Výhodný/nepriaznivý účinok kvercetínu na membrány buniek SK-N-SH neuroblastómu 1. časť

Kliknite prosímoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Kvercetín je polyfenolová zlúčenina, ktorej účinky vyvolávajú pochybnosti vedcov. Výsledky mnohých experimentov ukazujú, že má protirakovinové, protizápalové a antioxidačné vlastnosti, zatiaľ čo iné štúdie poukazujú na jeho prooxidačné a cytotoxické pôsobenie. Táto zlúčenina môže reagovať s reaktívnymi formami kyslíka a vďaka svojim chemickým vlastnostiam sa nachádza v hydrofóbno-hydrofilnej oblasti buniek. Tieto vlastnosti kvercetínu naznačujú, že jeho pôsobenie v bunkách bude spojené s modifikáciou membrán a jeho účasťou na udržiavaní redoxnej rovnováhy. Preto táto štúdia rozlišuje tieto dva mechanizmy a určuje, či sú dôležité pre funkciu buniek. Kontrolujeme:(1)Či sú vybrané koncentrácie kvercetínu cytotoxické a deštruktívne pre membrány buniek SK-N-SH (testy MTT, LDH, MDA) v situáciách s aplikovaným oxidačným stresom alebo bez neho; (2) aká je úroveň zmien v štrukturálnych/mechanických vlastnostiach lipidovej časti membrán týchto buniek v dôsledku prítomnosti molekúl polyfenolu; a (3) či antioxidačné pôsobenie kvercetínu chráni membránu pred jej modifikáciou. Naše výsledky ukazujú, že zmeny v tuhosti/elasticite lipidovej časti membrány predstavujú rozhodujúci mechanizmus účinku kvercetínu, potenciálne ovplyvňujúce bunkové procesy, ktorých počiatočné štádiá sú spojené s membránami (napr. príjem signálov z prostredia, transport).

Kľúčové slová:kvercetín; neuroblastómové bunky; bunková membrána; Langmuirova monovrstva;oxidačný stres

1. Úvod

Kvercetín (3,3',4',5,7-pentahydroxyflavón) je bioaktívny polyfenol vyskytujúci sa v rastlinách [1-3] a je najrozšírenejším flavonoidom v ľudskej strave [4].

Vykazuje široké spektrum vlastností — medzi protizápalovými [5] a imunomodulačnými [6]. Literárne údaje naznačujú, že môže ísť o potenciálny protirakovinový faktor [7,8]. Za svoje pôsobenie vďačí schopnosti modifikovať priebeh vnútrobunkových signálnych dráh[9,10] a antioxidačným vlastnostiam, ktoré boli preukázané okrem iného na bunkách PC12 [11,12]a ľudských neurónových bunkách SH-SY5Y [13] .

Táto zlúčenina je antiproliferatívna látka, ktorá vyvoláva programovanú bunkovú smrť v mnohých nádorových líniách, napríklad v bunkách HL-60 a NB{1}} z akútnej myeloidnej leukémie [14,15] a K{{4 }}chronická myeloidná leukémia [16]. Ukázalo sa tiež, že kvercetín inhibuje šírenie rôznych typov rakoviny, ako je rakovina pľúc, pečene, prsníka a hrubého čreva [17-20]. Vijayababu et al.[21]zistili, že indukuje apoptózu buniek karcinómu prostaty (PC-3), ako aj inhibuje inváziu, migráciu a signálne molekuly zapojené do prežívania buniek a proliferácie tohto typu buniek [22] .

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Účinok kvercetínu však nie je jasný. Existujú aj údaje naznačujúce vysokú cytotoxicitu tejto zlúčeniny [23-25]. Výskum ukazuje, že kvercetín môže v závislosti od koncentrácie, umiestnenia v bunke a zdroja voľných radikálov vykazovať prooxidačný účinok. Vysoké dávky vyvolali oxidačný stres v ľudských lymfocytoch [26].

Takéto dualistické pôsobenie kvercetínu môže súvisieť so skutočnosťou, že ako antioxidant sa môže stať oxidačným produktom. Výsledkom tejto reakcie je vznik asemichinónový radikál, ktorý sa oxiduje na kvercetínchinón [2]. Táto zlúčenina môže reagovať s tiolovými skupinami a stať sa toxickými pre bunky [26].

