Antifungálny potenciál sekundárnych metabolitov zapojených do interakcie medzi citrusovými patogénmi a Cistanche

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Citrusové plody majú významný vplyv na svetové hospodárstvo, pretože majú najväčšiu produkciu v porovnaní s inými druhmi ovocia; napríklad celosvetová produkcia pomarančov na rok 2018/19 podľa predpovedí dosiahne 54,3 milióna ton. Hlavným faktorom ovplyvňujúcim kvalitu citrusov je pozberplesňové ochorenia,najmä zelená pleseň spôsobená Penicillium digitatum, ktorá je zodpovedná za 90 percent strát citrusov v období po zbere1,3. Na kontrolu chorôb po zbere úrody sa široko používajú syntetické fungicídy, ktoré spôsobujú zdravotné a environmentálne problémy. Okrem toho si niektoré kmene húb vyvinuli odolnosť voči bežne používaným fungicídom. Akoantimykotikumrezistencia sa stáva významným problémom, hľadanie nových bioaktívnych zlúčenín zohráva dôležitú úlohu pri obídení rozsiahleho používania fungicídov7. Mikroorganizmy sú jedným z hlavných zdrojov prírodných produktov s užitočnými biologickými aktivitami, tj potenciálomantimykotiká, antibiotiká, protirakovinové látky, povrchovo aktívne látky. Okrem genetického potenciálu a diverzity mikróbov sa však mnohé mikrobiálne biosyntetické gény neaktivujú v neprirodzených kultivačných podmienkach používaných v laboratóriu a prístupných je len niekoľko častí metabolitov10. Na prekonanie obmedzení v objavovaní prírodných produktov z mikrobiálnych zdrojov sa implementuje niekoľko stratégií, tj prístup OSMAC10,11, použitie epigenetických modifikácií a kokultivácia14. Ukázalo sa, že kokultúry, ktoré napodobňujú prírodné prostredie a vykazujú mikrobiálnu súťaž o obmedzený priestor a živiny, sú hlavnou ekologickou silou, ktorá by mohla aktivovať tiché génové zhluky a obranné mechanizmy, ktoré môžu viesť k produkcii bioaktívnych sekundárnych metabolitov. 1 Chemický inštitút, Univerzita Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazília. 2 Centrum prírodných a humanitných vied, Federal University of ABC, 09210-580, Santo André, SP, Brazília. 3Katedra biomolekulovej chémie, Leibnizov inštitút pre výskum prírodných produktov a biológiu infekcií – Hans Knöll Institute, Jena, Nemecko. 4Predseda chémie prírodných produktov, Univerzita Friedricha Schillera Jena, 07743, Jena, Nemecko. dôležité nielen na identifikáciu nových zlúčenín, ale aj na skúmanie chemických javov, ktoré riadia interakcie medzi mikroorganizmami v prírode. K dnešnému dňu neexistujú žiadne informácie o tom, ako huby citrusových patogénov interagujú s inými mikroorganizmami v rovnakom prostredí a aké sú mechanizmy napadnutia a obrany proti endofytickým mikroorganizmom alebo iným fytopatogénom. Tieto informácie môžu viesť k objavu nových sekundárnych metabolitov zapojených do mikrobiálnych interakcií a poskytnúť lepšie poznatky o dôležitosti mikrobiálnej ekológie počas procesu infekcie. Tu ukazujeme interakciu medzi Penicillium digitatum a Penicillium citrinum s cieľom hľadať novéantimykotikumzlúčeniny, ktoré by sa mohli použiť na kontrolu chorôb po zbere úrody. Vzhľadom na tento účel sa stratégia kokultivácie a MSI použili na vyvolanie produkcie sekundárnych metabolitov a poskytli počiatočné poznatky o ich biologickej úlohe na základe ich priestorovej distribúcie v interakcii. Požadované metabolity boli izolované a všetky štruktúry boli objasnené na základe hmotnostnej spektrometrie a NMR experimentov. Ešte,antimykotikumtesty a analýzy konfokálnej mikroskopie sa uskutočnili s cieľom preskúmať potenciál metabolitov húb ako novýchantimykotikumagentov.

