Bieliaca aktivita zložiek izolovaných z miazgy Trichosanthes

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang ,1,2Xiuqin Hu ,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1Jie Xin,1a Qingmei Guo 2

Abstrakt: Bieleniekozmetický trh má svetlú budúcnosť a čisto prírodné bieliace produkty tradičnej čínskej medicíny boli vždy stredobodom výskumu. V tomto výskume bola prvýkrát izolovaná a vyčistená bieliaca aktívna zložka dužiny čínskej medicíny Trichosanthes a jejbieleniemechanizmus bol objasnený. Na ich izoláciu a čistenie sa použili chromatografické metódy, ako je silikagél, ODS a HPLC. Bunky B16 sa použili na meranie antioxidačnej aktivity,tyrozinázaaktivitu a aktivitu odstraňovania melanínu. Celkovo sa izolovalo 20 zlúčenín vrátane p-hydroxybenzaldehydu (1), kyseliny salicylovej (2), kyseliny vanilovej (3), kyseliny izovanilovej (4), protokatechuátu (5), kyseliny transškoricovej (6), {{9 }}kyselina kumarová (7), kyselina trans-ferulová (8), drechslerol-B (9), cyklohexanol 3-palmitát (10), 5-acetoxymetyl-2-furaldehyd (11), 5-hydroxymetylfurfural (12), diosmetín (13), apigenín (14), chryzoberyl (15), luteolín (16), 4′-hydroxyscutellarin (17), kvercetín (18), 3′,{{31} }dihydroxy-7-(-D-glukopyranozyloxy)-4′-metoxyflavón (19) a ciprofloxacín-7-0- -D-glukozid (20). Medzi nimi zlúčeniny 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 a 20 majú dobré antioxidačné opravné účinky; zlúčeniny 3, 4, 5, 6 a 7 majú vysokú inhibíciu čiernej farby; zlúčeniny 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 a 20 majú zjavnú inhibičnú aktivitu voči tyrozínoxidáze. Výsledky 1e položili základy pre ďalší rozvoj a využitie zdrojov miazgy Trichosanthes a zároveň poskytli základ pre rozvoj prírodnýchbieleniekozmetika.

Cistanche herbaje aprírodná bieliaca zložka.

1. Úvod

Trichosanthes kirilowii Maxim. je trváca popínavá bylina z čeľade Cucurbitaceae. Jeho plody, semená, kôra a koreňová oblasť sa bežne používajú ako tradičné čínske lieky. Pri výrobe a spracovaní Semen Trichosanthis a Pericarpium Trichosanthis sa dužina Trichosanthes po dlhú dobu často vyraďuje, čo vedie k značnému odpadu. V súčasnosti sa správy o dužine Trichosanthes zameriavajú najmä na porovnanie obsahu cukru, aminokyselín, vitamínov a iných živín [1–4]. Neexistuje žiadna správa o chemickom zložení miazgy Trichosanthes. Preto je potrebné systematicky študovať chemické zložky buničiny.

Zároveň s rýchlym rozvojom ekonomiky je kozmetika nielen produktom životného štýlu s vysokou spotrebou, ale stáva sa aj najobľúbenejšou „potrebou“ žien. Mnohé knihy klasickej čínskej medicíny alebo materiamedica zaznamenali, že dreň Trichosanthes má funkciubieleniea účinky odstraňovania vrások [5–7]. 1e predchádzajúce výsledky našej výskumnej skupiny ukazujú, že vodný extrakt miazgy Trichosanthes mal vyššítyrozinázainhibičná aktivita a miera inhibície tyrozinázy bola asi 70 percent. 1spoločnýbielenieako kontrolné látky boli použité vitamín C (VC) a arbutín [8]. Predbežne sa dokázalo, že extrakt z dužiny Trichosanthes má určitý bieliaci účinok inhibíciou aktivity tyrozinázy. Preto je veľmi dôležité študovať chemické zložky a mechanizmus bielenia miazgy Trichosanthes.

