Antioxidačné a antimelanogénne účinky tepelne upraveného sladkého drievka (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* a Hyung Don Kim 1,*
Abstrakt:Melanín je hnedý alebo čierny pigment, ktorý chráni pokožku pred ultrafialovým žiarením a reaktívnymi formami kyslíka (ROS). Nadprodukcia melanínu je však spojená s lentigínmi, melazmou, pehami a rakovinou kože.Sladké drievkoukázalantioxidant, protinádorové, protidoštičkové, protizápalové a imunomodulačné aktivity a používa sa ako prírodná liečba pokožkybielenie.Naším cieľom bolo potvrdiť potenciál Wongamu, nového kultivaru sladkého drievka vyvinutého Úradom pre rozvoj vidieka (RDA), akobielenieagent v kozmetike. Okrem toho sme porovnávaním overili vplyv tepelného spracovania na bioaktivitu sladkého drievkaantioxidantaanti-melanogénneaktivity extraktu zo sladkého drievka pred a po zahriatí (130 ◦C). Tepelne upravený extrakt zo sladkého drievka (WH-130) vykazoval vyššie aktivity na zachytávanie radikálov v ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-etylbenzotiazolín-6-sulfónová kyselina) diamónna soľ) a testy DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl). Okrem toho WH-130 účinnejšie inhibovala melanogenézu v dôsledku zníženia regulácie tyrozinázy v bunkách melanómu B16F10 ako nezahrievanésladké drievkoextrakt. Okrem toho tepelné spracovanie zvýšilo celkový obsah fenolov. Najmä izoliquiritigenín, anantioxidantaanti-melanogénnezlúčenina sladkého drievka, bola vyrobená tepelným spracovaním. Záverom možno konštatovať, že WH-130 so zvýšenými hladinami bioaktívnych fenolických látok, ako je izoliquiritigenín, má potenciál pre vývoj na novú pleťbieleniemateriál s aplikáciami v kozmetike.
Kľúčové slová: anti-melanogénnečinnosť; tepelné spracovanie;sladké drievko; bunky myšacieho melanómu (B16F10)
1. Úvod
Sladké drievko(druh Glycyrrhiza), trváca bylina s liečebným využitím z čeľade Leguminosae, je široko rozšírená v Strednej Ázii, Číne, Rusku, Mandžusku, Mongolsku a Európe [1]. Už dlho sa používa ako ochucovadlo a sladidlo. Sušený koreň a štóla sladkého drievka sa používajú na liečbu prechladnutia, kašľa, astmy, únavy a infekcií dýchacích ciest v dôsledku biologických aktivít sladkého drievka vrátaneantioxidant,antimikrobiálne, protinádorové, protidoštičkové, protizápalové a imunomodulačné aktivity [2,3]. Rod Glycyrrhiza pozostáva z približne 22 druhov sladkého drievka, vrátane G. uralensisFisch, G. glabra L. a G. inflata Batal.
Wongam, nový medzidruhový hybridný kultivar sladkého drievka, bol vyvinutý Správou rozvoja vidieka ako hybrid Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam má vyššie výnosy a lepšiu odolnosť voči chorobám ako G. uralensis. Uskutočnilo sa množstvo štúdií o biologických aktivitách G. uralensis, zatiaľ čo existujúci výskum Wongama, nového kultivaru, sa obmedzuje na jeho antialergické, imunomodulačné a protivredové aktivity [1,2]. Preto je potrebné preskúmať širokú biologickú aktivitu Wongamu.
Hlavné bioaktívne zložky vsladké drievkokoreň sú flavonoidy a triterpénové saponíny, vrátane liquiritínu, liquiritigenínu, izoliquiritigenínu (ISL) a glycyrizínu (alebo kyseliny glycyrrhizicaovej) [4,5]. ISL je flavonoid nachádzajúci sa v sladkom drievku, ktorý vykazuje rôzne farmaceutické aktivity vrátane protidoštičkových, protialergických, protinádorových, protizápalových aantioxidantčinnosti [6–8]. ISL je produkt hydrolýzy izoliquiritínu v koreni sladkého drievka. Môže inhibovať melanogenézu prostredníctvom degradácie transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF) aktiváciou signálnej dráhy proteínkinázy regulovanej extracelulárnym signálom (ERK). V dôsledku toho degradácia MITF potlačila expresiu génov tyrozinázy (TYR) a proteínov súvisiacich s tyrozinázou (TRP-1 a TRP-2) v SK-MEL-2 bunkách [9,10].ISL môže inhibovať mono- a difenolázové aktivity hubovej TYR, ako aj melanogenézu v melanocytoch [11].