BYLINKOVÁ CISTANCHE

Materiály a metódy

Kultúra húb.Kmeň P. digitatum (PD) použitý v štúdiách je uložený v španielskej zbierke typových kultúr (CECT) pod prístupovým kódom CECT20796. Kmeň P. citrinum (PC) poskytlo Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brazília). P. digitatum a P. citrinum sa kultivovali na komerčnom zemiakovom dextrózovom agare (PDA) (Acumedia). PDA bol autoklávovaný pri 103 kPa (121 stupňov) počas 15 minút. PDA platne sa skladovali pri 25 stupňoch počas 7 dní v tme. Spóry sa zozbierali premytím povrchu agaru sterilnou destilovanou vodou a zriedením na konečnú koncentráciu 106 alebo 105 spór ml-1.

Spoločná kultúra podmieňuje rast húb roztok spór (106 ml-1 spór) sa naočkoval na opačné strany. Te doštičky boli inkubované v tme pri 25 stupňoch počas 7 dní.

Na MSI analýzy a konfokálnu mikroskopiu sa in vitro kokultúra pripravila umiestnením sterilného mikroskopického sklíčka do Petriho misky, nasledovalo naliatie 11 ml PDA22 a nad podložným sklíčkom sa urobili inokulá. Doštičky sa inkubovali v tme pri 25 stupňoch počas 72 hodín. Pre in vivo kokultiváciu boli zrelé pomaranče (Citrus sinensis) povrchovo sterilizované a poranené23. Malý kúsok PDA obsahujúci P. citrinum sa naočkoval do miesta poranenia. Infikované a kontrolné pomaranče sa skladovali v sterilných 500 ml kadičkách v tme pri 25 °C. Po 10 dňoch boli plody poranené na opačnej rovníkovej oblasti inokula P. citrinum a infikované roztokom P. digitatum 106 ml-1. Plody boli skladované viac ako 5 dní v tme pri 25 stupňoch.

Analýza hmotnostnej spektrometrie (MSI) a generovanie MS obrazu.

Po inkubačnej dobe boli mikroskopické sklíčka odstránené z Petriho misiek a vložené do vákuového exsikátora na 1 hodinu, aby sa úplne vysušil agar (Angolini et al., 20}15). MSI analýzy sa uskutočňovali priamo na mikroskope obsahujúcom kokultúru v pozitívnom režime s použitím desorpčného elektrosprejového ionizačného (DESI) zdroja Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) spojeného s Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotnostný spektrometer. Údaje MSI boli získané s hmotnostnou rozlišovacou schopnosťou 70.000 pri m/z 200. Použitá konfigurácia DESI bola rovnaká ako v predchádzajúcej práci22. Obrázky sa generovali so šírkou priehradky Δm/z=± 0,07 pomocou softvéru na konverziu údajov Firefly (verzia 2.1.05) a spracovali sa pomocou softvéru BioMap (verzia 3.8.0.4) vyvinutého inštitútom Novartis Institutes for BioMedical Research. V BioMap bolo škálovanie farieb upravené na pevnú hodnotu počas spracovania každého obrázka. MS spektrá boli spracované softvérom Xcalibur (verzia 3.0.63) vyvinutým spoločnosťou Thermo Fisher Scientific.

Extrakcia metabolitov z experimentov spoločnej kultúry.

Celý obsah spoločnej kultúry in vitro bol narezaný na malé kúsky a prenesený do Erlenmeyerovej banky. Extrakcia sa uskutočnila s použitím metanolu. Banky boli sonikované počas 1 hodiny v ultrazvukovom kúpeli a vákuovo filtrované. Rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a konečný extrakt sa skladoval pri -20 stupňoch.

Pre in vivo kokultiváciu boli pomarančové šupky narezané (2 cm x 2 cm) v zóne rozhrania medzi mikroorganizmami a extrakcia bola uskutočnená s 5 ml metanolu počas 1 hodiny v ultrazvukovom kúpeli. Extrakty boli filtrované, sušené pod N2 a skladované pri -20 stupňoch.

Analýza hmotnostnou spektrometriou (MS).