Thebieleniemechanizmus možno zhrnúť ako inhibíciu syntézy melanínu a urýchlenie prenosu melanínu. Proces tvorby melanínu v melanocytoch je nasledujúci:tyrozinázaoxiduje tyrozín na polymorf BA (DOPA); potom sa oxiduje na dopachinón. Po sérii metabolických reakcií vzniká melanín. Tyrozináza je jediným enzýmom obmedzujúcim rýchlosť v reakčnom procese a jej aktivita určuje množstvo syntetizovaného melanínu. Keď je aktivita tyrozinázy zvýšená, zvyšuje sa melaninsyntéza; keď je aktivita tyrozinázy inhibovaná, syntéza melanínu je znížená [9]. 1e aktívne centrum tyrozinázy má dvojité aktívne miesto medi a každý ión medi sa kombinuje s 3 histidínovými zvyškami s 1 alebo 2 valenciami. Preto redukcia s antioxidačnými účinkami môže interagovať s atómom medi na aktívnom mieste tyrozinázy alebo redukovať medziprodukt v procese syntézy melanínu, aby sa inhibovala tvorba melanínu[10, 11]. Okrem toho môže pri bielení zohrávať úlohu aj inhibícia prenosu zrelých melanocytov na keratinocyty.

Na stanovenie účinku sa používa technológia bunkovej kultúrybielenieaktívne zložky natyrozinázaaktivitu a produkciu melanínu v melanocytoch in vitro. Bunková línia myšieho melanómu (bunky B16) pochádza z buniek myšacieho kožného melanómu a jej základná štruktúra, najmä pokiaľ ide o syntézu melanínu, je v podstate rovnaká ako u buniek normálneho ľudského melanómu. Keďže je veľmi ťažké kultivovať bunky primárneho kožného melanómu u ľudí, myšací model možno použiť ako testovaciu bunku na stanoveniebielenieaktívne zložky. Preto sa bunky B16 použili na meranie antioxidačnej aktivity, aktivity tyrozinázy a aktivity odstraňovania melanínu a predbežne sa stanovili bieliace aktívne zložky a súvisiaci mechanizmus. Výsledky položili základ pre ďalší rozvoj a využitie zdrojov dužiny Trichosanthes a zároveň poskytli základ pre vývoj prírodnej bieliacej kozmetiky.

2. Experimenty

2.1. Materiály.

Trichosanthes trichosanthis bol zozbieraný z pestovateľskej základne bylinnej medicíny Hebao v Pinyin, Jinan. 1e vzorky identifikoval profesor QingmeiGuo z Shandongskej univerzity tradičnej čínskej medicíny. Po odstránení šupky a semien sa získala dužina z ovocia. Po lyofilizácii bola dužina rozdrvená, premiešaná a nakoniec umiestnená do exsikátora na ďalšie použitie.

čerstvé cistanchesechinakozidúčinky

2.2. Životaschopnosť buniek.

B-16 bunky (myšie melanómové bunky) boli zakúpené od KeyGEN a udržiavané v médiu DMEM doplnenom 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS), pri 37 stupňoch vo vlhkej atmosfére s 5 percentami CO2. 1en, B-16bunky sa naočkovali na 96-jamkové platne (10 x 104 buniek/jamka) na 24-hodinovú inkubáciu.

2.3. Príprava rôznych extraktov.

Surovina dužiny Trichosanthes kirilowii bola 4,5 kg. 1e dužina bola 3-krát namočená v 10-násobku 95-percentného etanolu. Extrakty sa spojili a skoncentrovali na približne 3,0 1. Aetylacetátový extrakt sa získal dispergovaním etanolového extraktu v 15 1 vody, extrahovaním etylacetátom, kým extrakt nebol bezfarebný. le extrakty sa spojili a skoncentrovali za zníženého tlaku.

Etylacetátový extrakt sa zmiešal so silikagélom (100–200 sito) v pomere 1:2 (extrakt: silikagél, v/ v). 1 rozpúšťadlo sa odparilo a gél sa odložil. 1e sklenená chromatografická kolóna (8{{30}} mm × 1200 mm) bola naplnená 200-300 mesh silikagélom a D101 makroporézna živica a potom sa kolóna eluovala etylacetátom, petroléterom (10 percent, 25 percent, 50 percent, 75 percent a 100 percent) a metanolom, etylacetátom (5 percent, 10 percent, 25 percent, 50 percent , 75 percent a 100 percent ), na zber každého toku. Nakoniec sa každá frakcia odobrala a upravila na nasledujúce koncentrácie: 0,003125 mg/ml, 0,00625 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml ml, 1,0 mg/ml a 2,0 mg/ml a potom sa použije na spracovanie kultivovaných buniek. Na konci liečby sa do každej jamky pridalo 20 ul roztoku MTT (5 mg/ml). 1e bunky sa inkubovali 20 minút pri 37 stupňoch. 1 esupernatant sa odstránil a do každej jamky sa pridalo 100 ul DMSO. Absorbancia le sa merala pri 490 nm. 1eexperiment sa opakoval 3-krát. Miera prežitia 1e sa vypočítala takto:

percento prežitia=(experimentálna skupina prázdna skupina)/(kontrolná skupina - prázdna skupina) × 100 percent.