Melanín, hlavný pigment dodávajúci farbu pleti, sa syntetizuje v epidermálnych melanocytoch a je uložený v intracelulárnych organelách nazývaných melanozómy [12]. Melanínové pigmenty pozostávajú z dvoch typov: hnedý alebo čierny eumelanín a červený alebo žltý feomelanín [12]. Melanogenéza môže byť vyvolaná vonkajšími stimulmi, vrátane ultrafialového (UV) žiarenia, reaktívnych druhov kyslíka (ROS) a chemikálií, ako je hormón stimulujúci melanocyty (-MSH) a izobutylmetylxantín (IBMX), ktorý zvyšuje hladiny cyklického adenozínmonofosfátu (cAMP). Melanín chráni pokožku pred týmito stimulmi, zatiaľ čo jeho nadprodukcia spôsobuje hyperpigmentáciu kože, ktorá môže viesť k ochoreniam, ako je rakovina kože [13–17]. Kožabieleniečinidlá, ako je kyselina kojová, hydrochinón, arbutín a kyselina askorbová, ktoré sú inhibítormi TYR, sa používajú na liečbu hyperpigmentácie v niekoľkých kozmetických výrobkoch [13,18]. Melanogenéza je regulovaná prostredníctvom rôznych signálnych dráh a tieto signály sú spojené s upreguláciou MITF. Aktivácia MITF podporuje expresiu TYR a TRP (TRP-1, TRP-2). Potom TYR katalyzuje oxidáciu L-tyrozínu na 3,4-dihydroxy-L-fenylalanín (L-DOPA), ktorý sa následne oxiduje na DOPAchinón. TRP-2 premieňa dopachróm na 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylovú kyselinu (DHICA) alebo 5,{15}}dihydroxyindol (DHI). Nakoniec sú DHICA a DHI oxidované TRP-1, čo vedie k inmelanogenéze [19].
Tepelné procesy ovplyvňujú fyzikálno-chemické a biologické vlastnosti rastlinných extraktov. Ničia bunkové steny a štiepia kovalentné väzby, čo vedie k uvoľňovaniu bioaktívnych zlúčenín [20,21]. Tepelná úprava extraktov z pivovarských mlátov nad 130 ◦Zvyšuje celkový obsah fenolov (TPC) a celkový obsah flavonoidov (TFC) so zodpovedajúcim zvýšením antioxidačných aktivít [16,20,21]. Zahrievanie citrusových šupiek môže viesť k uvoľneniu fenolových zlúčenín a zvýšeniuantioxidantčinnosť [17].
Naším hlavným cieľom je potvrdiť potenciál Wongamu ako prirodzenej kožebieleniemateriál v kozmetike. Okrem toho je cieľom tejto štúdie tiež dokázať, či tepelná úprava môže zlepšiť antioxidačné a antimelanogénne aktivitysladké drievko. Skúmali smeantioxidantčinnosti spolu s TPC extraktov Wongamu.Anti-melanogénneúčinky Wongamových extraktov boli overené inhibičnou aktivitou TYR a obsahom melanínu v bunkách melanómu.
Cistanche je prírodnýkožabielenie bylina
2. Materiály a metódy
2.1. Príprava vzorky
Vzorky boli pripravené podľa predtým opísanej metódy [22].Sladké drievko(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, identifikovaný Yun Ji Lee z NIHHS, RDA a zaregistrovaný v Kórejskom herbári liečivých zdrojov s číslom kupónu MPS006326) bol kultivovaný a zozbieraný na oddelení výskumu bylinných plodín (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Kórea ) v roku 2018 a suší sa pri 60 ◦C počas 20 hodín. 10 kgsladké drievkoumyl a 1 kg sa pomlelo. Po ich zmiešaní sa získali 3 vzorky WC, resp. WH. Mleté sladké drievko (5 g) sa umiestnilo do sklenenej nádoby s 1 ml destilovanej vody a spracovalo sa v autokláve (Jisico, Soul, Kórea) počas 1 hodiny pri teplote 130 ◦C (WH-130). Neošetrené kontrolné sladké drievko (WC , 5 g) a WH-130 boli oddelene extrahované použitím 70 percentného etanolu (vzorka: rozpúšťadlo, 1:50, objem:objem) počas 24 hodín pri teplote miestnosti (RT). Po filtrácii boli extrakty odparené vo vákuu, lyofilizované a skladované pri -80 °C. Všetky extrakty boli rozpustené v dimetylsulfoxide (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) a metanole (Sigma, St. Louis, MO, USA).
2.2. Stanovenie Browningu
Index zhnednutiasladké drievkoextraktov (WC a WH{0}}) sa zaznamenala na základe ich hodnoty absorbancie pri 420 nm (A420) meranej pomocou čítačky mikrodoštičiek (BioTek, Winooski, VT, USA). Vyššie hodnoty absorbancie pri 420 nm zodpovedajú vyššiemu indexu hnednutia [23,24].
2.3. Celkový obsah fenolov (TPC)
Podľa predtým publikovanej metódy [25] sa TPC meral na základe princípu, že Folin-Ciocalteuovo činidlo sa redukuje na modrý chromofór zložený z komplexu afosfowolfrám-fosfomolybdén v závislosti od alkalických podmienok a od koncentrácie fenolových zlúčenín. Každá vzorka (10 ul) sa zmiešala s 2 percentami uhličitanu sodného (200 ul) a potom Folin-Ciocalteuovým činidlom (10 ul). Zmes sa aktivovala 30 minút pri teplote miestnosti. Potom sa merala absorbancia pri 750 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC sa vypočítal zo štandardnej krivky kyseliny galovej a výsledky sa vyjadrili ako ekvivalentné hodnoty kyseliny galovej, mg extraktu GAE g-1.
