Etanolický extrakt zo semien cucurbita Pepo L. upravuje neuroendokrinnú disrupciu u chronicky stresovaných potkanov a adrenálnu expresiu zápalových markerov a HSP70

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 a Nasra Ayuob11

Pozadie: Tekvice(Cucurbita pepo L.) maliantioxidant,protizápalové, protiúnavové a antidepresívne účinky. Nadobličky sú dôležitým orgánom reagujúcim na stres, ktorý počas stresu udržiava homeostázu.

Ciele:Cieľom tejto štúdie bolo posúdiť účinnosť podávania extraktu Cucurbitapepo L. (CP) pri zmierňovaní behaviorálnych, biochemických a štrukturálnych zmien v nadobličkách vyvolaných vystavením chronickému nepredvídateľnému miernemu stresu (CUMS) a preskúmať mechanizmus tohto vplyvu.

Materiály a metódy:Štyridsať samcov potkaních albínov bolo rozdelených do 4 skupín (n=10): kontrolná skupina, skupina CUMS, skupina liečená fluoxetínom a skupina liečená CP. Zmeny správania, hladina kortikosterónu, prozápalové cytokíny TNF- a IL-6 a oxidant/antioxidantprofily boli hodnotené v sére na konci experimentu. Nadobličky boli spracované na histopatologické a imunohistochemické hodnotenie. Génová expresia kaspázy-3 a Ki67 a proteínu tepelného šoku 70 (HSP70) sa hodnotila v nadobličkách pomocou RT-PCR.

Výsledky:Extrakt CP významne znížil hladinu kortikosterónu (p < {0}}="" 0,001),="" čas="" imobility="" (p="">< 0,001)="" a="" zápalové="" a="" oxidačné="" zmeny="" spojené="" s="" depresiou="" vyvolanou="" cums="" v="" porovnaní="" s="" neliečenou="" skupinou.="" extrakt="" cp="" zmiernil="" histopatologické="" zmeny="" nadobličiek="" vyvolané="" cums="" a="" výrazne="" ich="">apoptóza(p < 0.001) a výrazne upregulovanéantioxidanthladiny v sére.

Záver:Cucurbita pepo L. účinne zlepšila chronické stresom vyvolané behaviorálne, biochemické a štrukturálne zmeny nadobličiek najmä prostredníctvomantioxidanta protizápalové účinky.

Kľúčové slová: tekvica, stres, depresia, kaspáza-3, ki67, Hsp70,apoptóza

Cistanche, čínska bylina, má antioxidačnú funkciu.

ÚVOD

Viac ako 264 miliónov ľudí všetkých vekových skupín trpí depresiou na celom svete (WHO, 2020). Výkon osoby s depresiou je vo všeobecnosti slabý v škole, v práci a v rodine. Depresia môže viesť k samovražde; preto sa považuje za druhú hlavnú príčinu smrti u 15- až 29-ročných detí (WHO, 2020). Cicavce môžu prežiť stresujúce udalosti aktiváciou vhodných fyziologických reakcií na tieto udalosti. Nadoblička je súčasťou osi hypotalamus-hypofýza-adrenokortikálna (HPA) a osi sympatie-adrenomedulárna, ktorá udržiava homeostázu počas stresu (Ulrich-Lai et al., 2006). Uvádza sa, že vystavenie tepelnému stresu vedie k rýchlej expresii HSP70 v kôre nadobličiek (Huang et al., 2001). Tieto proteíny zdieľajú intracelulárny prenos, prezentáciu antigénu,apoptózaa mnoho ďalších akcií (Khar et al., 2001). Bolo popísané, že exogénne hormóny alebo interferencia s endogénnymi hormónmi môže mať počas kritických období vývoja trvalé účinky na fyziologické a behaviorálne dráhy regulované hypotalamicneuroendokrinnými okruhmi (Gore a Patisaul, 2010). zahŕňajú celú šírku integračnej fyziológie; preto je to viac ako hormonálna porucha (Waye a Trudeau, 2011).

Zmeny v neuroendokrinnej regulácii, metabolizme a strave/mikrobiote sa považujú za spúšťače zápalu a predispozície k rozvoju depresie (Huang et al., 2019). Predpokladalo sa, že depresia – jedna z neuropsychiatrických porúch – a zápal majú obojsmerný vzťah. Zatiaľ čo depresia podporuje zápalové reakcie, zápal podporuje neuropsychiatrické poruchy vrátane depresie (Bauer a Teixeira, 2019).

Fluoxetín, klasické antidepresívum, patrí medzi lieky dostupné na trhu na liečbu depresie. Teraz sa považuje za vznikajúci neuroendokrinný disruptor. Tento účinok fluoxetínu je skôr vedľajším než hlavným terapeutickým cieľom u cicavcov (León-Olea et al., 2014). Preto sú potrebné bezpečnejšie antidepresíva bez vedľajších účinkov na neuroendokrinný stav.