Extrakty sa zriedili v metanole a analyzovali sa na hmotnostnom spektrometri Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap. Analýzy boli vykonané v pozitívnom režime s rozsahom m/z 115–1500, kapilárne napätie 3,4 kV, teplota vstupnej kapiláry 280 stupňov, S-šošovka 100V. Injektovalo sa 5 ul vzorky. Stacionárna fáza: Termo Scientific kolóna Accucore C18 2,6 µm (2,1 mm x 100 mm). Mobilná fáza: 0,1 % kyselina mravčia (A) a acetonitril (B). Eluentný profil (A/B): 95/5 až 2/98 do 15 minút, podržte 5 minút, až 95/5 do 1,2 minúty a podržte 7,8 minúty. Celková doba chodu bola 29 minút pre každý cyklus a prietoková rýchlosť bola 0,2 ml/min. Injekčný objem: 5 µL.MS/MS sa uskutočnilo kolíziou indukovanou disociáciou (CID) s rozsahom m/z 100–800 a energia kolízie sa pohybovala od 10 do 50 V. Vzorky boli priamo infundované elektrosprejom s prietokovou rýchlosťou 5,0 ul min-1. Údaje MS a MS/MS boli spracované softvérom Xcalibur (verzia 3.0.63) vyvinutým spoločnosťou Thermo Fisher Scientific.

VÝHODNÝ DOPLNOK CISTANCHE: ZLEPŠENIE IMUNITY

Separácia metabolitov (HPLC analýza).

Separácie sekundárnych metabolitov sa dosiahli pomocou Phenomenex kolóny Luna 5µm Phenyl-Hexyl (25{{10}}}×4,6 mm) a SHIMADZU prominence HPLC LC-20AT, vybavenej CBM{{6} }Modul komunikačnej zbernice, detektor fotodiódového poľa SPD-M20A a automatický vzorkovač SIL-20. Mobilná fáza: voda (0,1 % kyselina mravčia) (A) a acetonitril (B). Profil eluentu (A/B): 65/35 až 50/50 v priebehu 50 minút, až 40/60 v priebehu 20 minút. Celková doba chodu bola 70 minút a prietok 1,0 ml/min. Objem injekcie bol 5 ul. Preparatívne HPLC čistenie sa uskutočnilo na Phenomenex kolóne Luna 5 um Phenyl-Hexyl (250 x 10 mm) s použitím Waters 1525 Binary HPLC Pump vybavenej Waters 2998 Photodiode Array Detector a Waters Fraction Collector III s použitím rovnakých optimalizovaných podmienok gradientu. Prietok bol nastavený na 4,7 ml/min-1 a objem injekcie bol 200 ul.

NMR spektroskopia.

1H NMR, 13C NMR a 2D experimenty sa uskutočnili na Bruker Avance III 500 (1H 500,13 MHz a 13C 125,7 MHz) a Bruker Avance III 600 (1H 600,17 MHz). Deuterovaný chloroform (CDCI3; 7,23 ppm), dimetylsulfoxid (DMSO; 2,50 ppm a 39,51 ppm) a tetrametylsilán (TMS; 0,0 ppm) sa použili ako rozpúšťadlo a vnútorná referencia. Chemické posuny (5) boli vyjadrené v (ppm) a väzbové konštanty (J) v Hertzoch (Hz).

Analýza molekulárnych sietí.

Molekulárna sieť pre metabolity P. citrinum bola vytvorená pomocou online pracovného postupu na Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu). Údaje sa filtrovali odstránením všetkých vrcholov MS/MS v rámci plus/-17 Da prekurzora m/z. MS/MS spektrá boli filtrované oknom výberom iba 6 najvyšších píkov v okne plus /-50Da v celom spektre. Údaje sa potom zoskupili pomocou MS-klastra s toleranciou základnej hmotnosti 0,2 Da a toleranciou k iónom fragmentov MS/MS 0,2 Da, aby sa vytvorili konsenzuálne spektrá. Ďalej boli vyradené konsenzuálne spektrá, ktoré obsahovali menej ako 2 spektrá. Potom sa vytvorila sieť, kde boli okraje filtrované tak, aby mali kosínusové skóre vyššie ako 0,65 a viac ako 2 zhodné vrcholy. Ďalšie hrany medzi dvoma uzlami boli v sieti ponechané iba vtedy, ak sa každý z uzlov objavil v príslušných top 10 najpodobnejších uzloch. Spektrá v sieti sa potom hľadali proti spektrálnym knižniciam GNPS. Knižničné spektrá boli filtrované rovnakým spôsobom ako vstupné dáta. Všetky zhody medzi sieťovými spektrami a spektrami knižnice museli mať skóre vyššie ako 0,5 a aspoň 5 zhodných píkov.

Antifungálne testy.

Zásobný roztok extraktu spoločnej kultúry bol pripravený v metanole a ďalej zriedený v PDA na koncentráciu 0,5 mgmL-1. 15 ml výsledného roztoku sa nalialo do Petriho misky a potom sa na stred agarovej platne naočkovalo 15 ul roztoku P. digitatum s objemom 105 ml-1 spór. Uskutočnil sa aj kontrolný test. Doštičky sa inkubovali v tme pri 25 stupňoch počas 96 hodín. PreantimykotikumV testoch sa 2,5 ml PDA doplnilo 6, 9 a 10 (400 ugml-1) a každý roztok sa nalial do 6-jamkovej mikroplatničky. 5 ul 105 ml-1 spór roztoku P. digitatum sa naočkovalo do stredu každej agarovej platne. Negatívne kontroly boli uskutočnené trojmo. Mikroplatnička bola inkubovaná v tme pri 25 stupňoch počas 96 hodín. Na stanovenie minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) zlúčenín 1 a 4 sa uskutočnil test riedenia v mikro bujóne, ako odporúča Clinical and Laboratory Standards Institute (2008)24 s niekoľkými modifikáciami. Zásobné roztoky 1 a 4 boli pripravené vo vode (5 percent metanol) a ďalej zriedené v médiu YES v rozsahu koncentrácií do 600 ug ml-1 až 1 ug ml-1. 195 ul každého roztoku sa prenieslo na 96-jamkovú mikroplatničku s následnou inokuláciou 5 ul roztoku P. digitatum s objemom 105 ml-1 spór. Testy sa uskutočňovali dvojmo a kontroly trojmo. Itrakonazol (100 ugml-1) sa použil ako pozitívna kontrola. Negatívne kontroly boli vykonané s metanolom v ÁNO. Mikrodoštičky sa inkubovali v tme pri 25 stupňoch počas 96 hodín.

Konfokálna laserová skenovacia mikroskopia.

Po inkubačnej dobe boli mikroskopické sklíčka odstránené z Petriho misky. Vzorky kokultivácie in vitro boli zafarbené konžskou červeňou (0,25 % w/v vo vode) počas 20 minút a krátko premyté v destilovanej vode. Vzorky sa analyzovali mikroskopom Leica TCS SP5. Excitácia sa uskutočňovala 543nm emisnou čiarou He-Ne laseru a zbieralo sa svetlo emitované medzi 570 a 680nm.

BENEFITCISTANCHE: ZLEPŠENIE IMUNITY

Výsledky a diskusia

MSI odhaľuje potenciálne antimykotiká v interakcii medzi P. digitatum a P. citrinum.

Ak chcete skontrolovať novéantimykotikumzlúčeniny s potenciálom chrániť citrusové plody a kontrolovať choroby po zbere úrody, použili sme stratégiu spoločnej kultivácie zahŕňajúcu P. digitatum a ďalší citrusový patogén, P. citrinum. Kokultivácia je stratégia inšpirovaná prírodou, v ktorej môže konkurencia medzi mikroorganizmami vyvolať produkciu nových metabolitov. V predchádzajúcej práci kokultivácia medzi Trichophyton rubrum a Bionectria ochroleuca vyvolala produkciu nového sulfátovaného analógu PS-990, čo naznačuje, že táto zlúčenina je ďalej sulfátovaná počas interakcie s hubami26. Ďalším príkladom zlúčeniny odvodenej z interakcie húb je izolovaný tetrapeptid cyklo-(L-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolyl-D-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolín). z kokultivačného bujónu Phomopsis sp. K38 a Alternaria sp. E33; cyklický tetrapeptid vykazoval strednú až vysokú inhibičnú aktivitu proti fytopatogénnym hubám v porovnaní s komerčným fungicídom triadimefon27. Kokultivačné experimenty sú teda životaschopným prístupom k nájdeniu zlúčenín, ktoré môžu inhibovať hlavné citrusové fytopatogény, najmä zelenú pleseň spôsobenú P. digitatum.

Pri kokultivácii uskutočnenej v oranžovom (in vivo) aj v syntetickom médiu (in vitro) sme vizuálne pozorovali inhibíciu rastu na diaľku medzi P. citrinum a P. digitatum. Pri interakcii húb sa môžu aktivovať tiché gény a škodlivé metabolity sa môžu zneškodniť z jedného partnera na druhého16,28. Metabolity indukované Tese sú zvyčajne lokalizované v zóne konfrontácie v pevných médiách kokultúr16. Bežné prístupy používané na detekciu a objasnenie metabolitov, ako je hmotnostná spektrometria spojená s kvapalinovou (LC-MS) alebo plynovou (GC-MS) chromatografiou, však neposkytujú informácie o priestorovom rozložení molekúl.

Informácie o molekulárnej priestorovej distribúcii možno získať pomocou hmotnostného spektrometrického zobrazovania (MSI), čo je výkonný nástroj, ktorý generuje obrazy pre každý ión detekovaný v hmotnostnom spektre16. Použitie MSI na pochopenie mikrobiálnych systémov a ich sekundárnych metabolitov nie je nové a štúdie, v ktorých bola táto technika úspešne použitá, možno nájsť v literatúre30. Napríklad MSI sa použil na skúmanie interakcie medzi Bacillus subtilis 3610 a Streptomyces coelicolor A3. DESI zobrazenie bakteriálnej kokultúry odhalilo 57 signálov priestorovo lokalizovaných v bakteriálnych kolóniách, čo viedlo k identifikácii niektorých sekundárnych metabolitov, ako je surfaktín a plipastatín31. Okrem toho analýza MSI tiež ukázala, že S. coelicolor má produkciu určitých sekundárnych metabolitov inhibovanú v prítomnosti B. subtilis, čo odhalilo interakciu medzi baktériami31.

Preto sme na detekciu sekundárnych metabolitov zapojených do interakcie medzi citrusovými patogénmi aplikovali DESI-MSI priamo na povrch kokultivačného agaru, aby sme vizualizovali difúziu zlúčenín do zóny konfrontácie. Signály MSI boli získané pre ióny [M plus H] plus pri m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 459,1645, m/z 62,85,39 m/z 62,85,39 m. z 527,2862, m/z 511,2894 a m/z 448,2938 (obr. S1–S10). Pozorovali sme, že všetky uvedené ióny boli detegované a koncentrované v zóne konfrontácie medzi hubami (obr. 1). Tieto zlúčeniny môžu súvisieť s interakciou huba-huba a mohli by byť potenciálne novými antimikrobiálnymi činidlami. Ióny s m/z 625, 609, 527, 511 a 448 produkoval P. citrinum, zatiaľ čo ióny s m/z 519, 503, 475, 460 a 459 sa zdali byť protiútokom P. digitatum. , odhaľujúce chemickú vojnu medzi týmito dvoma citrusovými patogénmi. Te ióny detegované in vitro prostredníctvom analýz MSI boli tiež detegované v extraktoch zo spoločných kultúr in vivo (obr. S11 – S20) s použitím pomarančov ako substrátu (obr. 2).

Aby sa charakterizovali metabolity zapojené do interakcie, extrakt z kokultúry sa získal z experimentu so zväčšenou mierou a zlúčeniny, ktoré sú predmetom záujmu, pôvodne detegované pomocou analýz MSI, sa izolovali preparatívnou HPLC a charakterizovali sa pomocou tandemovej hmotnostnej spektrometrie a analýz NMR.

