Antioxidačné a antikoagulačné účinky fenylpropanoidových glykozidov
Mar 30, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a, Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,
ABSTRAKT
Holoparazitické rastliny z čeľade Orobanchaceae, vrátane Cistanche, Orobanche a Phelipanche spp., sú známe pre svoje bohatstvo fenylpropanoidových glykozidov (PPG). Zistilo sa, že mnohé zlúčeniny PPG majú široké spektrum aktivít, ako sú antimikrobiálne, protizápalové, antioxidačné a pamäť zlepšujúce aktivity. Pre lepšie preskúmanie bioaktivity potenciálu európskej metličky (O Caryophyllaceae – OC, P Arenaria – PA, P Ramos – PR) a desiatich jednotlivých izolovaných fenylpropanoidných zložiek sme skúmali ich antiradikálový účinok, ochranný účinok proti oxidácii v plazme in vitro a vplyv na koagulačných parametroch. Testované extrakty vykazovali zachytávaciu aktivitu 50–70 percent sily Troloxu. Extrakt OC, bohatý na akteozid, mal o viac ako 20 percent lepší antiradikálový potenciál ako extrakt PR, ktorý ako jediný obsahoval PPG bez katecholovej skupiny B-kruhu v acylovej jednotke. Okrem toho sa zistilo, že iba osem testovaných PPG preukázalo antioxidačný potenciál v ľudskej plazme ošetrenej H2O2/Fe; avšak tri testované PPG mali okrem antioxidačných vlastností aj antikoagulačný potenciál. Zdá sa, že štruktúra PPG, najmä prítomnosť acylových a katecholových skupín, súvisí hlavne s ich antioxidačnými vlastnosťami. Antikoagulačný potenciál týchto zlúčenín súvisí aj s ich chemickou štruktúrou. Vybrané PPG vykazujú potenciál na liečbu kardiovaskulárnych ochorení spojených s oxidačným stresom.
Fenylpropanoidové glykozidy z Cistanche: antioxidačný stres
1. Úvod
Oxidačný stres je všeobecne známy pre svoj negatívny vplyv na zdravie živých organizmov, vrátane zrýchleného starnutia a niektorých druhov rakoviny. Výskyt oxidačného stresu je spojený s narušenou rovnováhou medzi oxidačnými a antioxidačnými mechanizmami (vrátane enzymatickej (kataláza, glutatiónperoxidáza) a neenzymatickej (glutatión) obrany) v bunkách tela [1]. Nadprodukcia reaktívnych foriem kyslíka (ROS), vrátane oxidačných radikálov a druhov s uzavretým plášťom, je jedným z hlavných mechanizmov za vznikom oxidačného stresu. Biologický účinok spôsobený ROS však do značnej miery závisí od koncentrácie, času expozície a miesta. Za normálnych podmienok (nízka koncentrácia) môžu kyslíkové/dusíkové radikály hrať úlohu sekundárnych poslov, ale na vyššej úrovni môžu začať reagovať s biologickými štruktúrami, ako sú bunkové membrány [2]. Medzi všetkými druhmi ROS spôsobuje hydroxylový radikál (HO.) jedno z najväčších poškodení biomakromolekúl: proteínov, lipidov a DNA. Je známe, že oxidačný stres hrá dôležitú úlohu v celom rade chorôb, vrátane kardiovaskulárnych. Poruchy krvného systému korelovali a/alebo im predchádzali zmeny rôznych parametrov hemostázy a plazmatických biomarkerov [1,3].