Tekvice(Cucurbita pepo L.) sú ekonomicky významné druhy pestované na celom svete. Majú nutričné ​​a zdravotné výhody, pretože sú bohaté na fenoly, flavonoidy, aminokyseliny, sacharidy a vitamíny (Wang et al., 2002). Niekoľko výskumných štúdií odhalilo, že tekvica má rozsiahle biologické aktivity, ako sú antidiabetické, protirakovinové,antioxidant, protizápalové, proti únave a účinky podobné antidepresívam (Wang et al., 2012; Zhanget al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016). Tradičná medicína hlavne ajurvédska systémy a čínska medicína použili rôzne časti tekvice, vrátane dužiny plodov a semien (Perez Gutierrez, 2016). Antidepresívna účinnosť Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) a Cucurbita moschata Duch bola predtým testovaná vo vivostudy pomocou zvieracieho modelu depresie vyvolaného testom núteného plávania (FST) a porovnávala sa s fluoxetínom (Kim Nr a kol., 2016). V jednej z relatívne nedávnych recenzií sa zhrnulo, že antidepresívne potraviny, ako napríklad tekvicové semienka, boli opísané ako potraviny s antidepresívnym skóre 47 percent, čo poskytuje ich účinok podobný antidepresívam (Lachance a Ramsey, 2018). Nedávno Dotto a Chacha podporili vykonávanie viacerých výskumných štúdií na zvieratách a klinických štúdiách s cieľom potvrdiť zmierňujúci účinok tekvicových semienok na depresiu (Dotto a Chacha, 2020).

Tieto správy boli povzbudivé na testovanie účinnostitekvicepri zmierňovaní vplyvu chronického stresu na nadobličky. Preto sa táto štúdia uskutočnila s cieľom posúdiť účinok orálneho podávania extraktu Cucurbita pepo L. (CP) na zmiernenie behaviorálnej, biochemickej a adrenálnej štruktúry vyvolanej chronickým nepredvídateľným miernym stresom (CUMS) a preskúmať mechanizmus tohto vplyvu.

Extrakt z púštnej cistanche: Antioxidácia

MATERIÁLY A METÓDY

Extrakcia a dávkovanie tekvice

Cucurbita pepo L. (poukazový exemplár: AQJ_95) bol zakúpený na miestnom trhu v Jeddah, Saudská Arábia. Boli identifikované v herbári Univerzity kráľa Abdulazize pomocou vzoriek herbára a flóry KSA (Chaudhary, 2001). Poukážkové exempláre boli uložené v herbári. CP bol identifikovaný autormi a bol overený botanikom z Prírodovedeckej fakulty Univerzity KingAbdulaziz.

Extrakcia CP sa uskutočnila podľa predchádzajúcich štúdií (Wang et al., 2012). Surové ovocie so šupkou sa nakrájalo pomocou krájača a vysušilo sa pomocou lyofilizátora (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Kórea) a potom sa rozdrvilo pomocou elektrického mlecieho stroja. Prášok prešiel cez 40-sito, čím sa získal jemný prášok a skladoval sa vo vzduchotesnej nádobe. Vysušený prášok (50 g) sa zmiešal so 450 ml 80 % etanolu a nechal sa 1 deň pri 37 stupňoch v trepačke (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact ShakingIncubator., Kórea) a potom sa prefiltroval s bavlnou a filtračným papierom na druhý deň. Tento extrakčný proces sa opakoval dvakrát pri 37 stupňoch, aby sa získal etanolový extrakt.

Identifikácia zložiek CP

Chemické zloženie PE sa analyzovalo pomocou stopovej plynovej chromatografie GC-TSQ evo 800} hmotnostného spektrometra (ThermoScientific, Austin, TX, Spojené štáty americké) s priamou kapilárnou kolónou TG–5MS (30 m × 0,25 mm x 0,25 µm hrúbka filmu). Teplota kolónovej pece bola spočiatku nastavená na 50 stupňov a potom zvýšená o 5 stupňov/min na 250 stupňov a udržiavaná 2 minúty a potom zvýšená na konečnú teplotu 300 stupňov o 25 stupňov/min a udržiavaná 2 minúty. Teploty injektora a MS prenosového potrubia sa udržiavali na 270 a 260 °C; hélium sa použilo ako nosný plyn pri konštantnej prietokovej rýchlosti 1 ml/min. Oneskorenie rozpúšťadla bolo 4 minúty a zriedené vzorky s objemom 3 ul boli vstreknuté automaticky pomocou Autosampler AS1300 spojeného s GC v splitless režime v PTV injektore. Hmotnostné spektrá EI sa zbierali pri 70 eVionizačných napätiach v rozsahu m/z 50–650 v plnom skenovacom režime. Teplota iónového zdroja bola nastavená na 250 stupňov. Zložky boli identifikované porovnaním ich hmotnostných spektier s hmotnostnými spektrálnymi databázami WILEY 09 a NIST 14, ktoré sa používajú na identifikáciu a štúdium chemického zloženia neznámych zložiek v akomkoľvek extrakte (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analýza bola vykonaná nekvalitatívneho typu pomocou softvéru Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 a všetky hodnoty boli uvedené v relatívnom percente (Abd El-Kareem et al., 2016).