Ďalšou možnosťou priaznivého/nepriaznivého pôsobenia na bunky je účinok tejto zlúčeniny na membrány. Vďaka chemickej povahe a prítomnosti aromatických kruhov v molekule sa môže nachádzať v hydrofóbnych bunkových kompartmentoch, čím mení svoje fyzikálno-chemické vlastnosti [27,28]. Mechanické a štrukturálne vlastnosti lipidovej časti membrán sú veľmi dôležité pre priebeh všetkých procesov súvisiacich s membránami, tj transportu, signalizácie a vedenia vzruchov. Tieto procesy uskutočňujú najmä proteíny ukotvené v membránach.výhody polyfenolovZmeny v tuhosti alebo pružnosti membrány môžu blokovať možnosť prijatia vhodnej konformácie jednotlivých proteínových domén, čo môže následne narušiť alebo inhibovať proces vykonávaný daným proteínom. Je preto pravdepodobné, že zmena zloženia membrán zavedením aj malého množstva kvercetínu medzi molekuly lipidov môže významne zmeniť ich mobilitu.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Vzhľadom na existujúcu nejednoznačnosť v literatúre, pokiaľ ide o účinky kvercetínu na bunky, tento výskum hodnotí anti- alebo prooxidačné pôsobenie kvercetínu a kontroluje vplyv tejto zlúčeniny na fungovanie bunkových membrán, vrátane stanovenia štrukturálnej modifikácie kvercetínu. lipidovej časti týchto membrán.fyziologický roztokTento cieľ bol dosiahnutý skúmaním vplyvu rôznych koncentrácií kvercetínu na prežívanie SK-N-SH buniek a úroveň poškodenia ich membrán. Potenciálna antioxidačná aktivita tejto zlúčeniny bola kontrolovaná iniciáciou oxidačného stresu na bunky po predchádzajúcej inkubácii s kvercetínom.štandardizované cistanchePôsobenie na membránovej úrovni bolo testované v modelových systémoch poskytujúcich jednoznačné informácie o: (1) štrukturálnej modifikácii lipidovej monovrstvy kompozície odrážajúcej bunkovú membránu (SK-N-SH) spôsobenej prítomnosťou rôznych množstiev kvercetínu a (2) ochranné schopnosti testovaného flavonoidu proti peroxidácii nenasýtených mastných kyselín v lipidoch, ktoré tvoria bunkovú membránu (SK-N-SH).

2. Výsledky

2.1. Natioe Cell Membranes

Účinok kvercetínu na ľudské SK-N-SH bunky bol skúmaný pomocou MTT testu, ktorý určuje mitochondriálnu aktivitu.

SK-N-SH boli vystavené na 24 hodín rôznym koncentráciám kvercetínu (3,1, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 a 200 uM). Ošetrenie buniek nižšími koncentráciami kvercetínu nepreukázalo žiadny významný účinok. Na rozdiel od toho pridanie kvercetínu v koncentrácii 200 uM spôsobilo mierne zvýšenie počtu životaschopných buniek (11 percent v porovnaní s kontrolou) (obrázok la).

Štúdia tiež skúmala účinok rôznych koncentrácií peroxidu vodíka (1-5 mM) na bunky po 3 hodinách kontaktu. Bolo pozorované, že najnižšia testovaná koncentrácia spôsobila mierny pokles životaschopnosti buniek (asi o 10 percent v porovnaní s kontrolou), zatiaľ čo vyššie koncentrácie boli toxické pre bunky SK-N-SH. V prítomnosti H202 at3 a 5 mM koncentráciách v kultivačnom médiu bolo zaznamenané významné (približne 54 percent) zníženie životaschopnosti buniek v porovnaní s bunkami, ktoré neboli ošetrené H202 (obrázok 1b).

Aby sa určil ochranný účinok kvercetínu proti H2O, toxicita, bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami kvercetínu počas 24 hodín, po ktorých nasledoval 3-hodinový kontakt vzorky s peroxidom vodíka 3 a 5 mM. Zistilo sa, že koncentrácie kvercetínu 3.1-50 uM spôsobili mierne,kde môžem kúpiť cistancheasi 9 percent, zvýšenie počtu životaschopných buniek v porovnaní s bunkami ošetrenými iba H, O. Naopak, pre bunky SK-N-SH predinkubované v médiu obsahujúcom vyššie koncentrácie kvercetínu (100 a 200 uM) a potom kontaktované s H202 sa životaschopnosť buniek zvýšila približne o 18 a 33 percent (obrázok 1c).

Ďalšou etapou práce bolo skontrolovať, do akej miery kvercetín a H,O ovplyvňujú membrány testovaných buniek. Na tento účel sa použil test laktátdehydrogenázy (LDH) na hodnotenie úrovne poškodenia bunkovej membrány a hladina malondialdehydu (MDA) sa merala na vyhodnotenie stupňa peroxidácie lipidov. Bunky SK-N-SH boli ošetrené počas 24 hodín vybranými koncentráciami kvercetínu (6,25; 25; 100; 200 μM) a potom bol pridaný peroxid vodíka (3-5 mM) na ďalšie 3 hodiny.