Na druhej strane mnohé prírodné látky, ako sú polyfenoly a polynenasýtené mastné kyseliny, boli identifikované ako silné antioxidanty schopné zabrániť tvorbe a/alebo zníženiu reaktívnych foriem kyslíka. Zlúčeniny s takýmito vlastnosťami sa nachádzajú v mnohých potravinárskych výrobkoch a farmaceutických prípravkoch rastlinného pôvodu. Preto sa široko odporúča strava obohatená o čerstvú zeleninu a ovocie a antioxidačné terapie založené na prírodných antioxidantoch, pretože môžu znížiť úroveň oxidačného stresu a zabrániť rôznym patofyziologickým procesom [4,5]. Rastlinné polyfenoly sú rôznorodou skupinou sekundárnych metabolitov, medzi ktorými zaujímajú dôležité miesto fenolové kyseliny, pretože sú široko rozšírené a vykazujú rôzne biologické účinky, ako sú antimikrobiálne, antioxidačné a protizápalové. Fenylpropanoidové glykozidy (PPG) sú esterové deriváty kyseliny hydroxyškoricovej a sú hlavnou/jedinou triedou sekundárnych metabolitov prítomných v holoparazitických rastlinách Orobanchaceae, vrátane Cistanche, Orobanche a Phelipanche spp. Viaceré druhy tejto čeľade sú vážnymi škodcami plodín, ktorých sa chcú farmári na poliach zbaviť (príklad Phelipanche ramosa), len málo z nich sa používa vo farmakológii, pričom väčšina z nich má pre človeka malý význam. Herba Cistanche sa vo veľkej miere používa v ázijskej tradičnej medicíne pri liečbe obličkovej nedostatočnosti a ako prostriedok na posilnenie imunity a pamäti, proti starnutiu a proti únave [6]. Fytochemické analýzy rôznych výskumných skupín ukázali, že fenylpropanoidové glykozidy, ako je akteozid, echinakozid a poliumozid, sú jednou z hlavných aktívnych zložiek Herba Cistanche [7]. Nedávna štúdia niekoľkých druhov repky metlovej nájdenej v Poľsku od Jedrejek et al. [8] preukázalo, že tento rastlinný materiál má podobné kvalitatívne zloženie (dominancia PPG), navyše sa rovná alebo dokonca prevyšuje Cistanche spp. z hľadiska obsahu účinných látok [8].
Predkladaná štúdia bola zameraná na vyhodnotenie antiradikálového a antioxidačného potenciálu, ako aj vplyvu na parametre hemostázy troch extraktov z repky metlovej (Orobanche caryophyllacea – OC, Phelipanche arearia – PA a P. ramosa – PR) bohatých na rôzne fenylpropanoidy, ako napr. ako aj ich jednotlivé zložky PPG. Antiradikálová kapacita sa merala pomocou kyseliny 2,2'-azinobis-3-etylbenztiazolín-6-sulfónovej/ekvivalentu troloxu (ABTS/TE) a 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu (DPPH ) testy. Oxidačný stres v plazmovom testovacom systéme bol indukovaný pomocou hydroxylového radikálu (H2O2/Fe), potom bola meraná peroxidácia lipidov (test reaktívnych látok s kyselinou tiobarbiturovou (TBARS)) a bola meraná hladina proteínových karbonylových a tiolových skupín. Medzi stanovené parametre hemostázy patrili: aktivovaný parciálny tromboplastínový čas (APTT), protrombínový čas (PT) a trombínový čas (TT).
extrakt z cistanche: antioxidačný
2. Materiály a metódy
2.1. Chemikálie
2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylový radikál (DPPH), kyselina 2,2′-azinobis-3-etylbenztiazolín-6-sulfónová (ABTS), persíran draselný, 6- kyselina hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchróman-2-karboxylová (Trolox), dimetylsulfoxid (DMSO), kyselina tiobarbiturová (TBA), kyselina mravčia (trieda LCMS) a H2O2 zo Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA). Metanol (gradient HPLC) a acetonitril (trieda LC-MS) boli získané od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). Desať fenylpropanoidových zlúčenín testovaných v tejto práci, vrátane 2'-O-acetylakteozidu (97 percent), 2'-O-acetylpoliumozidu (98 percent), 3-O-metylpoliumozidu (96 percent), akteozidu (99 percent), arenariozid (97 percent), crenatozid (98 percent), felipozid (99 percent), poliumozid (99 percent), tubulozid A (96 percent) a wiedemanozid D (96 percent) sme predtým izolovali z nižšie uvedeného rastlinného materiálu [ 8]. Čistota zlúčenín bola hodnotená pomocou UHPLC-PDA-MS analýzy. Ultračistá voda bola pripravená interne s použitím systému na čistenie vody Milli-Q (Millipore Co.). Ostatné činidlá boli analytickej čistoty a boli poskytnuté domácimi komerčnými dodávateľmi.