Experimentálny dizajn

Táto štúdia bola schválená Etickým výborom pre biomedicínsky výskum na Lekárskej fakulte Univerzity kráľa Abdulazizu, Jeddah, KSA (referenčné číslo {{0}}). V tejto štúdii bolo z King Fahd MedicalResearch Center (KFMRC) získaných štyridsať samcov albínov s hmotnosťou 150–200 g a vo veku 2–3 mesiace. Pred začatím experimentu sa potkany nechali aklimatizovať na laboratórne podmienky počas 1 týždňa. Desať potkanov bolo zaradených ako kontrolná skupina, ktorá zostala nevystavená CUMS. Ďalších tridsať potkanov bolo podrobených procedúre CUMS počas 4 týždňov, ktorá zahŕňala rôzne typy stresorov v rôznych časoch počas dňa, aby sa zabránilo návyku na stres. Postup CUMS bol plne opísaný v predchádzajúcich prácach (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) a bol uvedený v tabuľke 1. Potkany vystavené CUMS boli rozdelené do 3 skupín (n 10). Neošetrená skupina (CUMS) dostávala vehikulum 0,03 percenta karboxymetylcelulózy (CMC-Na) sondou počas 2 týždňov. Skupina liečená FLU dostala FLU (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Ammán, Jordánsko), antidepresívum používané na farmakologickú validáciu, rozpustené v CMC-Na 0,03 percenta v dávke 20 mg/kg žalúdočnou sondou (Li et al. , 2014). Skupina liečená CP dostávala extrakt CP rozpustený v destilovanej vode v dávke 100 mg/kg sondou počas 2 týždňov podľa Wanga a kol. (2012).

Hodnotenie zmien správania

FST sa uskutočnil po 4 týždňoch, aby sa potvrdil účinok CUMS na potkany (Ali et al., 2017). Počas tohto testu bola každá krysa umiestnená do sklenenej valcovej nádoby (výška 20 cm, priemer 14 cm) s 15 cm vody pri 25 ± 2 stupňoch. Potkany boli natáčané na video počas 6 minút pomocou behaviorálneho softvéru (Noldus InformationTechnology, EthoVision XT®) a celkový čas strávený v pohybe počas 6 minút bol meraný technikom slepým k experimentálnym skupinám. Stanovil sa celkový čas v sekundách, ktorý potkany strávili bez pohybu končatín, s výnimkou malého pohybu potrebného na udržanie myši nad vodou, "čas nehybnosti" počas 6 minút.

Biochemické techniky

Dvadsaťštyri hodín po ukončení testu správania sa odobrali vzorky krvi z intraorbitálneho sínusu potkanov po anestetizácii 4 percentami izofluranu (SEDICO PharmaceuticalsCompany, Káhira, Egypt) v 100 percentnom kyslíku. Potom boli potkany usmrtené cervikálnou dislokáciou. Vzorky krvi sa centrifugovali pri 3, 000 otáčkach za minútu počas 15 minút pri 4 stupňoch, aby sa získalo sérum a udržiavali sa pri -18 stupňoch na biochemické hodnotenie.

Hladina kortikosterónu (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Spojené štáty americké) sa stanovila pomocou súprav na imunosorbentný test s enzýmovou väzbou podľa pokynov výrobcu. Podľa pokynov výrobcu boli TNF- a IL-6 (Quantakin R&D system, USA Kit) hodnotené pomocou enzýmového imunosorbentného testu. Optická hustota každej vzorky bola stanovená dvojmo pomocou čítačky mikrodoštičiek ELISA nastavenej na 450 nm.

Na meranie hladiny malóndialdehydu (MDA) spektrofotometricky pri 535 nm (Gamal et al., 2018) sa použila testovacia súprava reaktívnych látok s tiobarbiturovou kyselinou (TBARS) (Biodiagnostic; Egypt). Hladina superoxiddismutázy (SOD) sa merala pomocou testovacej súpravy SOD (Biodiagnostic; Egypt) (Packer, 2002). Stanovenie hladiny glutatiónperoxidázy (GPX) sa uskutočnilo pomocou súpravy GPX (Randox Labs, Crumlin, Spojené kráľovstvo). Na kvantifikáciu aktivity katalázy (CAT) sa vytvorila kalibračná krivka pre test a všetky vzorky pomocou testovacích súprav (Biodiagnostic; Egypt). Metóda je už opísaná (Gamal et al., 2018).

Výhody extraktu z púštnej cistanche: protizápalové

Kvantitatívna PCR v reálnom čase

Extrakcia RNA zo vzoriek tkaniva sa uskutočnila pomocou činidla TriFast™ (PeqLab, Nemecko, kat. č.: 30-2010), ako je opísané v protokole výrobcu. Koncentrácia purifikovanej RNA sa odhadla pomocou spektrofotometra NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Spojené štáty americké). Extrahovaná RNA z každej vzorky bola reverzne prepísaná pomocou súpravy na syntézu cDNA SensiFAST™ pre RT-qPCR (Bioline USA Inc., Spojené štáty americké, kat. č.: BIO-65053), podľa pokynov výrobcu. Syntetizovaná cDNA bola uložená pri -80 stupni až do použitia pre qRT-PCR.