2.4. Stanovenie antioxidačnej kapacity
Aktivita zachytávania radikálov bola meraná s použitím diamónnej soli 2,20-azino-bis-(3-etylbenzotiazolín 6-sulfónovej kyseliny) (ABTS) podľa skôr opísanej metódy s miernou modifikáciou [19, 26]. Roztok radikálového katiónu ABTS sa pripravil zmiešaním 2,6 mM persíranu draselného a 7,4 mM ABTS a nechal sa reagovať 24 hodín pri atRT. Roztok ABTS sa potom zriedil destilovanou vodou, aby sa absorbancia upravila na rozsah 1.{15}}–1 500. Ďalej sa 20 ul vzorky nechalo reagovať so 180 ul roztoku ABTS plus, chráneného pred svetlom, a zmes vzorky a roztoku sa inkubovala 30 minút pri teplote miestnosti. Absorbancia sa merala pomocou čítačky mikrodoštičiek (BioTek, Winooski, VT, USA) pri 735 nm. Zo štandardnej krivky Trolox, ekvivalent Troloxuantioxidantkapacita (TEAC) bola vypočítaná a vyjadrená v mg troloxového ekvivalentu (TE) na g suchej vzorky.
2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylový (DPPH) radikálový roztok sa pripravil rozpustením 0,2 mM DPPH v 99 percentnom etanole. Roztok DPPH sa zriedil destilovanou vodou na anabsorbanciu pri 520 nm 1000–1500. Potom sa 50 ul vzorky zmiešalo s 200 ul roztoku DPPH a nechalo sa reagovať 30 minút pri teplote miestnosti. Po reakcii sa stanovila absorbancia zmesi pri 520 nm. Zo štandardnej krivky Trolox sa vypočítal TEAC a vyjadril sa v mg TE na g suchej vzorky.
2.5. Analýza vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC).
Použila sa modifikovaná metóda HPLC [22]. Obsah ISLsladké drievkoextrakty sa analyzovali pomocou HPLC s UV-viditeľným detektorom (HPLC: séria 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; kolóna: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Mobilná fáza pozostávala z rozpúšťadla A (0,1 % kyseliny mravčej vo vode) a rozpúšťadla B (0,1 % kyseliny mravčej v acetonitrile). Gradientový program pre mobilnú fázu sa prevádzkoval pri nasledujúcom gradiente: 0–8 minút (20–20 percent B), 8–30 minút (20–38 percent B), 30–42 minút (38–50 percent B), 42 – 47 minút (50 – 90 percent B), 47 – 53 minút (90 – 90 percent B), 53 – 54 minút (90 – 20 percent B) a 54 – 60 minút (20 – 20 percent B) . Prietok, detekčná vlnová dĺžka a objem injekcie boli nastavené na 1,0 ml/min, 360 nm a 10 ul, v danom poradí. ISL štandardné roztoky sa analyzovali so štyrmi rôznymi koncentráciami (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/ml). Na určenie obsahu ISL sa použila kalibračná krivka (y=ax plus b). V regresnej rovnici x označuje koncentráciu ISL (mg ml-1) a y znamená plochu píku.
2.6. Test inhibičnej aktivity tyrozinázy húb
Test inhibičnej aktivity TYR sa uskutočnil s použitím súpravy na skríning inhibítora TYR (BioVision, Milpitas, CA, USA). Každý extrakt (WC a WH{0}}) sa rozpustil v DMSO na konečnú koncentráciu 250 ug/ml. Kyselina kojová, použitá ako pozitívna kontrola, bola tiež zriedená na 250 ug/ml v DMSO. Stručne povedané, 20 ul extraktu alebo kyseliny kojovej sa spojilo s 50 ul roztoku enzýmu TYR. Po inkubácii pri teplote miestnosti počas 10 minút sa do každej jamky pridalo 30 ul roztoku substrátu TYR. Konečná koncentrácia extraktov a kyseliny kojovej bola 50 ug/ml. Optická hustota jamiek sa potom merala pri 510 nm v kinetickom režime počas 1 hodiny pomocou čítačky mikrodoštičiek (BioTek, Winooski, VT, USA).
cistanche prášok: antioxidačný
2.7. Bunková kultúra
Bunky myšacieho melanómu B16F10 sa získali z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Bunky B16F10 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra (FBS), 100 jednotkami/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu (Gibco, Grand Island, NY, USA) s obsahom 5 % vo zvlhčenej atmosfére. percent CO2 pri 37 ◦C.
2.8. Test bunkovej životaschopnosti
Cytotoxicitasladké drievkoextraktov (WC a WH-130) do buniek B16F10 bola stanovená pomocou MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,{{8 }}difenyltetrazólium bromid]. Bunky B16F10 sa kultivovali pri 4 x 103 buniek/jamku na 96-jamkovej platni počas 24 hodín. Potom boli k bunkám pridané extrakty v koncentráciách 50, 100 a 200 ug/ml a inkubované pri 37 °C počas 48 hodín. Potom sa do každej jamky pridal MTT roztok (500 ug/ml) a doštička sa inkubovala 1 hodinu pri 37 °C. Médium v každej jamke sa odstránilo a pridalo sa 100 ul DMSO. Po trepaní počas 30 minút sa merala absorbancia pri 540 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Všetky testy sa uskutočnili trojmo.