2.2. Rastlinný materiál
Kvitnúce rastliny troch druhov repky metlovej, vrátane Orobanche caryophyllacea Sm., Phelipanche arearia Pomel a P. ramosa (L.) Pomel identifikoval prof. Renata Piwowarczyk (Univerzita Jana Kochanowského, Kielce, Poľsko) a zozbierané z prírodného zdroja v Poľsku. Poukážkové exempláre (O. caryophyllacea – Chomentowek ´ (50.3349◦N, 20.4000◦E), xerotermné trávne porasty, parazituje Galium boreale, máj 2014; P. arearia – Zwierzyniec, psanphilize, 12◦N paras. Artemisia campestris, jún 2014, P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), pole, parazituje Solanum lycopersicum, september 2014) sú uložené v Herbári Univerzity Jana Kochanowského v Kielciach (KTC). Rastlinný materiál bol pred extrakciou lyofilizovaný a jemne rozomletý.
prášok z cistanche extraktu
2.3. Príprava výťažkov z metličiek
Práškový rastlinný materiál (O. caryophyllacea (OC) – 2 g, P. arenaria (PA) – 3 g a P. ramosa (PR) – 3 g) bol extrahovaný 80 percentným MeOH pri 40 ◦C a 1500 psi (tlak rozpúšťadla ) použitím zrýchleného rozpúšťadlového extraktora ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Extrakty sa odparili a lyofilizovali (lyofilizátor Gamma 2–16 LSC, Christ, Nemecko). Účinnosť extrakcie pre OC, PA a PR bola 55 percent, 37 percent a 43 percent hmotnosti rastlinného materiálu. Kvôli vysokému obsahu uhľohydrátov (údaje nie sú uvedené) sa surové extrakty ďalej purifikovali extrakciou na pevnej fáze (SPE) na mikrokolóne Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Cukry sa odstránili pomocou 1 percenta MeOH, potom sa zlúčeniny, ktoré sú predmetom záujmu, eluovali s 80 percentami MeOH. Po odstránení rozpúšťadla boli extrakty OC, PA a PR lyofilizované (lyofilizátor Gamma 2–16 LSC) a výťažky čistenia SPE boli 53 percent (OC), 67 percent (PA) a 51 percent (PR) .
2.4. Fytochemické vlastnosti extraktov z metličiek
Kvalitatívne a kvantitatívne analýzy extraktov z metlice boli uskutočnené pomocou systému ACQUITY UPLC (Waters) pripojeného k detektoru fotodiódového poľa (PDA) a tandemovému kvadrupólovému hmotnostnému spektrometru (TQD-MS/MS). Lyofilizované extrakty OC, PA a PR sa rozpustili v 50 percentách metanolu v koncentrácii 0,50 mg/ml a potom sa chromatografovali na kolóne BEH C18 (1{ {21}}0 x 2,1 mm, 1,7 um, Waters). Chromatografické podmienky boli nasledovné: teplota pece – 25 ◦C, lineárny gradient 10→25 percent mobilnej fázy B (0,1 percenta kyseliny mravčej v acetonitrile) v mobilnej fáze A (0,1 percenta kyseliny mravčej v H2O) počas 12 minút, prietok – 0,4 ml/min, injekčný objem – 2 μL, UV rozsah – 190–490 nm (rozlíšenie 3,6 nm). MS analýza sa uskutočnila v režime negatívnych iónov s elektrosprejovou ionizáciou (ESI), s použitím nasledujúcich nastavení: rozsah skenovania 100–1200 m/z; kapilárne napätie 2,8 kV; napätie kužeľa 35 V; teplota zdroja 150 ◦C; teplota desolvatácie 450 ◦C; prietok desolvatačného plynu 900 l/h a prietok kužeľového plynu 100 l/h. Získavanie a spracovanie údajov sa uskutočnilo pomocou softvéru Waters MassLynx 4.1.
Píky fenylpropanoidových glykozidov (PPG) boli identifikované porovnaním získaných LC-MS údajov s údajmi predtým izolovaných zlúčenín [8]. Kvantifikácia PPG v extraktoch metly bola založená na metóde UPLC-UV s detekciou pri 330 nm a externej štandardnej kalibrácii s použitím akteozidu (Sigma-Aldrich, väčší alebo rovný 99 percent, HPLC) ako skupinového štandardu . Lineárna kalibračná krivka bola pripravená v šiestich koncentráciách v rozsahu 1–200 ug/ml a vykazovala dobrú linearitu (R2 Väčšie alebo rovné 0,999). Kvantitatívne výsledky predstavujú strednú hodnotu ± SD z troch injekcií a boli vyjadrené ako miligramy akteozidových ekvivalentov (ekv.) na gram extraktu (mg akteozidových ekvivalentov/g).
2.5. Antiradikálová aktivita in vitro
2.5.1. Test zachytávania radikálov ABTS
ABTS antiradikálový test sa uskutočnil pomocou metódy opísanej Kontekom a kol. [9], s miernymi modifikáciami nasledovne: 20 percent MeOH sa použilo na prípravu činidiel (7 mM ABTS a 4,9 mM persíran draselný); roztoky extraktov OC, PA a PR so štyrmi koncentračnými hladinami v rozsahu 100-400 ug/ml a roztoky Troloxu so šiestimi koncentračnými hladinami v rozsahu 10-250 ug/ml boli pripravené s 50 % MeOH. Pomer vzorky k ABTS plus pracovnému roztoku bol 1:25 (v/v). Absorbancia pri 734 nm sa merala po 30 minútach inkubácie v tme pomocou UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
Inhibícia absorbancie (v percentách) sa vypočítala nasledovne: [(Abskontrola – Absample)/Abscontrol] x 100.
Troloxové ekvivalenty (TE) extraktov repky metlovej sa vypočítali pomocou vzorca TE {{0}} Mvzorka/Mštandard, kde m je sklon priamych kriviek (inhibícia absorbancie vs. koncentrácia). Hodnota TE vzorky popisuje jej normalizovanú aktivitu voči Troloxu (TEstandard =1.0). Hodnoty IC50 pre extrakty OC, PA a PR a Trolox sa dosiahli experimentálne, potom sa vypočítali z ich priamych kriviek (inhibícia absorbancie vs. koncentrácia) a sú vyjadrené v ug/ml.
Test sa uskutočnil v troch opakovaniach a výsledky sú prezentované ako priemer ± štandardné odchýlky (SD).
Obr. 1. Chemické štruktúry fenylpropanoidových glykozidov nájdených v študovaných druhoch repky metlovej. Označené fenolické látky (*) sa použili na biologické testy v plazmovom systéme.
2.5.2. Test zachytávania radikálov DPPH
DPPH antiradikálový test sa uskutočnil pomocou metódy opísanej v Jedrejek et al. [8] a Brand-Williams a kol. [10], s miernymi úpravami nasledovne: roztoky extraktov OC, PA a PR v štyroch koncentračných hladinách v rozmedzí 50–250 ug/ml a roztoky Troloxu v šiestich koncentračných hladinách v rozmedzí 10– 250 ug/ml, boli pripravené s 50 percentným MeOH. Pomer vzorky k DPPH bol 1:19 (v/v). Absorbancia pri 517 nm sa merala po 30 minútach inkubácie v tme pomocou UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio).
Inhibícia absorbancie (v percentách) sa vypočítala nasledovne: [(Abskontrola – Absample)/Abscontrol] x 100.
Hodnoty troloxového ekvivalentu (TE) a IC50 skúšobných vzoriek sa vypočítali rovnakým spôsobom ako v teste ABTS (časť 2.5.1). Test sa uskutočnil v troch opakovaniach a výsledky sú prezentované ako priemer ± SD.
2.6. Zásobné roztoky testovaných rastlinných zlúčenín a extraktov pre experimenty s ľudskou plazmou
Zásobné roztoky testovaných zlúčenín a rastlinných extraktov boli pripravené v 50 percentách DMSO. Konečná koncentrácia DMSO v testovaných vzorkách bola nižšia ako 0,05 percenta a jeho účinky boli stanovené vo všetkých experimentoch.
Obr. 2. UPLC-PDA chromatogramy extraktov z metličiek, Orobanche caryophyllacea, Phelipanche arearia a P. ramosa.
2.7. Izolácia ľudskej plazmy
Ľudská krv alebo plazma bola získaná od šiestich pravidelných darcov (nefajčiarov a žien) do krvnej banky (Lodž, Poľsko) a zdravotného strediska (Lodž, Poľsko). Krv sa odoberala ako roztok CPD (citrát/fosfát/dextróza; 9:1; v/v krv/CPD) alebo roztok CPDA (citrát/fosfát/dextróza/adenín; 8,5:1; v/v; krv/CPDA). Darcovia neužívali žiadne lieky ani návykové látky (vrátane tabaku, alkoholu a doplnkov antioxidantov) najmenej dva týždne pred darovaním. Naša analýza vzoriek krvi bola vykonaná podľa smerníc Helsinskej deklarácie pre ľudský výskum a schválená Výborom pre etiku výskumu ľudských experimentov na Univerzite v Lodži. Plazma sa pripravila centrifugáciou čerstvej ľudskej krvi pri 4500 x g počas 25 minút pri teplote miestnosti. Koncentrácia proteínu bola vypočítaná meraním absorbancie testovaných vzoriek pri 280 nm podľa postupu Whitakera a Granuma [11].
2.8. Markery oxidačného stresu v ľudskej plazme
2.8.1. Meranie peroxidácie lipidov
Peroxidácia lipidov v plazme bola kvantifikovaná meraním koncentrácie látok reaktívnych s kyselinou tiobarbiturovou (TBARS). Koncentrácia TBARS bola vypočítaná pomocou molárneho extinkčného koeficientu (ε =156, 000 M− 1 cm− 1). Metóda je podrobnejšie opísaná inde [12,13].
2.8.2. Meranie karbonylovej skupiny
Hladina karbonylových skupín bola vypočítaná pomocou molárneho extinkčného koeficientu (ε=22,000 M− 1 cm− 1) a bola vyjadrená ako nmol karbonylových skupín/mg plazmatického proteínu podľa Bartosza [13 ] a Levine a kol. [14].
2.8.3. Stanovenie tiolovej skupiny
Obsah tiolových skupín v plazmatických proteínoch bol meraný spektrofotometricky pomocou SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Nemecko) absorbanciou pri 412 nm s 5,5'-ditio-bis-(2- nitrobenzoovou kyselinou). Metóda je podrobnejšie opísaná inde [15–17].
2.9. Parametre hemostázy
2.9.1. Meranie protrombínového time (PT)
PT bola stanovená koagulometricky s použitím optického koagulačného analyzátora (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poľsko) podľa Malinowska et al. [18].
Tabuľka 1 Obsah fenylpropanoidových glykozidov v troch študovaných extraktoch z metlice, Orobanche caryophyllacea (OC), Phelipanche arearia (PA) a P. ramosa (PR).
2.9.2. Meranie trombínového času (TT)
TT sa určil koagulometricky s použitím optického koagulačného analyzátora (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poľsko) podľa metódy opísanej Malinowskou et al. [18].
2.9.3. Meranie aktivovaného parciálneho tromboplastínového času (APTT)
APTT bol stanovený koagulometricky s použitím K-3002 optického koagulačného analyzátora (Kselmed, Grudziadz, Poľsko) podľa Malinowska et al. [18].
2.10. Analýza dát
Test Q-Dixon bol vykonaný na odstránenie neistých údajov. Dáta boli testované na normálnu distribúciu pomocou Shapiro-Wilkovho testu a rovnosť rozptylu s Leveneovým testom. Štatisticky významné rozdiely boli identifikované pomocou ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho viacnásobný porovnávací test alebo Kruskal-Wallisov test. Porovnania sa považovali za významné pri p < 0,05.="" hodnoty="" sú="" uvedené="" ako="" priemer="" ±="">
desertliving cistanche: Antioxidácia
3. Výsledky a diskusia
Desať predtým nami izolovaných fenylpropanoidových glykozidov [8], vrátane 2'-O-acetylakteozidu, 2'-O-acetyl-pódiovej strany, 3-O-metyl-pódiovej strany, akteozidu, arény vo vnútri, crenatozidu, pódia, strana pódia, tubulozid A a tenipozid D spolu s tromi extraktmi z metlice (Orobanche Caryophyllaceae (OC), Phelipanche Arenaria (PA) a P. Ramos (PR)) boli v súčasnosti študované na zmiernenie oxidačného stresu a antikoagulačné vlastnosti v ľudskej plazme systém. Chemické štruktúry testovaných fenylpropanoidov sú uvedené na obr. 1 a ako je možné vidieť, všetky sú postavené podľa podobného vzoru s rovnakými/podobnými podjednotkami: hydroxytyrozol, monosacharidy (glukóza, ramnóza a/alebo xylóza) a kyselina hydroxyškoricová. Väčšina skúmaných zlúčenín PPG je nahradená kyselinou kávovou, ale táto môže byť nahradená kyselinou kumarovou alebo ferulovou.
Okrem jednotlivých PPG zlúčenín boli do biologickej štúdie zaradené aj tri extrakty z metlice – OC, PA a PR, ktoré sú zmesou viacerých PPG a predtým slúžili ako východiskový materiál na izoláciu zlúčenín. Ďalším dôvodom pre výber troch rôznych druhov bol veľký rozdiel vo fytochemickom profile medzi nimi, ako je možné vidieť na obr. 2. Podrobnejšie porovnanie extraktov OC, PA a PR, vrátane kvantitatívnych údajov, je uvedené v tabuľke 1. Akteozid bol hlavnou zložkou extraktu O. caryophyllacea (690 mg/g), u P. arenaria dominoval feliposid a arenariozid (spolu 550 mg/g), zatiaľ čo poliumozid a jeho acetylovaný derivát boli najdôležitejšími metabolitmi v P. extrakt z ramosa (spolu 640 mg/g). Skúmané extrakty sa líšili aj celkovým obsahom fenylpropanoidov, najvyššie množstvo bolo zistené v OC (810 mg/g), o niečo nižšie v PR (795 mg/g), nižšie v PA (685 mg/g). Okrem toho je potrebné poznamenať, že prítomnosť PPG s inými ako kafeoylovými skupinami, ako je kumaroyl alebo feruloyl, bola zistená iba v extrakte P. ramosa, kde tieto zlúčeniny tvorili asi jednu šestinu celkových PPG (asi 120 mg/ g) (Tabuľka 1).
Predchádzajúce štúdie antiradikálovej aktivity fenylpropanoidových glykozidov od Heilmanna a kol. [19] a Jedrejek a kol. [8], vrátane približne 30 rôznych PPG, ako je akteozid, izoakteozid a krenatozid, odhalili jeho silný vzťah k štruktúre acylových skupín (kyselina fenolová a tyrozol). Vo všeobecnosti modifikácia alebo substitúcia katecholovej časti acylovej jednotky viedla k významnému zníženiu aktivity zachytávania reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a DPPH radikálu. V tejto štúdii sa skúmal antiradikálový in vitro potenciál troch extraktov z metlovitého (OC, PA a PR) pomocou testov ABTS a DPPH a výsledky sa porovnávali navzájom, ako aj s aktivitou jednotlivých fenylpropanoidových zložiek meranou v naša predchádzajúca štúdia [8]. Výsledky boli vyjadrené ako ekvivalenty Troloxu (TE) a hodnoty IC50 (tabuľka 2). Vo všeobecnosti boli všetky tri extrakty dobrými lapačmi radikálov ABTS aj DPPH, ale boli pozorované aj rozdiely medzi testovanými vzorkami (odhadovaná TE bola v rozsahu 0,5–0,7; 1,0 bola ekvivalentom Troloxu). Antiradikálová vychytávacia aktivita vzoriek bola v nasledujúcom poradí: Trolox > OC > PA > PR. Extrakt z Orobanche caryophyllacea (IC50=155–275 µg/ml) mal o viac ako 20 percent vyššiu aktivitu ako extrakt z Phelipanche ramosa (IC50=200–320 µg/ml).