Reakcie qRT-PCR sa uskutočnili pomocou súpravy SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline USA Inc., Spojené štáty, kat. č.: BIO-94002) na zariadení Applied Biosystems 7500skutočné -time PCR detekčný systém (Life technology, Spojené štáty). Priméry boli potom zakúpené od Willowfort™ (Spojené kráľovstvo). Priméry boli GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspáza-3 (dopredu 5- TGTATGCTTACTCTTACCG1CACCCG{101} 20}}GCGCAAAGTGACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGGGCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (dopredu 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, dozadu 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). Zmes PCR sa pripravila nasledovne: 1 0 ul zmesi SensiFASTTM SYBRLo-ROX, 0, 8 ul dopredného priméru, 0,8 ul reverzného priméru, 2 ul cDNA šablóny a 6,4 ul vody bez nukleázy. Reakčná zmes sa preniesla do tepelného cyklovača, ktorý bol predtým naprogramovaný na udržiavanie pri 95 stupňoch počas 2 minút, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 stupňov počas 15 s a potom 60 stupňov počas 30 s. V každom experimente sa uskutočnila negatívna kontrolná reakcia bez templátu.

Uskutočnila sa analýza krivky topenia na preukázanie špecifickosti produktov PCR a hodnota Ct pre každú reakciu sa získala z amplifikačných grafov. Relatívna kvantifikácia pre každú génovú expresiu vo vzorkách tkaniva sa vypočítala pomocou metódy porovnávacieho prahu (ACt) s GAPDH ako vnútorným kontrolným génom. Pre celkovú násobnú zmenu bola vypočítaná a linearizovaná pomocou aritmetického vzorca 2−ΔACt.

Histologické techniky

Na konci experimentu a po anestetizácii potkanov sa otvorilo brucho a vyrezala sa pravá nadoblička. Na získanie parafínových blokov sa uskutočnila fixácia nadobličiek v 10 percentnom neutrálnom pufrovanom formalíne a ďalšie procesy. Parafínové rezy s hrúbkou 4-μm boli pripravené a zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E). Okrem toho boli ďalšie parafínové rezy imunohistochemicky zafarbené pomocou techniky streptavidín-biotín-peroxidázy. Sklíčka sa inkubovali cez noc pri 4 stupňoch a potom sa inkubovali s monoklonálnou anti-Ki67 (Dako Cytomation, USA, v riedení 1:1, 000) ​​na demonštráciu bunkovej proliferácie. Okrem toho sa na detekciuapoptóza. Použila sa aj polyklonálna protilátka proti proteínu tepelného šoku-70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Spojené štáty americké, v riedení 1:1,000). Použila sa zodpovedajúca biotinylovaná konjugovaná sekundárna protilátka z farbiaceho systému Dako. Sklíčka zafarbené len sekundárnou protilátkou sa použili ako negatívne kontroly.

Jadrá boli kontrastne zafarbené hematoxylínom. Browncytoplazmatické farbenie sa považovalo za pozitívnu reakciu. Zafarbené rezy sa skúmali a fotografovali pomocou mikroskopu Olympus BX{{0}} (Olympus) pripojeného k digitálnemu fotoaparátu a počítaču. Semikvantitatívna analýza imunoreaktivity protilátok sa uskutočnila pomocou softvéru na analýzu obrazu Pro Plus. Percentuálna plocha imunopozitívnej reakcie sa hodnotila v 30 poliach pri 400-násobnom zväčšení. Pozitívne bunky sa spočítali na 1,0 mm2 plochy, ako opísali Zhou et al. (2016). Preskúmalo sa najmenej päť polí z každého sklíčka a pre každé zviera sa vypočítal priemer.

Na morfometrickú analýzu sa skúmali štyri rezy u každého zvieraťa (zväčšenie x 100). Hrúbka rôznych zón nadobličiek bola meraná v mikrometroch. Hrúbka kôry nadobličiek sa získala meraním vzdialenosti medzi dreňom a kapsulou nadobličiek v priamej línii, jedno meranie sa uskutoční v každom kvadrante kôry nadobličiek.

Štatistická analýza

Behaviorálne, biochemické a imunohistochemické údaje boli analyzované Štatistickým balíkom pre sociálne vedy (SPSS) verzia 16. Premenné štúdie boli ovplyvnené dvoma nezávislými faktormi: vystavením stresu a liečbe. Preto sa vykonala analýza s použitím zmiešaného modelu obojsmernej ANOVA na základe Bonferroniho post hoc. Štatistická významnosť bola uvažovaná pri p <>

Výhody púštnej cistanche: proti starnutiu

VÝSLEDKY

Výsledky správania

Čas nehybnosti počas FST bol výrazne vyšší (p=0.03) v skupine CUMS ako v kontrolnej skupine, zatiaľ čo bol výrazne nižší (p=0.01, p=0.001) v skupinách liečených FLU a CP ako v skupine CUMS (obrázok 1A).

Výsledky analýzy extraktu CP použitím GC-MS

Medzi hlavné zlúčeniny zistené v CP patrí najmä kyselina olejová (asi 56 percent), kyselina palmitová (asi 8,9 percenta), kyselina linolénová 3,5 percenta a kyselina linolová 2,8 percenta okrem mnohých iných zlúčenín (tabuľka 2; obrázok 2). Medzi zlúčeninami CP, o ktorých sa uvádza, že majú protizápalový účinok, sú kyselina olejová, kyselina palmitová, kyselina linolénová, betulín a kyselina linolová, zatiaľ čo zlúčeniny santioxidantúčinku sú kyselina palmitová, 10-oktadecénová kyselina a metylester.

Biochemické hodnotenie

Hladina kortikosterónu v sére

Hladina kortikosterónu významne zvýšila (p < {0}} 0,001) neliečených potkanov vystavených CUMS v porovnaní s kontrolnými potkanmi, zatiaľ čo potkany liečené FLU a CP vykazovali významné zníženie (p < 0,001) sérového kortikosterónu hladina v porovnaní s hladinou u neošetrených potkanov vystavených CUMS (obrázok 1B).

Hladiny TNF- a IL-6 v sére

Na konci experimentu hodnotenie sérového TNF- a IL-6 ukázalo, že boli významne zvýšené (p < 0,001) v skupine CUMS, zatiaľ čo vykazovali významné zníženie (p< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

Hladiny MDA, SOD, GPX a CAT v sére

Zistilo sa, že hladina sérového MDA bola významne vyššia (p < {0}},001)="" v="" skupine="" cums="" ako="" u="" kontrolných="" potkanov,="" zatiaľ="" čo="" v="" skupinách="" liečených="" cp="" bola="" významne="" nižšia="" (p="" 0,003)="" než="" u="" neliečených="" potkanov="" vystavených="" cums.="" podávanie="" flu="" nemohlo="" významne="" znížiť="" hladinu="" mda="" u="" potkanov="" vystavených="" cums="" (obrázok="">

Naproti tomu hladiny SOD, GPX a CAT v sére skupiny CUMS boli významne nižšie (p < {{0}}.001,="" p="">< 0,001,="" p="0" 0,002)="" ako="" v="" sére="" kontrolnej="" skupiny,="" zatiaľ="" čo="" ich="" hladiny="" vykazovali="" významný="" nárast="" (p="0,01," p="0,003," p="" 0,03)="" v="" skupine="" liečenej="" cp="" v="" porovnaní="" s="" tými="" v="" skupine="" vystavených="" cums.="" podávanie="" flu="" nemohlo="" významne="" zvýšiť="" sod,="" gpx="" a="" cat="" u="" potkanov="" vystavených="" cums="" (obrázky="" 3b="" –="">

Génová expresia Ki67, kaspázy-3 a HSP70

RT-PCR odhalila nevýznamne vysokú expresiu génu Ki67 (p=0.14) v nadobličkách skupiny CUMS v porovnaní s kontrolnou skupinou, zatiaľ čo skupiny liečené FLU a CP vykazovali signifikantne vysokú expresiu (p {{6 }}.02, p 0.01) v porovnaní so skupinou vystavenou CUMS (obrázok 3E). Pokiaľ ide o kaspázu-3, jej génová expresia bola výrazne zvýšená (p < 0,001) v nadobličkách skupiny CUMS v porovnaní s kontrolnou skupinou, zatiaľ čo skupiny liečené FLU a CP vykazovali významný pokles (p=0,03, p=0,04) v porovnaní so skupinou vystavenou CUMS (obrázok 3F). Pokiaľ ide o expresiu génu HSP70, zaznamenala signifikantne vyššie (p < 0,001) hladiny v nadobličkách v skupine CUMS ako v kontrolnej skupine, zatiaľ čo u FLU a Skupiny liečené CP vykazovali nevýznamný pokles (p=0,07,p=0,08) v porovnaní so skupinou vystavenou CUMS (obrázok 3G).

Histopatologické hodnotenie

Nadobličky kontrolných potkanov majú neporušenú štruktúru so zachovanou architektúrou kôry vrátane zona glomerulosa, zona fasciculata a zona reticularis, ako aj medulla (obrázok 4). Nadobličky potkanov exponovaných CUMS vykazovali veľa buniek v ZG, ZF a ZR so zjavnou vakuolizáciou a degenerovanými jadrami a niekedy hlboko zafarbenými jadrami s miernym zhrubnutím v kapsule a trabekulách spojivového tkaniva. Mnohé bunky ZR sa zdali tmavé s pigmentmi hnedého lipofuscínu. Na druhej strane nadobličky potkanov liečených CP vykazovali menej zjavne vakuolizovaných buniek a hlboko zafarbené jadrá v ZG a ZF a ZR odhalili málo tmavých buniek.