2.9. Meranie obsahu bunkového melanínu
Intracelulárny obsah melanínu sa meral pomocou mierne modifikovanej verzie metódy opísanej vyššie [27]. Bunky melanómu B16F10 sa naočkovali na 6-jamkové platne s hustotou 8 x 104 buniek/jamku a inkubovali sa 24 hodín. Bunky sa vystavili pôsobeniu extraktov (WC a WH-130, 100 ug/ml), kyseliny kojovej (100 ug/ml) alebo ISL (10 uM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Spojené štáty americké) počas 48 hodín v prítomnosť 100 uM 3-izobutyl-1-metylxantínu (IBMX). Po ošetrení boli bunky premyté Dulbeccovým fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (DPBS) a rozpustené v 200 ul 1 N NaOH počas 2 hodín pri 90 °C. Absorbancia pri 405 nm sa merala pomocou čítačky mikrodoštičiek.
2.10. Test aktivity bunkovej tyrozinázy
Intracelulárna aktivita TYR bola meraná s použitím mierne modifikovanej verzie predtým opísanej metódy [27]. Bunky melanómu B16F10 (8 x 104 buniek/jamka) boli ošetrené extraktmi (100 ug/ml) alebo kyselinou kojovou (100 ug/ml) v prítomnosti 100 uM IBMX počas 48 hodín, zozbierané a premyté DPBS. Proteínové vzorky boli lyzované v 1% TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) s tlmivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6,8) a potom centrifugované pri 15,{14}} otáčkach za minútu počas 10 minút. Frakcia supernatantu sa zhromaždila a koncentrácia proteínu sa stanovila pomocou testovacej súpravy s kyselinou bicinchonínovou (BCA) (Waltham, MA, USA). Reakčná zmes pozostávajúca z 30 ug proteínu (upraveného na 100 ul s 1 percentom Trionu X-100) a 100 ul 10 mM L-DOPA sa pridala do každej jamky 96-jamkovej doštičky. Po inkubácii pri 37 °C počas 1 hodiny sa dopacróm monitoroval meraním absorbancie pri 490 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Aktivita TYR sa vypočítala podľa nasledujúceho vzorca:
Aktivita tyrozinázy ( percentá )=(OD405 vzorky/OD405 kontroly) × 100
2.11. Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (RT-PCR)
Hladiny expresie mRNA génov súvisiacich s melanogenézou vrátane MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 boli stanovené pomocou modifikovaného testu RT-PCR [28]. Stručne, bunky B16F10 sa naočkovali na 6-jamkové platne v hustote 8 x 104 buniek na jamku a kultivovali sa 24 hodín. Potom boli bunky ošetrené extraktmi (100 ug/ml), kyselinou kojovou (100 ug/ml) alebo ISL (10 uM) počas 48 hodín. Celková RNA sa izolovala z buniek pomocou činidla TRIzol (Ambion, Austin, TX, USA) a potom sa koncentrácia RNA kvantifikovala pomocou čítačky mikrodoštičiek. Po príprave cDNA (2 µg) pomocou súpravy pre reverznú transkriptázu (ElpisBiotech, Daejeon, Kórea) podľa protokolov výrobcu sa uskutočnila PCR v reálnom čase pomocou MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 a -aktínové priméry (tabuľka 1, Bioneer, Daejeon, Kórea) so súpravou SYBR Green (ProGEN, Heidelberg, Nemecko) v prístroji CFX96 Real Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Všetky údaje boli normalizované na hladiny -aktinmRNA ako referenčného génu pre domácnosť.
2.12. Príprava bunkových lyzátov a analýza Western Blot
Bunky B16F10 boli nasadené na 6-jamkové platne v hustote 8 x 104 buniek na jamku, inkubované 24 hodín a potom vystavené extraktom (100 ug/ml), kyseline kojovej (100 ug/ml ) alebo ISL (10 uM) počas 48 hodín. Po premytí DPBS boli bunky zozbierané a lyzované v Triton X-100pufri (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) obsahujúcom 1 percento proteázy a koktailu inhibítora fosfatázy. Proteínové koncentrácie lyzátov celých buniek sa merali pomocou testovacej súpravy BCA (Waltham, MA, USA). Rovnaké množstvá proteínu (20 ug) sa naniesli na 10 percentné gély dodecylsulfátu sodného a polyakrylamidu, ktoré sa nechali bežať 4 hodiny pri 70 V. Potom sa proteíny preniesli na polyvinylidénfluoridovú (PVDF) membránu. Membrána bola trikrát premytá Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCI] obsahujúcim 0,1 percenta Tween 20 (TBST) a blokovaná 2 percentami hovädzieho sérového albumínu (GenDEPOT) počas 1 hodiny. Ďalej boli membrány inkubované cez noc pri 4 °C s primárnymi protilátkami (riedenie 1:1000) počas 4 hodín pri teplote miestnosti. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 a -actin boli detegované králičou polyklonálnou anti-MITF protilátkou (Abcam, Cambridge, UK); kozia polyklonálna anti-TYR protilátka (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); a myšacie monoklonálne antiTRP-1, anti-TRP-2 a anti{41}}aktínové protilátky (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), v tomto poradí. Potom sa membrány niekoľkokrát premyli TBST a inkubovali sa so sekundárnymi protilátkami (riedenie 1:2000) počas 1 hodiny, menovite králičím anti-myším IgG, myším anti-kozím IgG a kozím anti-myším IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), po čom nasledovalo niekoľko premytí TBST. Cieľové proteíny boli detegované pomocou činidla zosilnenej chemiluminiscencie (ECL) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pomocou systému ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kvantifikácia pásov proteínov sa uskutočnila pomocou softvéru ImageJ (verzia 1.52a pre Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].