Optimálna koncentrácia (Cl) každej frakcie sa vypočítala podľa funkčného vzťahu medzi mierou prežitia a koncentráciou každej frakcie. C1 sa zriedil 2, 4, 6 a 8 krát, aby sa získali koncentrácie C2, C3, C4 a C5. 1e rôzne extrakty z dužiny sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1: Polárne extrakty z dužiny Trichosanthes a optimálna koncentrácia.

2.4. Bieliaci experiment

2.4.1. Antioxidačný test.

Na stanovenie životaschopnosti buniek sa použil MTT test (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, B-16 bunky sa naočkovali na 96-jamkové platne (10 × 104 buniek/jamka) počas 24 hodín a ošetrili sa rôznymi extraktmi alebo zlúčeninami počas 24 hodín. Po spracovaní bolo kultivačné médium odstránené a dvakrát premyté PBS. 1en sa pridalo 0,05 percenta H202 a bunky sa kultivovali 4 hodiny. Potom sa B-16 bunky inkubovali v 20 ul roztoku MTT (5 mg/ml) pri 37 stupňoch počas 4 hodín. 1en sa supernatant z kultúry odstránil a zvyšok sa rozpustil v 100 ul DMSO. Absorbancia le sa detegovala pri 490 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Tecan Trading AG). 1eexperimenty boli vykonané paralelne 3-krát.

2.4.2. Inhibícia produkcie melanínu.

Produkcia melanínu bola stanovená detekciou obsahu melanínu v bunkách pyrolýzou NaOH [12]. Bunky boli nasadené na 96-jamkové kultivačné platne počas 24 hodín pri hustote buniek 10 x 104 buniek/jamka.1en, bunky boli ošetrené rôznymi extraktmi alebo zlúčeninou počas 24 hodín. Potom sa supernatant bunkovej kultúry (300 ul) odstránil a zvyšok sa rozpustil v NaOH (1 ml, 1,0 mol/l) počas 24 hodín pri teplote miestnosti. Absorbancia 1e sa merala pri 475 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek (Tecan Trading AG). 1e experimenty sa uskutočnili paralelne s 3 replikátmi. 1e IC50 sa stanovilo pomocou softvéru GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, Kalifornia) a ako pozitívna kontrola sa použil arbutín (IC50 =15,6 ul).

2.4.3. Stanovenie tyrozinázovej aktivity.

Supernatant bunkovej kultúry sa odstránil a zvyšok sa rozpustil v Tritonx{0}} (90 ul) atyrozináza(10 µL, 1,0 mg/ml, Sigma, T3824 25ku). Po zmiešaní bola zmes inkubovaná pri 37 stupňoch počas 30 minút. Absorbancia le sa merala pri 475 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Tecan Trading AG). 1eexperimenty boli vykonané paralelne 3-krát. 1e IC50 sa stanovilo pomocou softvéru GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, Kalifornia) a ako pozitívna kontrola sa použil arbutín (IC50 =15,6 ul).

2.5. Extrakcia a izolácia. Etylacetátový extrakt sa rozpustil v metanole a kolóna sa naplnila silikagélom 200 až 300 mesh, ktorý sa ekvilibroval petroléterom. 1en, gradientová elúcia pozostávajúca z petroléteru a etylacetátu v pomeroch 2:1, 1:1 a 1:2; etylacetát; etylacetát a metanol v pomeroch 2 : 1, 1 : 1 a 1 : 2; a metanol sa použil v spojení s TLC na získanie zlúčenín A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) a E (6,1 g).