Morfometrické merania ukázali, že hrúbka ZG a ZR vykazovala nevýznamný nárast po vystavení CUMS, zatiaľ čo pri FLU- sa výrazne zvýšila (p 0.01, p 0,02) a skupiny liečené CP (p=0.02, p=0.001), v tomto poradí. Pokiaľ ide o hrúbku ZF, bola významne zvýšená (p 0,02) v skupine vystavenej CUMS a ďalej sa zvýšila, ale nevýznamne, v skupinách liečených FLU a CP v porovnaní s neliečenou skupinou CUMS.

Aby sa určilo, či bola bunková hyperplázia obmedzená na špecifickú podoblasť nadobličiek, použilo sa imunohistochemické značenie pre Ki67 (marker deliacej sa bunky). Počet Ki67-pozitívnych proliferujúcich buniek sa významne zvýšil (p < 0.001)="" v="" zf="" po="" expozícii="" cums,="" zatiaľ="" čo="" liečba="" flu="" a="" cp="" sa="" nevýznamne="" zvýšila="" v="" porovnaní="" s="" neliečenou="" skupinou="" cums.="" hoci="" počet="" proliferujúcich="" buniek="" bol="" nevýznamne="" zvýšený="" v="" zg="" a="" zr="" a="" nevýznamne="" znížený="" v="" dreni="" skupiny="" cums="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou,="" liečba="" flu="" a="" cp="" významne="" zvýšila="" počet="" proliferujúcich="" buniek="" v="" zg="" (p="0,001" ,="" p="0,003)," zr="" (p="">< 0,001)="" a="" dreň="" (p="0,004," p="0,003)" v="" porovnaní="" s="" neliečenou="" skupinou="" cums="" (obrázky="" 4,="">

Na vyhodnotenie sa vykonalo imunohistochemické farbenie pomocou kaspázy{0}}apoptóza(Obrázok 6). Bolo zaznamenané, že percentuálna plocha expresie kaspázy-3 sa výrazne zvýšila (p < 0.001)="" vo="" všetkých="" zónach="" žľazy="" po="" vystavení="" cums="" počas="" 4="" týždňov="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou.="" skupina="" liečená="" cp="" vykazovala="" významné="" zníženie="" expresie="" kaspázy-3v="" zg="" (p="">< 0,001),="" zf="" (p="">< 0,001),="" zr="">< 0.001,="" p=""
="" 0.005),="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.001)," in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

Plošné percento expresie HSP70 sa významne zvýšilo (p < 0,001) vo všetkých zónach kôry, ako aj v dreni nadobličiek v skupine CUMS v porovnaní s kontrolnou skupinou, zatiaľ čo bolo nevýznamne znížené v všetky zóny a dreň skupín liečených FLU a CP v porovnaní so skupinou CUMS (obrázky 5).

Sušené plátky Cistanche tubulosa

DISKUSIA

Moderná spoločnosť je zjavne plná stresu, ktorý môže vyplynúť z každodenných problémov, zdravotnej starostlivosti a problémov súvisiacich s prácou. Tieto stresory môžu spôsobiť takzvané poruchy súvisiace so stresom (Clayton a Mccance, 2014). V tejto štúdii bol etanolový extrakt z dužiny a šupky Cucurbita pepo L. použitý na skúmanie jeho potenciálu pri zmierňovaní depresívneho správania vyvolaného CUMS a jeho vplyvu na nadobličky. To bolo dokázané signifikantným zvýšením sérovej hladiny kortikosterónu a overené predĺženým časom imobility počas FST. Tieto zistenia boli v súlade s tými, ktoré boli predtým uvedené (Tang et al., 2015).

Uvádza sa, že TNF- aj IL-6 sa podieľajú na patogenéze depresie (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozziet al., 2020). Bolo hlásené, že myši s deficitom IL-6 alebo TNF- receptorov sú odolné voči depresívnemu správaniu (Viana et al., 2010). Preto boli v tejto štúdii hodnotené a bolo pozorované, že TNF- aj IL{ {9}} boli významne zvýšené v terapii potkanov vystavených CUMS počas 4 týždňov, čo naznačuje, že boli depresívne. Toto zistenie podporili Numakawa et al. (2014) u myší so zúfalým správaním a Taraz et al. (2015) u pacientov s depresiou.

V tejto štúdii bolo podávanie tekvicového extraktu spojené so zlepšením depresívneho správania, čo je zrejmé z významného skrátenia času imobility FST a potvrdeného významným znížením inkortikosterónu a zápalových cytokínov TNF- a IL-6 v sére. Tieto zistenia podporili Kim Nr a kol. (2016), ktorí uviedli, že SSP počas 28 dní znížilo hladinu zápalových cytokínov u depresívnych potkanov. Protizápalová aktivitatekvicamožno pripísať aktívnym zlúčeninám tekvice, ako sú kyselina olejová a palmitová a estradiol.