Prostredníctvom presných hmotností získaných DESI-MSI analýzami (tabuľka 1) bolo možné potvrdiť prítomnosť indolových alkaloidov produkovaných P. digitatum. Ióny [M plus H] plus pri m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960 a m/z 459,1645, ktoré zodpovedajú tryptoquialanínu A (1), tryptoquialanínu (1), tryptoquialanínu (tryptoquilaqui 3), 15-dimetyl-2-epi-fumichinazolín A (4) a deoxytryptochilalanón (5) (chemické štruktúry znázornené na obr. 3). Tieto zlúčeniny sú súčasťou biosyntetickej dráhy tryptochalanínov32 a boli predtým zistené počas DESI-MSI analýzy pomarančov infikovaných chorobou zelenej plesne23. Zlúčenina 1 bola uvedená ako hlavný sekundárny metabolit produkovaný P. digitatum33. Delécia tohto génu, zodpovedného za reguláciu biosyntézy 1, však ukázala, že gén 1 nie je zapojený do patogenity P. digitatum proti citrusom, pretože infekčná schopnosť mutantov nebola zmenená34. Presná biologická úloha tryptochalanínov je stále neznáma34 a táto štúdia poskytuje novú biologickú aktivitu tryptochalanínov so zapojením týchto alkaloidov do interakcie s hubami. MS/MS iónu [M plus H] plus pri m/z 625,3951 poskytla fragmenty pri m/z 594,3533, 576,3427, 449,2430 a 431,2325 (obr. S21), rovnaký fragmentačný vzor získaný pre citrinín A (6 v štúdii zahŕňajúcej spoločnú kultiváciu medzi P. citrinum a Pseudoalteromonas sp. OT5919. Tiež databáza GNPS naznačila, že ión pri m/z 625 by mohol byť citrinín A. Tandemové hmotnostné spektrum získané pre túto zlúčeninu zdieľalo päť fragmentov spoločných s tandemovým hmotnostným spektrom 6 uloženým v databáze (obr. S22). Okrem toho zdieľa podobný vzor fragmentácie MS/MS s citrinínom A, ktorý opísali Moree et al. (2014). Citrinadíny boli hlásené, že sú vo vyššej miere produkované v kokultivačných situáciách a koncentrované v kokultivačných rozhraniach, čo naznačuje obrannú reakciu P. citrinum proti iným mikroorganizmom Analýza molekulárnych sietí izolovaných zlúčenín odhalila, že v spoločnej kultúre je zapojený ďalší citrinín interakcia. Pozorovali sme, že ión pri m/z 609, zistený pôvodne analýzou MSI, je zoskupený v rovnakom zhluku zlúčeniny 6 (m/z 625) (obr. S23), čo naznačuje, že táto zlúčenina je metabolit podobný citrinínu. V analýze molekulárnej siete sú súvisiace metabolity zoskupené do rovnakých klastrov, pretože majú podobné MS/MS spektrum.

Presná hmotnosť získaná pre ión [M plus H] plus pri m/z 609,4010 zodpovedá zlúčenine s molekulovým vzorcom C35H53N4O5. Fragmentačný vzor poskytol fragmenty pri m/z 578,3583, 464,2905, 451,2586 a 433,2482 (doplnkový obrázok S24). 1H NMR a 1H-1H COZY spektrá získané pre purifikovaný metabolit (obr. S25 – S26 a tabuľka S1) vykazovali podobné signály syntetizovaného deoxycitrinadínu A, ktoré opísali Bian et al. (2013)37. Charakteristický signál epoxidu pri 5H 4,0 v tomto deriváte chýbal a signál pre vynilový vodík sa dal pozorovať pri 5H 6,9, čo naznačuje absenciu epoxidovej skupiny a prítomnosť dvojitej väzby v porovnaní s citrinínom A37. Je to prvýkrát, čo sa deoxycitrinadín A (7) uvádza v literatúre ako sekundárny metabolit produkovaný mikroorganizmom.

Presné hmotnosti získané pomocou DESI-MSI pre ióny [M plus H] plus pri m/z 527,2862 a 511,2894 indikovali zlúčeniny s elementárnym zložením C28H38N4O6 a C28H38N4O5. MS/MS odhalila, že ión pri m/z 511 má podobnú štruktúru v porovnaní s m/z 527, s výnimkou absencie atómu kyslíka. Fragmentácia iónu pri m/z 527 poskytla fragmenty m/z 281, 247, 219, 182 a 120 (obr. S27), zatiaľ čo ión pri m/z 511 poskytla m/z 265, 247, 219, 166 a 120 (obr. S30). Rovnaký fragmentačný vzor bol opísaný pre sekvenciu tetrapeptidov Phe-Val-Val-Tyr (8) z Penicillium canescens. Napriek tomu boli tetrapeptidy 8 a Phe-Val-Val-Phe (9) nedávno hlásené ako sekundárne metabolity produkované Penicillium roqueforti. Analýzy 1H a 13C NMR izolovaných zlúčenín (obr. S28 – S32 a tabuľky S2-S3) potvrdili výsledky získané pomocou MS/MS so záverom, že ióny pri m/z 527 a m/z 511 zodpovedajú 8 a 9. Produkcia týchto tetrapeptidov v fungálnej chemickej vojne nie je prekvapujúca, pretože malé peptidy sú známe svojou antimikrobiálnou aktivitou40. Toto je prvá správa o 8 a 9 ako sekundárnych metabolitoch P. citrinum. Pre ión [M plus H] plus pri m/z 448,2938 presná hmotnosť naznačovala zlúčeninu s molekulovým vzorcom C28H38N3O2, rovnaké zloženie ako sekundárny metabolit chrysogenamid A (10) (chyba=-4,6 ppm). Zlúčenina 10 sa izolovala a1H a13C NMR analýzy (obr. S33–S34 a tabuľka S4) potvrdili jej štruktúru; je to prvá správa, že chrysogenamid A sa podieľa na interakcii s hubami. Zlúčenina 10 bola prvýkrát ohlásená ako sekundárny metabolit Penicillium chrysogenum č. 005, endofytická huba spojená s rastlinouCistanche deserticola. Tiež 10 bol hlásený ako sekundárny metabolit kmeňa P. citrinum42. Štruktúry metabolitov produkovaných P. citrinum sú znázornené na obr.

Antifungálne testy.

Vyšetrili smeantimykotikumAktivita metabolitov produkovaných v spoločnej kultúre a P. digitatum bola naočkovaná do agarového média obsahujúceho extrakt zo spoločnej kultúry. V porovnaní s kontrolou sme pozorovali zníženie radiálneho rastu P. digitatum o 67 percent (obr. S35), čo naznačuje, že metabolity zapojené do boja proti hubám majú potenciál ako antifungálne látky. Na potvrdenie tejto hypotézy sme testovali izolované zlúčeniny a pozorovali sme, že zlúčeniny 6, 9 a 10 (400 ug ml-1) znížili radiálny rast P. digitatum o 48 percent, 41 percent a 61 percent v porovnaní s kontrolou. (obr. 5), čo potvrdzuje antifungálnu aktivitu. Zistilo sa, že citrinadíny sa podieľajú na odpovedi P. citrinum proti iným mikroorganizmom v spoločných kultúrach, ale ich biologická úloha v biologickom prostredí je dodnes neznáma19. Zlúčenina 6 bola testovaná na aktivitu vredov proti Buruli na Mycobacterium ulcerans MN209, ale nebola pozorovaná žiadna zaujímavá MIC43; bola tiež hlásená cytotoxická aktivita 6 proti leukemickým a karcinómovým bunkám44. Naše výsledky sú prvou správou o antimikrobiálnej aktivite citrinadínov v literatúre a môžu poskytnúť prvé poznatky o biologickej úlohe týchto zlúčenín pri interakciách medzi hubami a hubami. Okrem toho, chrysogenamid A nebol doteraz nikdy uvádzaný ako antimikrobiálne činidlo. Zlúčenina 10 vykazovala ochranný účinok na neurocyty proti bunkovej smrti vyvolanej oxidačným stresom41, avšak v literatúre nebola uvedená žiadna iná biologická aktivita pre zlúčeninu 10. Antifungálne testy používajúce D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr odhalili, že tento tetrapeptid má inhibičnú aktivitu voči B. titulky a fytopatogénu sóje Fusarium virguliforme38. Naopak, žiadna inhibícia E. coli, B. subtilis a S. cerevisiae v prítomnosti D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr alebo D-Phe-L-Val-D-Val-L -Phe bol pozorovaný39. Hodnotila sa aj antifungálna aktivita tryptochalanínov, pretože sa zdalo, že tieto zlúčeniny sú chemickou odpoveďou P. digitatum proti P. citrinum v chemickom boji. Tryptochalaníny 1 a 4 boli testované a odhalili antifungálnu aktivitu proti P. citrinum. Zlúčeniny 1 a 4 mali MIC 300 ugml-1, čo inhibovalo produkciu spór P. citrinum (obr. S36). Podľa našich najlepších vedomostí je to prvá správa o antimikrobiálnej aktivite tryptochilanínov. Nedávno bola preukázaná zlúčenina 1 ako insekticídna zlúčenina proti Ae. larvy aegypti23; antifungálna aktivita môže poskytnúť lepšie pochopenie úlohy tryptochilanínov v prostredí citrusových patogénov, keď tieto zlúčeniny nie sú potrebné pre virulenciu P. digitatum.