Tabuľka 2 Antiradikálová aktivita in vitro troch študovaných extraktov z metlice (Orobanche caryophyllacea (OC), Phelipanche arearia (PA) a P. ramosa (PR)) pomocou radikálových testov ABTS a DPPH
Hlásenú najvyššiu aktivitu zachytávania radikálov extraktu OC možno vysvetliť najvyšším obsahom PPG v tejto vzorke, ako aj vstupom akteozidu, jeho dominantnej zložky, ktorá je podľa predchádzajúceho výskumu [8,19] jednou z najsilnejší lapač voľných radikálov spomedzi metabolitov z tejto skupiny (TEDPPH=0.87; [4]). Vzhľadom na vzájomný vzťah antiradikálovej aktivity a obsahu fenylpropanoidov v extraktoch OC, PA a PR sa však medzi týmito dvoma faktormi nenašla jednoduchá korelácia (r < 0,5),="" čo="" naznačuje="" významný="" vstup="" kvalitatívny="" profil.="" súvisí="" to="" najmä="" s="" extraktom="" p.="" ramosa,="" ktorý="" sa="" napriek="" vysokej="" hladine="" ppg="" (0,8="" g/g)="" vyznačoval="" najnižšou="" biologickou="" aktivitou="" spomedzi="" testovaných="" vzoriek="" (te="" ~="" 0.="" 5).="" pr="" extrakt,="" ako="" je="" uvedené="" vyššie,="" bol="" jedinou="" vzorkou,="" ktorá="" obsahovala="" fenylpropanoidy="" s="" kumarovou="" alebo="" ferulovou="" kyselinou,="" látky="" bez="" katecholovej="" skupiny="" b-kruhu,="" o="" ktorých="" sa="" uvádza,="" že="" majú="" znížený="" antioxidačný="" potenciál.="" štyri="" nami="" testované="" zlúčeniny="" ppg="" s="" modifikovanou="" kyselinou="" kávovou,="" vrátane="" 3-o-metylpoliumozidu,="" ramozidu="" a="" a="" wiedemanozidu="" d,="" mali="" tedpph="" približne="" 0,3="" [8].="" súčasné="" výsledky="" sú="" teda="" v="" súlade="" a="" potvrdzujú="" zistenia="" predchádzajúcich="" antiradikálových="" in="" vitro="" experimentov="" na="">
Ako Chen a kol. [20] je spojená s väčšou schopnosťou darovania H alebo stabilizáciou radikálu rôznymi funkčnými skupinami zmesi zlúčenín. Bolo identifikovaných niekoľko štruktúrnych prvkov, ktoré zvyšujú priamu antioxidačnú aktivitu polyfenolov, najmä tých, ktoré sú spojené s počtom a polohou hydroxylových skupín. Predpokladá sa, že aktivita zachytávania voľných radikálov sa zvyšuje so zvyšujúcim sa počtom –OH skupín. Avšak poloha týchto skupín v molekule má ešte väčší vplyv na vykonávanú aktivitu. Relatívne stabilné účinné zlúčeniny sú tie, ktoré majú vo svojej štruktúre 3,4-dihydroxyskupinu, ako aj tie, ktoré majú viac ako dve hydroxylové skupiny [21]. Chemická štruktúra antioxidačnej látky umožňuje pochopiť mechanizmus antioxidačnej reakcie. Lopez-Munguía' a kol. [22] na základe výpočtov funkčnej teórie hustoty (DFT) určili, že antioxidačný mechanizmus PPG prebieha prostredníctvom sekvenčného prenosu jedného elektrónu so stratou protónu (SPLET). Avšak Li a spol. [23] sa pokúsili preskúmať mechanizmy fenolových fenylpropanoidných antioxidantov, dospeli k záveru, že PPG (akteozid, forsytozid B a poliumozid) sa môžu podieľať na viacerých dráhach na uplatnenie antioxidačného účinku, čo zvyšuje úlohu cukrových zvyškov.
Štúdie ukázali, že antioxidanty rastlinného pôvodu sú účinnými modulátormi hemostázy pri kardiovaskulárnych ochoreniach [24–26]. Rôzne rastliny používané v tradičnej medicíne obsahujú významné hladiny PPG [27,28]. Okrem toho je známe, že PPG majú celý rad biologických aktivít vrátane protizápalových, antinefritických a antihepatotoxických vlastností [29–33].
Vo svojej nedávnej štúdii Jedrejek et al. [8] opísali izoláciu PPG z troch poľských metličiek a zhodnotili ich antioxidačnú aktivitu testom DPPH. Na základe toho táto štúdia hodnotí, či desať vybraných PPG izolovaných z týchto rastlín môže znížiť oxidačný stres v ľudskej plazme ošetrenej silným biologickým oxidantom, tj donorom hydroxylových radikálov H2O2/Fe, a modulovať koagulačné vlastnosti plazmy in vitro. Antioxidačné vlastnosti desiatich izolovaných PPG boli stanovené podľa vybraných parametrov oxidačného stresu: hladina TBARS ako markera peroxidácie lipidov spolu s hladinami karbonylových a tiolových skupín ako markerov oxidačného poškodenia proteínov.