Downregulácia kyseliny olejovej, kyseliny palmitovej a kyseliny linolovej bola opísaná pri depresii (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). Uvádza sa, že neuroprotekcia sprostredkovaná kyselinou olejovou je spojená s jej protizápalovým účinkom sprostredkovaným aktiváciou receptora gama aktivovaného peroxisomeproliferátorom (PPAR-) (Song et al., 2019). Okrem toho sa uvádza, že kyselina palmitová inhibuje fosfolipázu A(2), a preto. považovaný za protizápalovú zlúčeninu (Aparna et al., 2012). Estradiol bol jednou zo zlúčenín tekvice zistených v tejto štúdii. Uvádza sa, že estradiol vyvoláva protizápalový účinok a následne zmierňuje depresívne správanie (Xu et al., 2015). Ďalším mechanizmom, ktorým môže estradiol vyvolať anantidepresívny účinok, je zvýšená regulácia expresia mozgového neurotrofického faktora (BDNF) a fosforylácia ERK aktiváciou ER- v mozgu (Yang et al., 2010).

V tejto štúdii bola hladina MDA v sére zvýšená, zatiaľ čo hladiny SOD, GPX a CAT boli znížené u potkanov vystavených CUMS. Podobné zmeny boli zdokumentované po expozícii CUMS v predchádzajúcich štúdiách a dodali, že tieto biochemické zmeny viedli k oxidačnému stresu a poškodeniu HPA (Nabavi et al., 2015). Liu T. a kol. (2015) tiež uvádza, že rozvoj depresie možno pripísať nízkemu obsahu antioxidantov v tele. Antioxidačné vlastnostitekvicaovocný extrakt boli často uvádzané (Bahramsoltani et al., 2017). Okrem toho sa uvádza, že šupka z dužiny Cucurbita pepo L. má vyššiu antioxidačnú aktivitu ako ostatné časti, napríklad semená (Oyeleke et al., 2019). Podávanie tekvicového extraktu v mnohých predchádzajúcich štúdiách významne zvýšilo hladiny SOD a GPX a znížilo MDA v sére myší (Guo-Huaet al., 2000; Dang, 2004) a tento účinok bol tiež zdokumentovaný v tejto štúdii. Preto,antioxidantaktivita tekvice by mohla byť za jej antidepresívnym účinkom evidentným v tejto štúdii. To je v súlade s pozorovaniami Kim Nr a kol. (2016). Bolo hlásené, že prírodné produkty s protizápalovýmantioxidanta účinky proti únave majú tiež účinok podobný anantidepresívam (Jeong et al., 2015). Všetky tieto predchádzajúce aktivity boli preukázané v rtekvice.

Cistanche pôsobí proti starnutiu

Zvýšenú cytoplazmatickú vakuolizáciu buniek kôry nadobličiek, pozorovanú v skupine CUMS v tejto štúdii, možno pripísať zvyšujúcemu sa dopytu po lipidoch, ktoré tvoria základný kameň syntézy kortizolu. Ciganková a spol. (2005) pozorovali, že dlhotrvajúca experimentálna hyperdynamika viedla ku koalescencii viacerých cytoplazmatických lipidových kvapiek kortikálnych buniek. Tieto lipidové kvapôčky obsahujú cholesterol, ktorý je hlavným prekurzorom syntézy steroidných hormónov. Koldysheva a Lushnikova (2008) však uviedli, že stres viedol k významnému zníženiu lipidových kvapôčok v bunkách kôry nadobličiek, najmä ZF (Koldysheva a Lushnikova, 2008). Bolo opísané, že po vystavení fyzickému stresu sa bolestivé podnety prenášajú do hypotalamu, čo vedie k sekrécii CRH do hypofýzového portálneho systému, čo zvyšuje sekréciu ACTH a stimuluje jeho receptory v ZF a ZR na zvýšenie sekrécie kortizolu (Patti et al., 2018). Zhrubnutá kapsula nadobličiek a trabekuly pozorované u potkanov vystavených CUMS boli predtým hlásené (El-Desouki a kol., 2011; Altayeb a Salem, 2017) ako výsledok zvýšenej syntézy kolagénu fibroblastmi pri vystavení imobilizačnému stresu.

Mnohé bunky v nadobličkách potkanov vystavených CUMS vykazovali hlboko zafarbené jadrá, čo naznačuje, že podstúpili apoptózu, ktorá bola potvrdená kaspázovým-3 imunohistochemickým farbením. Podobné pozorovanie uviedli Altayeb a Salem (2017), keď študovali účinok imobilizačného stresu na nadobličky potkanov. Liu Q. a kol. (2015) uviedli, že nadmerný oxidačný stres, evidentný po vystavení CUMS v tejto štúdii, mení hladiny expresie „apoptóza-relatedgenes" a indukuje bunkovú apoptózu a degeneráciu prostredníctvom signálnych dráh Bcl-2, Bax a kaspázy-3. Tento mechanizmus bol v tejto štúdii potvrdený pomocou RT-PCR, ktorá odhalila významnú upreguláciu génu kaspázy{4}} Pri preskúmaní literatúry sa nezistil žiadny priamy účinok Cucurbita pepo na kaspázou{5}}-sprostredkovanú apoptózu v rôznych tkanivách. Zdá sa, že zníženie kaspázových-3-pozitívnych apoptotických buniek zistených v nadobličkách sa pripisujeantioxidantúčinok Cucurbita pepo zdokumentovaný v tejto štúdii. Toto je podporené mnohými predchádzajúcimi štúdiami vykonanými na iných rastlinách a bylinách s významnými antioxidačnými aktivitami (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