Obrázok 1. Životaschopnosť buniek bola stanovená testom MTT. Bunky SK-N-SH boli vystavené na 24 hodín rôznym koncentráciám kvercetínu (3.1-200 uM). Percento životaschopnosti buniek sa vzťahovalo na neošetrené kontrolné bunky (a); bunky kontaktované počas 3 hodín s rôznymi koncentráciami H202 (mM) (b), bunky SK-N-SH sa predinkubovali počas 24 hodín s rôznymi koncentráciami kvercetínu a potom boli kontaktované počas 3 hodín s H, O2. Percento životaschopnosti buniek sa vzťahovalo na bunky ošetrené iba H,02 (c). Hodnoty predstavujú priemer ± SD z troch až šiestich nezávislých experimentov. Rôzne písmená označujú významné rozdiely (p Menšie alebo rovné 0.05).

Ako je uvedené v tabuľke 1, prítomnosť kvercetínu v médiu použitom na 24-hodinové ošetrenie buniek SK-N-SH nespôsobila žiadnu významnú zmenu v uvoľňovaní LDH.

Predošetrenie s koncentráciou kvercetínu 6,25 uM neovplyvnilo obsah MDA, zatiaľ čo vyššie dávky kvercetínu (25; 100 a 200 μM） vyvolalo zvýšenie peroxidácie lipidov o približne 12 percent (obrázok 2a).

Ošetrenie buniek kvercetínom aj peroxidom vodíka neovplyvnilo uvoľňovanie LDH v porovnaní s bunkami ošetrenými samotným peroxidom vodíka (obrázok 2b).

Obrázok 2. Účinok kvercetínu na bunky SK-N-SH vystavené H2O sa meral podľa stupňa peroxidácie lipidov (koncentrácia MDA) (a) a uvoľňovania LDH (b). Bunky boli vopred ošetrené počas 24 hodín vybranými koncentráciami kvercetínu (6,25; 25; 100; 200 uM), po ktorých nasledovali 3 hodiny kontaktu s H202 (3-5 mM).Čistota proti starnutiuPercento úniku LDH sa vzťahovalo na hodnoty získané pre bunky ošetrené iba H2O (b). Hodnoty predstavujú priemer ± z troch až šiestich nezávislých experimentov. Rôzne písmená označujú významné rozdiely (p Menšie alebo rovné 0.05).

2.2. Modelové membrány

2.2.1. Vplyv kvercetínu na mechanické vlastnosti membrán

Na testovanie účinku kvercetínu na membrány buniek neuroblastómu boli vytvorené lipidové monolavery (zloženie odrážajúce lipidovú časť membrán bunkovej línie SK-N-SH). Monovrstvy sa pripravili na čistom pufri pH 7,4 (kontrola) a na pufri obsahujúcom kvercetín v koncentráciách 6,25, 12,5, 25 a 50 uM. Pre takéto monovrstvy sa merali závislosti povrchového tlaku （元） od plochy na jednu molekulu v monovrstve (A) (obrázok 3).

Priebeh izoterm (π-A) získaných pre zmes lipidov napodobňujúcu zloženie charakteristické pre membránu neuroblastómu je charakterizovaný monotónnym priebehom bez viditeľných fázových prechodov. Prítomnosť kvercetínu jasne modifikuje tento vzťah, čo spôsobuje posun kriviek smerom k vyšším hodnotám A. Táto tendencia je priamo úmerná koncentrácii kvercetínu v tlmivom roztoku. Závislosť statického Cs-Ikompresného modulu od rt bola vypočítaná na základe izoterm (vložený na obrázku 3).

Na základe získaných izoterm boli stanovené hodnoty fyzikálno-chemických parametrov charakterizujúcich testované monovrstvy (tab. 2).

Obrázok 3. Izotermy povrchového tlaku a zodpovedajúci modul stlačiteľnosti (vložka) lipidového modelu vrstiev neuroblastómu rozprestretých na subfáze obsahovali uvedené koncentrácie kvercetínu rozpusteného v pufri.

Tabuľka 2. Povrchové parametre monovrstiev (Alim-limitná plocha na jednu molekulu; πcollapsový tlak; Cs-1-maximálne hodnoty kompresného modulu) boli vypočítané pre monovrstvy modelu membrány neuroblastómu. Údaje predstavujú priemer z troch experimentov ± SD. Rôzne písmená označujú významné rozdiely (p Menšie alebo rovné 0.05).

So zvyšujúcim sa množstvom kvercetínu sa Alim (minimálna plocha na molekulu v husto zbalenej vrstve) zvyšoval úmerne jeho koncentrácii. Pre najvyššiu hladinu kvercetínu bol tento nárast až 17,5 percenta v porovnaní s kontrolou. Zvyšné parametre, tj πcoll a Cs-I (povrchový tlak v bode zrútenia vrstvy a modul statického stlačenia) boli menej citlivé na obsah kvercetínu v subfáze. Zmeny v rolovaní sa pohybovali od 3-5 percent a pre Cs- od 0,2 do 8,8 percent v porovnaní s kontrolou.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules