prostredí úrovne 3 biologickej bezpečnosti.

2.11. Štatistická analýza

Štatistické analýzy sa uskutočňovali dvojvzorkovým t-testom s použitím SPSS 26. p-hodnoty Menšie alebo rovné 0,05 sa považovali za významné. Centrálna tendencia sa merala pomocou geometrického stredného titra (GMT).

3. Výsledky

3.1. Konštrukcia rekombinantného adenovírusu

Bol získaný rekombinantný adenovírusový kyvadlový plazmid pAdeno-CMV-S1 so správnou inzerciou; jeho štruktúrny diagram je znázornený na obrázku 1. Rekombinantný adenovírus obsahoval genóm HAdV-C5 bez oblasti El/E3. Schematický diagram rekombinantného adenovírusového vektora získaného transfekciou kyvadlového plazmidu a cytoskeletového plazmidu v bunkách HEK293 je znázornený na obrázku 1.

3.2. Charakterizácia rekombinantného adenovírusu

Rekombinantný plazmid obsahujúci cieľový gén bol identifikovaný pomocou PCR (pozri obrázok 2A pre výsledky gélovej elektroforézy). Toto bol opakovaný experiment. Sekvencie primérov boli MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag a S1-R acaataagtagggactgggtc a sekvenovanie potvrdilo, že sekvencia bola v súlade s návrhom. Expresia SARS-CoV-2 S1 v bunkách bola detegovaná pomocou Western blottingu (obrázok 2B) a nepriamej imunofluorescencie (obrázok 2C). Sfarbenie pásu (-75 kDa) sa detegovalo Western blotom a bolo v súlade s očakávanou polohou pásu. Na transkripčnej úrovni bola in vitro expresia S1 detegovaná pomocou PT-PCR. Výsledky ukázali, že expresia mRNA S1 v bunkách HEK-293 bola významne vyššia ako v kontrolnej skupine.

Obrázok 1. Konštrukcia rekombinantnej adenovírusovej vakcíny a experimentálna stratégia. (A) pAdeno-CMV-S1 je rekombinantný adenovírusový kyvadlový plazmid obsahujúci cieľový gén S1. pBHGlox∆E1,3Cre je adenovírusový skeletový plazmid. pBHGlox∆E1,3Cre a pAdeno-CMV-S1 sa extrahovali pomocou súpravy na extrakciu plazmidov QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Čína). Jeden deň pred transfekciou boli bunky HEK293 pasážované v 25 cm2 banke na kultiváciu buniek. Kultivačným médiom bolo DMEM obsahujúce 5 % FBS bez antibiotík. Na druhý deň sa vybralo 60–80 % buniek a k bunkám sa pridal transfekčný roztok. Po 7 dňoch transfekcie boli bunky zoškrabané, centrifugované, supernatant bol odstránený a bunky boli resuscitované PBS. Bunky boli opakovane zmrazené a rozmrazené pri -80 ◦C a 37 ◦C. Po odstredení supernatant obsahoval primárny vírusový roztok. Rekombinantný adenovírusový kmeň sa purifikoval, amplifikoval a získal sa po ďalšom spracovaní a označil sa Ad-S1. Vakcína bola intramuskulárne injikovaná myšiam na následné štúdie. (B) Zobrazený časový rozsah imunizácie a odberu krvi.

3.3. Adenovírusový titer

V tomto experimente sa vypočítalo priemerne šesť pozitívnych buniek v piatich mikroskopických poliach a vírus v jamke sa zriedil 108-krát. Na základe vzorca opísaného v časti Materiály a metódy bol titer adenovírusu 4,74 x 1011 jednotiek tvoriacich plak (pfu)/ml (obrázok 2D).

3.4. Bunková imunita po očkovaní

Počas testovacieho obdobia sa vyskytli štatisticky významné zmeny v sérových cytokínoch (p menšie alebo rovné 0,05), ktoré hlavne ukázali, že koncentrácia chemoatraktantu keratinocytov/onkogénu regulovaného ľudským rastom (KC/GRO) bola poklesli a koncentrácie IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } a TNF- boli zvýšené, zatiaľ čo koncentrácia IL-6 sa významne nezmenila (obrázok 3).

Obrázok 2. Identifikácia rekombinantného proteínu HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 a stanovenie titra adenovírusu. (A) PCR detekcia rekombinantného plazmidu s cieľovým génom S1. (B) Western blot detekcia SARS-CoV-2. Bunky HEK293 s exponenciálnym rastom boli infikované SARS-CoV-2 počas 48 hodín, potom bol bunkový proteín extrahovaný a separovaný pomocou SDS-PAGE. Expresia SARS-CoV-2 bola potvrdená Western blotovaním s kozím anti-králičím IgG. (C) Imunofluorescenčná mikroskopia buniek HEK-293 infikovaných Ad-S1 (zelená). Bunky sa kontrastne zafarbili 40, 6-diamidino- 2-fenylindolom (DAPI), aby sa zafarbili jadrá. Mierka 1000 µm. (D) Na meranie sa použil plakový test. Mikrofotografie zobrazujúce riedenie 10-5, 10-6, 10-7 a 10-8 (zľava doprava).

Obrázok 3. Ad-S1 indukované zmenené plazmatické hladiny cytokínov typu 1/2, interferónov typu 1 a iných cytokínov. Výsledky sa zistili odoberaním krvi myšiam 7 dní po prvej imunizácii. Údaje sú prezentované ako boxové a fúzové diagramy. Každý kruh predstavuje jedného jednotlivca. p-hodnoty sa vypočítali pomocou dvojvzorkového t-testu.

3.5. Detekcia anti-SARS-CoV-2 S1 protilátok po imunizácii

ELISA odhalila, že protilátky špecifické pre SARS-CoV{1}} boli prítomné u myší, ktorým bol injekčne podaný prvý a druhý Ad-S1, ale nie u myší, ktorým bol podaný kontrolný adenovírusový kapsid alebo roztok PBS (Ad/PBS) (obrázok 4A). Titre IgG 1:210 a 1:212 boli detegované u myší očkovaných Ad-S{10}} dva týždne po prvej a druhej imunizácii. Zriedený titer 28 dní po očkovaní (D28, GMT 2297,4) bol 6,{17}}krát vyšší ako v D14 (GMT 378,9).

Obrázok 4. Ad-S1 indukoval vysoké titre protilátok (A) a neutralizačnú aktivitu (B, C) u myší. (A) ELISA SARS-CoV-2-špecifického sérového IgG z Ad-S1-imunizovaných myší. (B) Analýza pseudovírusových aktivít séra z myší imunizovaných Ad-S1-. (C) Analýza neutralizačných aktivít séra z myší imunizovaných Ad-S{10}}

3.6. Neutralizačná protilátková skúška

Výzva buniek Vero E6 SARS-CoV{1}} umožnila detekciu neutralizačnej aktivity v imunizovanom myšom sére (obrázok 4B, C). Neutralizačné titre D14 a D28 buniek Vero E6 imunizovaných Ad-S{7}} proti živému vírusu SARS-CoV{10}} in vitro boli 1:24,3 a 1:26,3, v tomto poradí. Pseudovírusový test priniesol podobné výsledky ako test so živým vírusom, s neutralizačnými titrami až do 1:28,1 a 1:29,6 v D14 a D28, v danom poradí. Neutralizačný titer pseudovírusu D28 (GMT 769,0) bol 2.{29}}krát vyšší ako titer D14 (GMT 283,7).