2.13. Štatistická analýza Údaje boli analyzované pomocou programu Microsoft Excel 2016 a všetky experimentálne výsledky sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) troch nezávislých meraní. Študentov dvojvzorkový t-test sa použil na vyhodnotenie rozdielov medzi kontrolou a vzorkami. Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) a Duncanov test sa vykonali pomocou softvéru Rsoftware (verzia 3.6.3), aby sa určila významnosť každého porovnania pri úrovne p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" a="" p="">< 0,001="" (***).="" korelačná="" analýza="" sa="" uskutočnila="" s="" použitím="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">
3. Výsledky
3.1. Index hnednutia výťažkov zo sladkého drievka
Stupeň zhnednutiasladké drievkoextrakty je znázornené na obrázku 1a. Tieto výsledky potvrdili, že tepelne upravený extrakt (WH-130, 0,965 ± 0.025 AU [jednotky absorbancie]) mal oveľa vyššie hodnoty indexu hnednutia ako nezahrievaný extrakt (WC, 0,758 ± 0,005 AU). Očakávame, že tepelné spracovanie zvyšuje tvorbu melanoidínu vo WH-130 a že táto zmena môže súvisieť s rôznymi biologickými aktivitami.
3.2. Celkový obsah fenolov (TPC) extraktov zo sladkého drievka
Obrázok 1b zobrazuje TPCsladké drievkoextrakty. Zistili sme rozdiel v TPC medzi WC a WH{{0}}, keďže WC malo TPC 12.093 ± 0,061 mg GAE/g extraktu, kým WH-130mal TPC 14,098 ± 0,781 mg GAE/g extraktu. Tepelné spracovanie zvýšilo TPC extraktov sladkého drievka.
3.3. Radikálna aktivita extraktov zo sladkého drievka
Theantioxidantčinnosťsladké drievkoextrakty sú uvedené na obrázku 1c,d. Schopnosť ABTS plus zachytávať radikály bola vyššia pre WH-130 extrakt (6.{5}}86 ± 0.304 mg TEAC/gextrakt) ako WC extrakt (3,542 ± 0,093 mg TEAC/g extraktu). V teste DPPH bola pozorovaná podobná tendencia. Extrakt WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g extraktu) vykazoval vyššiu aktivitu na zachytávanie radikálov DPPH ako WC extrakt (4,033 ± 0,160 mg TEAC/gextrakt). Tieto výsledky naznačujú, že zahrievanie môže zvýšiť antioxidačnú aktivitu extraktov.
3.4. Obsah izoliquiritigenínu vo výťažkoch zo sladkého drievka
Výsledky ukázali, že obsah ISL vo WC sa po tepelnom spracovaní výrazne zvýšil (tabuľka 2, obrázok 2), čo naznačuje, že tepelné spracovanie môže ovplyvniť obsah tohtoantioxidantaanti-melanogénnezlúčenina.
cistanche tubolosa
3.5. Životaschopnosť buniek
Ako je znázornené na obrázku 3,sladké drievkoextrakty neovplyvnili životaschopnosť buniek pri 50 alebo 100 ug/ml v porovnaní s kontrolou ošetrenou IBMX. Pri ošetrení 50 a 100 ug/ml všetkých extraktov zostala životaschopnosť buniek vyššia ako 100 percent. Preto sa uskutočnili ďalšie experimenty s koncentráciou extraktu zo sladkého drievka až do 100 ug/ml.
3.6. Účinky extraktov zo sladkého drievka na produkciu melanínu v bunkách melanómu B16F10
Pigmentácia a obsah melanínu v bunkách B16F10 sú znázornené na obrázku 4a,b. Obsah melanínu v bunkách B16F10 sa zvýšil až 3.4-násobne pri liečbe IBMX v porovnaní s neošetrenou kontrolou. WC a WH-130 vykazovali významne zníženú pigmentáciu a obsah melanínu v porovnaní so skupinou liečenou IBMX (obrázok 4a,b). WC aj WH{{10}} vykazovali nižší obsah melanínu ako bunky ošetrené KA. Inhibičný účinok syntézy melanínu v bunkách B16F10 ošetrených WH-130 bol väčší ako WC. Množstvá melanínu prítomného po ošetrení 100 µg/ml WC a WH-130 sa znížili približne na 0.{18}}násobok a 0{20}}násobok úrovne u pacientov liečených IBMX ISL (10 µM) a KA (100 µg/ml) potlačili produkciu melanínu 0.59-násobne a 0.{27}}násobne, v závislosti od úrovne v bunkách ošetrených IBMX.
Tento výsledok ukazuje, že tepelne spracovanésladké drievkoextrakt (WH-130) môže inhibovať produkciu melanínu efektívnejšie ako nezahrievaný extrakt (WC). Okrem toho sme pozorovali, že ošetrenie extraktom WH -130 pri 25, 50 a 100 ug/ml (obrázok 4c) viedlo k zníženiu obsahu melanínu v bunkách melanómu B16F10 v závislosti od koncentrácie. Spoločne tieto výsledky ukazujú, že vykurovanie zlepšiloanti-melanogénneaktivita extraktu zo sladkého drievka.