Táto štúdia ukázala, že vystavenie CUMS zvýšilo Ki67-pozitívne bunky v kôre nadobličiek, čo bolo výrazne evidentné v ZF, čo naznačuje zvýšený počet proliferujúcich buniek a v dôsledku toho sa hrúbka tejto vrstvy výrazne zvýšila. na druhej strane, počet Ki67-pozitívnych proliferujúcich buniek sa v dreni v reakcii na CUMS nevýznamne znížil. Tieto pozorovania boli v súlade s pozorovaniami Ulricha-Laia et al. (2006), ktorí zaznamenali zvýšenie Ki{{ 4}} pozitívne bunkové jadrá len vo vonkajšom ZF po vystavení chronickému premenlivému stresu, zatiaľ čo medulla vykazovala bunkovú hypertrofiu a nie hyperpláziu. Laborie et al., (2003) navyše hlásili zovšeobecnené zvýšenie funkcie drene po vystavení chronickému stresu, čo naznačuje, že chronický stres môže viesť k medulárnej hypertrofii. V tejto štúdii podávanietekvicaextrakt významne zvýšil bunkovú proliferáciu, čo je zrejmé z upregulácie génu Ki67 a imunoexpresie takmer vo všetkých zónach a dreni nadobličiek v porovnaní s CUMS. To vysvetlilo zvýšenú hrúbku zón žľazy zaznamenanú v tejto štúdii. Môže tiež kompenzovať apoptotický účinok vyvolaný expozíciou CUMS. Toto zistenie podporujú Kim Hy et al. (2016) oznámili významnú upreguláciu expresie mRNA Ki67 a proliferáciu splenocytov izolovaných zo sleziny myší BALB/c liečených SSP, streamed a Cucurbita moschataDuch a jeho hlavnou zložkou, -karoténom.

V tejto štúdii expozícia CUMS významne zvýšila génovú expresiu a imunoexpresiu HSP70 vo všetkých zónach nadobličiek. V súlade s tým Zheng a kol. (2008) tiež dokázali, že zvýšená expresia HSP70 po vystavení stresovým podmienkam moduluje zápalové reakcie inhibíciou aktivácie zápalového transkripčného faktora, jadrového faktora-kappa B(NF-kappaB). Okrem toho môže HSP70 priamo interferovať s apoptózou a nekrózou (Yenari et al., 2005). Nedávno Liet al. (2019) uviedli zvýšenú reguláciu expresie HSP70 v tkanive nadobličiek ošípaných po vystavení tepelnému stresu, čo naznačuje úlohu HSP70 pri poškodení nadobličiek a zdôrazňuje jeho význam pre zápalové reakcie. Rýchla indukcia HSP70 v reakcii na stres sa považuje za nevyhnutnú pre proces bunkovej ochrany.

V našej štúdii bola liečba potkanov vystavených CUMS pomocoutekvicebolo spojené s nevýznamným znížením expresie HSP70, ktoré bolo spojené so zníženou apoptózou a zápalovými odpoveďami. To by mohlo poukazovať na priaznivý účinok relatívne vysokej hladiny HSP70 vyvolanej FLU aj CP, keďže viedlo k zníženiu kaspázou-3 sprostredkovanejapoptózaa uvoľňovanie zápalových cytokínov. Hoci účinok tekvíc na rodinu proteínov tepelného šoku nebol predtým opísaný, kyselina olejová, ktorá predstavuje hlavné zložkytekvicepoužitý v tejto štúdii bol opísaný na zníženie expresie HSP60 v bunkovej línii ľudských T lymfocytov (Martins De Lima et al., 2004), čo podporuje zistenia našej štúdie. Navrhovaný mechanizmus účinku Cucurbita pepo asan látky podobnej antidepresívam je zhrnutý na obrázku 7. Medzi obmedzenia tejto štúdie patrila neschopnosť ďalej skúmať hĺbkový mechanizmus antidepresívneho účinku CP, a preto sa odporúča vykonať ďalšiu štúdiu. .

Na záver, táto štúdia poskytuje vedecky podložené dôkazy o účinnosti extraktu Cucurbita pepo L. na zmiernenie behaviorálnych a biochemických zmien vyvolaných CUMS, ako aj histopatologického vplyvu na nadobličky. Tieto účinky boli zrejmé prostredníctvom zníženia regulácieapoptózaa HSP70 a zdalo sa, že sú sprostredkované cezantioxidanta protizápalový účinok Cucurbita pepoL. extrakt. Hoci táto štúdia a niektoré ďalšie nedávne štúdie zdokumentovali antidepresívny účinok Cucurbita pepo a preskúmali jej mechanizmus, na potvrdenie tohto účinku u ľudí sú potrebné ďalšie štúdie vrátane klinických štúdií.

Granule Cistanche