4. Diskusia

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 až<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

V tejto štúdii sme skonštruovali vakcínu proti rekombinantnému adenovírusu SARS-CoV-2 obsahujúcu podjednotku SARS-CoV-2 S1 a označili sme ju Ad-S1. Podobne ako CanSinoBIO, ktorá bola schválená na uvedenie na trh [28], sme v tejto vakcíne použili HAdV-C5. Adenovírus je široko používaný v rekombinantnej génovej terapii a ako vakcínový vektor. Miera séropozitívnosti HAdV-C5 je však v normálnej populácii až 75–80 % [29]. To znamená, že imunita pred uskladnením proti vektorom HAdV-C5 významne znižuje imunitu vyvolanú vakcínou. ChAdOx1 nCoV-19, vyvinutý na Oxfordskej univerzite v Spojenom kráľovstve, používa šimpanzí adenovírusový vektor, ktorý má naopak nižšiu séropozitívnosť u ľudí, a keď je pozitívny, zvyčajne predstavuje nižší titer sérových protilátok [30] . Preto môžu byť skúmané adenovírusové vektory, ktoré sa môžu vyhnúť už existujúcej imunite, aby sa zvýšila ochranná účinnosť adenovírusovej vakcíny. V tejto štúdii bol sérový stav myší pred a po imunizácii stanovený pomocou ELISA a neutralizačných testov a poskytol dôkaz humorálnej imunity pre kandidátov vakcíny. Sérum produkované po intramuskulárnej injekcii vakcíny myšiam účinne chránilo bunky Vero E6 pred infekciou SARS-CoV-2 in vitro (obrázok 4). Zistili sme tiež silnejšiu imunitnú odpoveď a lepšiu ochranu u myší po druhej imunizácii (obrázok 4). Naše experimentálne výsledky sú podobné bežným experimentálnym výsledkom.

Ako pokračuje výskum SARS-CoV{1}}, niekoľko štúdií preukázalo, že cytokínová búrka sekundárna k infekcii SARS-CoV-2 môže ovplyvniť produkciu T-buniek, čo sťažuje pacientom udržať si dlhodobú imunitu voči SARS-CoV-2 [31]. Preto je potrebné určiť, či Ad-S1 môže u myší indukovať imunitu sprostredkovanú T-bunkami. Naše výsledky ukázali, že koncentrácie IFN- a IL{14}} sa zvýšili a koncentrácie IL{15}} sa znížili v skupine Ad-S1, čo naznačuje, že vakcínou indukované prežitie a rast Th1 buniek u myší. Sekrécia IL-12, IL{21}} a TNF-bunkami Th1 sa v experimentálnej skupine mierne zvýšila. Tieto výsledky ukázali, že Ad-S1 účinne indukoval Th1-skreslenú T-bunkovú odpoveď u myší [32]. Zvýšený IL-5 naznačuje, že Th2 bunky sa tiež podieľajú na imunitnej odpovedi a vyvolávajú určité účinky. Koncentrácia KC/GRO v experimentálnej skupine bola významne znížená v porovnaní s kontrolnou skupinou PBS, čo mohlo byť spôsobené zníženou chemotaxiou neutrofilov, ktorá potláčala zápalovú odpoveď a umožňovala mierne kontrolovať vedľajšie účinky vakcíny. To by bolo výhodnejšie pre ľudí s oslabenou imunitou, ako sú starší ľudia alebo pacienti podstupujúci chemoterapiu. Li M. a kol. [29] vyvinuli adenovírusovú vakcínu s použitím Ad68 ako vektora. Výsledky ukázali, že in vivo neutralizačná aktivita SARS-CoV-2 sa dala detegovať do dvoch týždňov po intramuskulárnej imunizácii myší BALB/c a potom sa ďalej zvyšovala a titer neutralizačných protilátok (PRNT ID50) dosiahol 957,3 pri ôsmich týždňov. Medzitým v štúdii Liu J. a kol. [33] boli vyvinuté vakcíny využívajúce AdC6 a AdC68 ako vektory; väzbové aj neutralizačné protilátkové reakcie po imunizácii boli generované 14 dní po dávke, s IgG titrom 7108 (geometrický priemerný titer, GMT; AdC6) a 5489 (GMT, AdC68). Neutralizačný titer 50 (NT50) pseudovírusového neutralizačného testu bol 125 (GMT, AdC6) a 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

V tejto štúdii mali myši očkované Ad-S1 titre IgG 1:10}10 a 1:122 detekované testom ELISA dva týždne po prvej a druhej imunizácii. Zriedený titer ad-s1 bol 378,9 (GMT) 14 dní po inokulácii a 2297,4 (GMT) 28 dní po inokulácii. V teste neutralizačných protilátok vykazovali Vero E6 bunky imunizované Ad-S1 neutralizáciu 1:24,3 a 1:26,3 v D14 a D28 proti živému vírusu SARS-CoV-2 in vitro, v danom poradí. Neutralizačné titre pseudovírusu v D14 a D28 boli 283,7 (GMT) a 769,0 (GMT), v danom poradí. Vakcína v tejto štúdii bola teda účinnejšia z hľadiska imunitnej odpovede na myšom modeli.

Kvôli obmedzeniu experimentálnych podmienok sme neuskutočnili analýzu ELISpot (ELISpot) imunitných buniek sleziny experimentálnych myší. Okrem toho nebolo možné vykonať experimenty na ochranu pred útokmi SARS-CoV-2 na myšiach z dôvodu obmedzení laboratória fyzickej ochrany. Zistili sme však, že vakcína má vysokú účinnosť na myšacích modeloch a môže sa použiť ako ideálny rezervný kmeň vakcíny. Okrem toho by sa imunogenicita, bezpečnosť a účinnosť potenciálnych kandidátov na vakcínu SARS-CoV-2 mala preskúmať na ďalších zvieracích modeloch (napr. králiky, primáty, mývaly, psy), keďže myšacie modely nemusia plne duplikovať ľudské imunologické Vlastnosti.

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

5. Závery

Údaje získané z našich predklinických štúdií vakcíny proti adenovírusu preukázali, že vakcína má dostatočnú bezpečnosť a účinnosť. Preto môže byť sľubnou a uskutočniteľnou profylaktickou vakcínou proti infekcii SARS-CoV-2.

Referencie

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Prehľad životného cyklu SARS-CoV-2, patofyziológie a racionalizovanej liečby zameranej na klinické komplikácie COVID-19. J. Biomed. Sci. 28., 9. 2021. [CrossRef]