BENEFITCISTANCHE: Antibakteriálny

Chemická vojna mení bunkovú stenu P. digitatum v spoločnej kultúre.

Skúmať pôsobenie sekundárnych metabolitov počasplesňovéinterakcie boli vzorky kokultúry zafarbené konžskou červeňou a pozorované pomocou konfokálnej laserovej skenovacej mikroskopie. Kongo červená sa bežne používa na farbenie polysacharidov obsahujúcich 1,4 väzby, ako napr.plesňovékomponent bunkovej steny chitín45,46. Hýfy P. digitatum boli pozorované v zóne konfrontácie (vzorka) a porovnané s hýfami vzdialenými od oblasti rozhrania (kontrola) (obr. S37). Kontrolné hýfy boli homogénne zafarbené konžskou červeňou, zatiaľ čo hýfy v oblasti rozhrania vykazovali zmenený vzor farbenia (obr. 6) s nepravidelnými škvrnami. Podobné vzory farbenia boli získané pre knockout mutantné huby, v ktorých mali deletované gény úlohu v organizácii bunkovej steny; v dôsledku toho mutanty vykazovali defektné bunkové steny a nepravidelné farbenie25,46,47. Abnormálne farbenie s Calcofluor White sa však pozorovalo u P. ostreatus P89 ošetrených 36°; vysoká teplota zmenená distribúcia chitínu a integrita bunkovej steny48. Tieto údaje ukazujú, že hýfy P. digitatum v kontakte s metabolitmi difundovanými počas spoločnej kultivácie majú defektnú bunkovú stenu, pretože sa Kongo červená viaže na štruktúry bunkovej steny húb. Bunková stena húb je atraktívnym cieľom antimikrobiálnych látok, pretože nie sú prítomné v bunkách cicavcov49,50. Na záver, mikroskopická analýza a antifungálne testy potvrdzujú, že metabolity zapojené do interakcie s hubami majú potenciál akoantimykotikuma môže to byť prirodzený mechanizmus, ktorý tieto fytopatogény vyvinuli, aby súťažili s inými mikroorganizmami o hostiteľa (obr. 7).

Závery

Hľadanie nových prírodných antimikrobiálnych látok je sľubnou oblasťou vo výskume prírodných produktov, pokiaľ ide o ekonomický dopad chorôb po zbere úrody na celosvetové poľnohospodárstvo. Okrem toho objavenie sa kmeňov húb odolných voči fungicídom spôsobuje objavenie novéhoantimykotikumlátky nahrádzajúce syntetické zlúčeniny mimoriadne dôležité. Pomocou kokultivácie medzi fytopatogénmi, ktoré súťažia o rovnakého hostiteľa, P. digitatum a P. citrinum, sme pozorovali interakciu húb. Prostredníctvom techniky MSI sme detegovali sekundárne metabolity zneškodnené do zóny rozhrania medzi mikroorganizmami. Tryptochalaníny, citrinadíny, chyrzogenamid A a tetrapeptidy vykazovali veľkú antifungálnu aktivitu, čo potvrdzuje, že kokultúry a technika MSI sú dobrou kombináciou pri hľadaní nových prírodných antimikrobiálnych látok.

Do tohto dátumu neexistujú žiadne informácie o interakcii medzi citrusovými patogénnymi hubami. Naše údaje odhalili zlúčeniny, ktoré zohrávajú úlohu v mikrobiálnej ekológii citrusov. Okrem toho sme preukázali, že študované metabolity majú veľký potenciál ako naprantimykotikumčinidiel, pretože bunkové steny húb sú jedným z hlavných cieľovantimykotikumzlúčeniny. Použitie identifikovaných zlúčenín ako prírodných antimykotík namiesto syntetických fungicídov by sa malo ďalej preskúmať. Tento dokument otvára nové možnosti výskumu a prispieva k životnému prostrediu a zdraviu ľudí, pomáha pri hľadaní bezpečnejších stratégií pre poľnohospodárstvo pomocou zlúčenín získaných z prírodných zdrojov.

BENEFITDOPLNOK CISTANCHE: ZLEPŠENIE IMUNITY