Hladiny peroxidácie lipidov v plazme a karbonylácie proteínov v plazme indukovanej H2O2/Fe boli významne znížené v prítomnosti ôsmich testovaných zlúčenín, t. akteozid, krenatozid, 2'-O-acetylakteozid, felipozid, arenariozid, tubulozid A, poliumozid a 3- O-metylpolimuozid, vo všetkých testovaných koncentráciách (1, 5 a 50 ug/ml); avšak ani jeden účinok nebol pozorovaný pre dve z testovaných zlúčenín, napr. 2'-O-acetylpoliumozid a wiedemanozid D alebo ktorýkoľvek z testovaných extraktov v akejkoľvek koncentrácii (1, 5 a 50 µg/ml). Okrem toho sa nezistilo, že by žiadna z testovaných zlúčenín alebo testovaných extraktov chránila plazmu pred oxidáciou tiolových skupín v proteínoch indukovanou H2O2/Fe (obr. 3–5). Testované extrakty však môžu byť zdrojom zlúčenín s rôznymi biologickými vlastnosťami.
cistanche stonka
Výsledky tejto štúdie po prvýkrát naznačujú, že osem z testovaných PPG vykazuje antioxidačný potenciál v ľudskej plazme v prítomnosti exogénnych reaktívnych foriem kyslíka inhibíciou peroxidácie lipidov a karbonylácie proteínov v plazme ošetrenej H2O2/Fe. Okrem toho 2'-O-acetylpoliumozid a wiedemanozid D nevykazovali žiadny takýto účinok. Vo všeobecnosti sú naše zistenia v súlade s predchádzajúcimi in vitro experimentmi na PPG. Heilmann a kol. [19] a Jedrejek a kol. [8] uvádzajú koreláciu medzi chemickou štruktúrou PPG a ich aktivitami. Zdá sa, že antioxidačné vlastnosti PPG primárne súvisia so štruktúrou ich acylových skupín, tj jednotky fenolovej kyseliny a fenylpropanoidu, vrátane prítomnosti a/alebo modifikácie katecholovej skupiny. Napríklad sa zistilo, že wiedemaniozid D stráca svoj antioxidačný potenciál voči plazme spracovanej s H202/Fe po nahradení jeho kofeoylovej skupiny feruloylovou skupinou.
Zmeny v procese koagulácie sú často výsledkom oxidačného stresu; tieto zmeny môžu modulovať funkcie kardiovaskulárneho systému a môžu viesť k rozvoju kardiovaskulárnych ochorení [1]. Z desiatich rastlinných zlúčenín a troch rastlinných extraktov testovaných v tejto štúdii tubulozid, poliumozid a 3-O-metylpoliumozid a všetky testované extrakty preukázali, že významne predlžujú trombínový čas vo všetkých testovaných koncentráciách, tj. 1, 5 a 50 ug/ml (obr. 6B). Žiadny z týchto extraktov ani žiadna z testovaných zlúčenín však nezmenila PT alebo APTT (obr. 6A a C).
Tabuľka 3 porovnáva účinky PPG (5 ug/ml) na biomarkery oxidačného stresu v plazme ošetrenej H2O2/Fe a ich vplyv na koaguláciu. Osem z testovaných PPG preukázalo antioxidačný potenciál iba v upravenej ľudskej plazme; zistilo sa však, že tri testované PPG majú antioxidačné vlastnosti aj antikoagulačný potenciál. Je zaujímavé, že výsledky testu DPPH sa nezhodovali s výsledkami získanými v biologickom modeli s použitím ľudskej plazmy ošetrenej H2O2/Fe: antioxidačný potenciál testovaných extraktov môže byť blokovaný určitými zlúčeninami prítomnými v plazme.
Na záver, naše súčasné zistenia vrhajú nové svetlo na antioxidačný potenciál a antikoagulačné vlastnosti PPG. Zdá sa, že štruktúra PPG, najmä prítomnosť acylových a katecholových skupín, súvisí hlavne s ich antioxidačnými a antikoagulačnými vlastnosťami. Vybrané PPG môžu mať potenciál na liečbu kardiovaskulárnych ochorení spojených s oxidačným stresom. Na určenie koncentrácií týchto zlúčenín potrebných pre modely in vivo sú však potrebné ďalšie experimenty.