3.7. Účinky extraktov sladkého drievka na aktivitu tyrozinázy
3.7.1. Aktivita hubovej tyrozinázy
Účinoksladké drievkoextrakty na hubovú aktivitu TYR je znázornená na obrázku 5a. Potvrdili sme, že účinok extraktov (WC a WH-130) na oxidáciu substrátov hubovou TYR nastal v podmienkach bez buniek. Pri 50 µg/ml extrakt WC inhiboval aktivitu enzýmu na 81,33 percent, zatiaľ čo WH-130 potlačil aktivitu TYR na 65,95 percent ECúrovne. Medzitým kyselina kojová (KA), inhibítor TYR, spôsobila inhibíciu aktivity enzýmu na 47,09 percent hladiny EC. Inhibícia aktivity TYR bola väčšia u tepelne spracovaného sladkého drievka (WH-130) ako u nezahrievaného sladkého drievka (WC).
3.7.2. Aktivita bunkovej tyrozinázy
Ako je znázornené na obrázku 5b, aktivita TYR buniek ošetrených IBMX sa zvýšila na 233 percent v porovnaní s neošetrenou kontrolou (100 percent). WC znížilo aktivitu TYR na 82,17 percent v porovnaní so skupinou liečenou IBMX. WH-130 extrakt inhiboval bunkovú aktivitu TYR na 59,88 percent v porovnaní s bunkami ošetrenými IBMX. KA znížila bunkovú aktivitu TYR na 74,07 percent úrovne v bunkách ošetrených IBMX. Tieto výsledky spolu ukazujú, že extrakty sladkého drievka (WC a WH-130) potláčajú aktivitu TYR a že WH-130 má silnejšiu inhibičnú aktivitu voči TYR ako WC a KA.
Ďalej sme skúmali korelácie medzi TPC, obsahom ISL,antioxidantaktivita a anti-melanogénna aktivita (tabuľka 3). TPC pozitívne korelovalo s obsahom ISL (0.827), ako aj s aktivitami ABTS plus a DPPH na odstraňovanie radikálov (0.886 a 0.896, v tomto poradí), zatiaľ čo TPC nepriamo koreloval s obsahom melanínu (–0 0,859). Obsah ISL pozitívne koreloval s aktivitami ABTS plus a DPPH na odstraňovanie radikálov (0.977 a 0.985, v tomto poradí), zatiaľ čo obsah ISL bol nepriamo korelovaný s aktivitou TYR (–0. 834) a obsah melanínu (–0.995). Antioxidačné aktivity (ABTS plus a DPPH) nepriamo korelovali s aktivitou TYR (–{{20}}.879 a –0.856, v tomto poradí) a obsahom melanínu (–0. 974 a –0,984). Tieto výsledky naznačujú, že fenolové zlúčeniny, ako je ISL v sladkom drievku, sú úzko spojené s antioxidantom aanti-melanogénneaktivity výťažkov zo sladkého drievka.
3.8. Účinky extraktov sladkého drievka na expresiu mRNA génov súvisiacich s melanogenézou
Skúmali sme expresiu génov súvisiacich s melanogenézou v bunkách B16F10, aby sme objasnili účinky extraktov sladkého drievka na melanogenézu. WC aj WH-130 potlačili expresiu mRNA MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 (obrázok 6). WC inhibovalo expresiu mRNA MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 na úrovne 0.{{10}}násobne, 0.{101} {12}}násobok, 0.{14}}násobok a 0.{16}}násobok počtu v bunkách ošetrených IBMX. WH-130 inhibovala expresiu mRNA MITF, TYR, TRP-1 a TRP{{20}} až 0.43-násobne, {{33 }}.60-násobok, 0.62-násobok a 0.49-násobok úrovní skupín liečených IBMX. WH{{30}} extrakt mal silnejší inhibičný účinok na expresiu mRNA ako WC extrakt. ISL tiež potlačil výraz MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 (0.42-násobok, 0.59-násobok, 0{38}}násobok{38}} a 0.{40}}násobok v porovnaní s bunkami ošetrenými IBMX). V skupine liečenej WH{42}} bol rozsah zníženia expresie mRNA génov súvisiacich s melanogenézou väčší ako v skupine liečenej WC, čo naznačuje, žesladké drievkoextrakty inhibujú melanogenézu potlačením transkripcie génov súvisiacich s melanogenézou a tepelná úprava zlepšujeanti-melanogénneaktivita extraktu zo sladkého drievka.
3.9. Účinky extraktov sladkého drievka na proteínovú expresiu génov súvisiacich s melanogenézou
Ako je znázornené na obrázku 7b, liečba WC a WH-130 významne znížila hladiny proteínovej expresie MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2. Úrovne expresie MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 boli v bunkách ošetrených WC potlačené (0.79-násobok, 0.{{9 }}zložiť, {{1{12}}}}.89-zložiť a 0.67-skrátiť vzhľadom na bunky ošetrené IBMX). WH-130 preukázala znížené hladiny proteínovej expresie MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 ({{20}}.74-násobne, {{24 }}.73-skladať, 0.80-skladať a {{30}}.48-skladať vzhľadom na bunky ošetrené IBMX) . ISL znížila hladiny proteínovej expresie MITF, TYR a TRP-2 (0,{29}}násobne, 0{31}}násobne a 0.41-násobne v porovnaní s liečbou IBMMX bunky). WH-130 potláčal proteínovú expresiu génov súvisiacich s melanogenézou silnejšie ako WC, čo ukazuje, žesladké drievkoextrakty inhibujú melanogenézu prostredníctvom potlačenia translácie génov súvisiacich s melanogenézou a že tepelné spracovanie zlepšujeanti-melanogénneaktivita extraktu zo sladkého drievka.
cistanche prášok na bielenie pokožky
4. Diskusia
Výsledky tejto štúdie ukazujú, že tepelné spracovaniesladké drievkoovplyvňuje TPC, antioxidačnú aktivitu aanti-melanogénnečinnosť. WH-130 mal vyšší index hnednutia a hodnoty TPC ako WC. Podmienky spracovania vrátane teploty a tlaku ovplyvňujú zložky vzoriek. [29]. Zahrievanie môže podporiť Maillardove reakcie, ktoré sú spojené s produkciou melanoidínu [23]. Melanoidíny majú niektoré biologické účinky, naprantioxidantprotinádorové a antihypertenzívne aktivity, ako aj modulácia krvného cukru [30]. Tieto zlúčeniny sú polymérne hnedo sfarbené makromolekuly vytvorené Maillardovou reakciou z interakcií medzi cukrami a aminokyselinami pri vysokých teplotách [21]. Čím viac melanoidínov v zahriatom extrakte, tým vyšší je index hnednutia. Farba nezahriateho extraktu zo sladkého drievka (WC) vykazovala svetlohnedú farbu, ale pri vysokej teplote (130 stupňov) bola farba postupne tmavšia. Proces zahrievania môže tiež vyvolať určité zmeny v chemickej štruktúre fenolových zlúčenín a spôsobiť rozpad bunkových stien rastlín, čím sa uvoľňujú fenoly, čo vedie k antioxidačným aktivitám [31]. Obsah fenolov v extraktoch zo sladkého drievka sa teda môže tepelnou úpravou zvýšiť [21]. Predchádzajúce správy ukázali, že tepelná úprava medu zvýšila tvorbu melanoidínu a stupeň zhnednutia sa zhodoval so zvýšením antioxidačnej aktivity [24]. Preto WH -130 vykazoval vyššiu antioxidačnú kapacitu ako WC v testoch ABTS plus a DPPH na zachytávanie radikálov, ktoré sa široko používajú na stanovenie antiradikálových aktivít vzoriek na základe schopnosti prenášať elektróny alebo atómy vodíka [32].
Najbežnejšie prírodnéantioxidanta anti-melanogénne zlúčeniny sú fenoly. Tricín a kyselina 9-hydroxyoktadekadiénová boli identifikované ako hlavné fenolické látky v Sorghum bicolor. Okrem toho tieto zložky vykazovali antioxidačné a antimelanogénne účinky inhibíciou aktivity tyrozinázy [19]. Okrem toho sa dokázalo, že kyselina p-kumarová, aktívna zlúčenina Sasa quelpaertensis Nakai, silne inhibuje aktivitu tyrozinázy a znižuje produkciu melanínu v bunkách melanómu [27]. Podľa predchádzajúcich výskumov ISL, dobre známa flavonoidná zlúčenina v produkte hydrolýzy koreňa sladkého drievka [6–8], vykazuje antioxidačné a antimelanogénne aktivity inhibíciou aktivity TYR, transportu melanozómov a indukciou degradácie melanínu [10,31]. Takže sme sa zamerali na obsah ISL v extraktoch a pôsobenie ISL v mechanizmoch súvisiacich s melanogenézou. ISL sa používa ako terapeutické činidlo pri mnohých ochoreniach vďaka svojim početným biologickým aktivitám vrátane protizápalových, antimikrobiálnych, antioxidačných, protirakovinových, imunoregulačných, hepatoprotektívnych a kardioprotektívnych účinkov [33]. V tejto štúdii bol nameraný vyšší obsah ISL vo WH-130 ako vo WC. Hyperpigmentácia kože súvisí s oxidačným stresom. Uvádza sa, že lapače voľných radikálov zohrávajú dôležitú úlohu pri potláčaní hyperpigmentácie [17,34]. Spoločne tieto výsledky ukazujú, že tepelná úprava sladkého drievka môže zlepšiť jeho aktivity na zachytávanie radikálov aanti-melanogénneaktivity prostredníctvom zvyšovania hladín antioxidačných fenolových zlúčenín, ako je ISL. Podľa predchádzajúcej literatúry sú v sladkom drievku (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) glabrén, glabridín, glabrol, liquiritigenín, ktoré vykazujú inhibíciu tyrozinázy. Tieto zlúčeniny teda môžu mať vplyv aj na antimelanogénne aktivity [10,11,15,35]. Ďalšie štúdie o nich sú dôležité na objasnenie antimelanogénnych účinkov sladkého drievka.