2. Pillay, gén mesiaca TS: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 nový vrcholový proteín koronavírusu. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regresia rakoviny pľúc u myší intranazálnym podaním SARS-CoV-2 Spike S1. Rakoviny 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemický koronavírus: Molekulárne a štrukturálne poznatky. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Štrukturálne znaky vrcholového proteínu koronavírusu SARS-CoV-2: Ciele očkovania. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Steny, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glykánový štít a maskovanie epitopu koronavírusového hrotového proteínu pozorované kryoelektrónovou mikroskopiou. Nat. Struct. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 je lepší ako RBD ako podjednotkový očkovací antigén COVID{4}}. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Buďte si vedomí vrcholového proteínu SARS-CoV-2: Je toho viac, ako sa na prvý pohľad zdá. J. Biol. Regul. Homeost. Agenti 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Systémová a slizničná imunita u myší vyvolaná jedinou imunizáciou vakcínami na báze ľudského adenovírusu typu 5 alebo 41, ktoré nesú vrcholový proteín koronavírusu respiračného syndrómu na Blízkom východe. Imunológia 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Najmodernejšia vektorológia ľudského adenovírusu pre terapeutické prístupy. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Účinnosť a bezpečnosť vakcín COVID-19: Systematický prehľad. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabáš, SL; Bhorat, QE; a kol. Bezpečnosť a účinnosť vakcíny ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) proti SARS-CoV-2: Predbežná analýza štyroch randomizovaných kontrolovaných štúdií v Brazílii, Južnej Afrike a Spojenom kráľovstve. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analýza ochrannej účinnosti schválených vakcín proti COVID-19 proti rôznym mutantom. Predné. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Áková, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; a kol. Účinnosť a bezpečnosť inaktivovanej celoviriónovej vakcíny proti SARS-CoV-2 (CoronaVac): Predbežné výsledky dvojito zaslepenej, randomizovanej, placebom kontrolovanej štúdie fázy 3 v Turecku. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Bezpečnosť a imunogenicita inaktivovanej vakcíny SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: Randomizovaná, dvojito zaslepená, placebom kontrolovaná štúdia fázy 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; On, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; a kol. Bezpečnosť a imunogenicita rekombinantnej tandemovo-opakovanej dimérnej proteínovej podjednotkovej vakcíny na báze RBD (ZF2001) proti COVID-19 u dospelých: Dve randomizované, dvojito zaslepené, placebom kontrolované štúdie fázy 1 a 2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. India DNA vakcína COVID je svetovou prvou – prichádzajú ďalšie. Príroda 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, ČR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; a kol. Ciele reakcií T-buniek na koronavírus SARS-CoV-2 u ľudí s ochorením COVID-19 a neexponovaných jedincov. Cela 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; a kol. Silné neutralizačné protilátky proti SARS-CoV-2 identifikované vysokovýkonným jednobunkovým sekvenovaním B buniek rekonvalescentných pacientov. Cela 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. Vakcíny proti SARS-CoV-2: Správa o stave. Imunita 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; a kol. Nová vakcína na COVID{1}} s kombináciou DNA a proteínov poskytuje úplnú ochranu proti SARS-CoV-2 u makakov rhesus. Emerg. Mikróby infikujú. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; On, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Špičkový proteín SARS-CoV – cieľ pre vakcínu a terapeutický vývoj. Nat. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-terminálne skrátený nukleokapsidový proteín SARS-CoV-2 ako lepší sérologický marker ako celý nukleokapsidový proteín pri hodnotení imunogenicity inaktivovaného SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Vakcína SARS-CoV-2 mRNA-1273 vyvoláva neutralizáciu viac zameranú na RBD, ale so širšou väzbou protilátok v rámci RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; a kol. Hodnotenie bunkových a sérologických odpovedí na akútnu infekciu SARS-CoV-2 demonštruje funkčnú dôležitosť domény viažucej receptor. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. He, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Doména viažuca receptor SARS-CoV spike proteínu indukuje vysoko účinné neutralizačné protilátky: Dôsledok pre vývoj podjednotkovej vakcíny. Biochem. Biophys. Res. komun. 2004, 324, 773-781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fanúšikovia.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; a kol. Vývoj a aplikácia vírusových vektorových vakcín počas pandémie COVID-19. Mikroorganizmy 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; a kol. Imunogenicita a bezpečnosť rekombinantného adenovírusového typu -5-vektorovanej COVID{2}} vakcíny u zdravých dospelých vo veku 18 rokov alebo starších: Randomizovaná, dvojito zaslepená, placebom kontrolovaná štúdia fázy 2. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; a kol. Jednodávková imunizácia vakcínou na báze šimpanza na báze adenovírusu indukuje trvalú a ochrannú imunitu proti SARS-CoV-2 infekcii. Predné. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Vývoj nových vakcínových vektorov: šimpanzové adenovírusové vektory. Hum. Vakcíny Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmár, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; a kol. Strata Bcl-6-vyjadrenia T folikulárnych pomocných buniek a germinálnych centier v COVID-19. Cela 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- a IL-12 synergizujú pri premene in vivo generovaných Th17 na Th1/Th17 bunky. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; Akýkoľvek.; Li, J.; Gao, P.; a kol. Heterológne imunizácie prime-boost pomocou šimpanzích adenovírusových vektorov vyvolávajú silnú a ochrannú imunitu proti infekcii SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]