Syntéza melanínu je regulovaná TYR, TRP-1, TRP-2 (dopachrómová tautoméráza) a MITF (obrázok 8). TYR, glykoproteín obsahujúci meď, pôsobí ako enzým obmedzujúci rýchlosť a hrá kľúčovú úlohu pri produkcii melanínu. TYR katalyzuje hydroxyláciu tyrozínu na 3,4-dihydroxyfenylalanín (DOPA). TYR tiež katalyzuje oxidáciu DOPA na dopachinón a konverziu dopachinónu na dopachróm. Potom sa dopachróm premení na dihydroindolizín (DHI) alebo indol 5, 6-chinón-2-karboxylovú kyselinu (DHICA) [36–38]. V tejto dráhe TRP-2 katalyzuje konverziu dopacrómu na DHICA, ktorý je oxidovaný TRP-1 za vzniku eumelanínu. MITF je špecifický transkripčný faktor, ktorý hrá rozhodujúcu úlohu v melanogenéze ako hlavný regulátor expresie TYR, TRP-1 a TRP{16}} (obrázok 8) [28,37]. Chemickým induktorom melanogenézy je 3-izobutyl-1-metylxantín (IBMX), ktorý zvyšuje aktivitu TYR prostredníctvom signálnej dráhy cAMP [13]. IBMX zvyšuje intracelulárnu koncentráciu cAMP inhibíciou fosfodiesterázy cAMP. Zvýšenie hladín cAMP aktivuje proteínkinázu A (PKA) a aktivovaná PKA zlepšuje aktivitu a expresiu väzbového proteínu súvisiaceho s cAMP (CREB) [39]. CREB sa viaže na promótor MITF, čo vedie k upregulácii génovej expresie MITF. Aktivácia MITF podporuje expresiu TYR a TRP [13,19]. Preto downregulácia MITF vedie k hypopigmentácii.
Zahrievaný extrakt zo sladkého drievka (WH-130) inhiboval aktivitu TYR húb a buniek TYR účinnejšie ako nezahrievaný extrakt zo sladkého drievka (WC). Inhibícia bunkovej aktivity TYR v extraktoch sladkého drievka môže byť spôsobená znížením TYR. Tieto výsledky sú spojené s obsahom melanínu v bunkách melanómu B16F10. V bunkách B16F10 liečba WH-130 potlačila produkciu melanínu indukovanú IBMX lepšie ako liečba WC. Okrem toho WH 130 downreguloval transkripciu a transláciu markerov súvisiacich s melanogenézou (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) v bunkách B16F10 vo väčšej miere ako WC. Tieto markery môžu súhrnne prispievať k celkovejanti-melanogénnečinnosť [40].
Vykurovaniesladké drievkoextrakt zvýšil množstvo antioxidačných fenolových zlúčenín, ako je ISL, a toto zvýšenie bolo spojené so zvýšenýmantioxidantčinnosti (ABTS plus a DPPH). Zahriaty extrakt sladkého drievka (WH{0}}) tiež vykazoval zvýšenú inhibičnú aktivitu TYR a zníženú syntézu melanínu. Existuje nový trend vo vývoji prírodných materiálov kvôli potenciálu bezpečnosti. Sladké drievko sa používa v kozmeceutických krémoch na hyperpigmentáciu [41]. Ukázali sme potenciál Wongamu ako novéhobielenie pokožkyprostriedok na použitie v kozmetike a overili, že tepelná úprava môže zlepšiť jeho potenciál.
Glycyrrhiza uralensis Fischer (sladké drievko) má antioxidačné a UV fotoprotektívne aktivity v ľudských dermálnych fibroblastoch [22]. Štúdie porovnania medzi Wongamom (sladké drievko) a inými pôvodnými druhmi je však potrebné vykonať neskôr. Okrem toho by sa pomocou vhodných metód mali vykonať ďalšie štúdie o neidentifikovaných zložkách Wongamu, ako je glabrén, glabridín, spojené s jeho antimelanogénnym účinkom. Po analýze zložiek v extrakte sladkého drievka je potrebné skúmať synergické alebo antagonistické účinky medzi fenolovými zlúčeninami [40]. Skúmať, ako tieto látky pôsobiaantioxidanta antimelanogénne mechanizmy, prenos atómov vodíka alebo systémy prenosu jedného elektrónu a mitogénom aktivované proteínkinázové signálne dráhy [32,37].
5. Závery
V tejto štúdii sme skúmali potenciál extraktov z Wongamu, nového kultivarusladké drievko, akobielenieprostriedok na aplikáciu v kozmetike a vplyv tepelného spracovania na ich bioaktivitu. Wongamové extrakty (WC a WH-130) vykazovali vysokú aktivitu zachytávania radikálov a inhibovali syntézu melanínu v melanocytoch indukovaných IBMX potlačením aktivity TYR. Tepelné spracovanie zvýšiloantioxidanta anti-melanogénne aktivity Wongamu. Výsledkom bolo, že WH-130 vykazovala vynikajúce antioxidačné aanti-melanogénneaktivity ako WC. Naše výsledky naznačujú, že tepelne upravený extrakt z Wongamu (WH-130) je účinným činidlom znižujúcim pigment s možnými aplikáciami pri rôznych dermatologických poruchách hyperpigmentácie, vrátane hnedých škvŕn, pieh a melazmy, a ukazujú, že tepelné spracovanie možno použiť na zlepšenie antimelanogénna aktivita sladkého drievka.
výhody cistanche tubolosa: bielenie pokožky