A sa oddelila polyamidovou stĺpcovou chromatografiou s použitím dichlórmetánu a metanolu v pomeroch 2 : 1, 1 : 1 a 1 : 2 ako elučného rozpúšťadla. Eluát sa monitoroval pomocou TLC. Škvrny s rovnakým retenčným faktorom (rf) sa spojili a získali sa A1 a A2. 1en, A1 sa pripravil pomocou TLC s použitím dichlórmetánu a metanolu v pomere 1:1 ako vyvíjacieho činidla a niekoľkokrát sa čistil na gélovej kolóne. Nakoniec sa získala zlúčenina 1 (17 mg) a zlúčenina 2 (27 mg). A2 sa čistil pomocou stĺpcovej chromatografie na silikagéli s použitím dichlórmetánu a metanolu ako eluentu v pomeroch 1 : 1 a 1 : 2. Získala sa zlúčenina 3 (11 mg), zlúčenina 4 (12 mg) a zlúčenina 5 (23 mg). B bol oddelený strednotlakovou chromatografiou C18 s reverznou fázou (RP-C18) s použitím metanolu a vody v gradientovej elúcii nasledovne: 0 percent, 10 percent, 15 percent, 20 percent, 25 percent, 30 percent, 35 percent, 40 percent, 50 percent, 75 percent, 90 percent a 100 percent. le prietoková rýchlosť bola 10 ml.min-1. 1e prietokové frakcie s rovnakou rf boli spojené a boli získané B1 a B2. B1 sa opakovane čistil na gélovej kolóne s metanolom ako elučným rozpúšťadlom. Zlúčeniny (24 mg), 7 (21 mg) a 8 (18 mg) sa získali po opakovanej elúcii. B2 sa čistil pomocou gélovej kolóny a metanolu a získala sa zlúčenina 9 (11 mg). C sa oddelil pomocou RP-C18 a eluoval sa metanolom a vodou s prietokovou rýchlosťou 10 ml.min-1. 1e prietokové frakcie s rovnakým rf sa spojili a získali sa C1, C2 a C3. C1 sa pripravil na gélovej kolóne a eluoval sa metanolom a získala sa zlúčenina 10 (13 mg). C2 sa oddelil na silikagélovej kolóne a eluoval sa etylacetátom a metanolom s gradientovou elúciou v pomeroch 2 : 1, 1 : 1 a 1 : 2. C2 sa čistil preparatívnou extrakciou v kvapalnej fáze a zlúčeniny 11 (15 mg) a 12 (14 mg). C3 sa oddelil pomocou polyamidovej kolóny, eluoval sa metanolom a vodou a čistil sa pomocou HPLC. Získali sa zlúčeniny 13 (34 mg), 14 (42 mg) a 15 (38 mg). D sa oddelil pomocou RP-C18 a eluoval sa metanolom a vodou. Prietok 1e bol 10 ml.min-1. Zlúčeniny 16 (36 mg), 17 (19 mg) a 18 (37 mg) sa získali pomocou HPLC. Zlúčeniny 19 (29 mg) a 20 (34 mg) sa získali gradientovou elúciou s použitím etylacetátu a metanolu v pomeroch 1 : 1 a 1 : 2, potom 100 percentným metanolom na silikagélovej kolóne.

herba epimedium sagittatum na koži

3. Výsledky a diskusia

3.1. Stanovenie aktívnych extraktov (E1–E11).

Vypočítala sa optimálna koncentrácia (konkrétne C1) každého extraktu a je uvedená v tabuľke 1. Experiment s antioxidantmi ukazuje, že všetky extrakty majú antioxidačný opravný účinok, ale v porovnaní s VC je antioxidačný účinok každej skupiny slabý. Antioxidačná aktivita E1, E3, E4, E7 a E11 klesala so zvyšujúcou sa koncentráciou, ako je znázornené na obrázku 1. Test inhibície melanínu ukázal, že všetky polárne zložky v buničine Trichosanthes kirilowii inhibovali syntézu melanínu. Najmä miera inhibície melanínu bola výrazne vyššia pre E2, E3 a E4 ako pre pozitívnu kontrolu arbutínu, ako je znázornené na obrázku 2. 1e výsledkytyrozinázaaktivity ukazujú, že všetky polárne zložky v dužine Trichosanthes kirilowii inhibovali aktivitu tyrozinázy a trend inhibície bol podobný ako pri inhibícii melanínu. le inhibícia tyrozinázovej aktivity bola významne vyššia pre E2, E3, E4 a E8 ako u pozitívnej kontroly. Vo všeobecnosti majú extrakty z petroléteru nízky inhibičný účinok na tyrozinázu. Extrakty z etylacetátu majú vysoký inhibičný účinok na tyrozinázu, najmä polárne zložky z etylacetátu. 1e extrakty z n-butanolu majú tiež vysoký inhibičný účinok na tyrozinázu, ako je znázornené na obrázku 3.

3.2. Izolácia a identifikácia komponentov monoméru.

20 zlúčenín sa separovalo silikagélovými a ODS chromatogramovými kolónami, ako aj preparatívnou HPLC. Na základe analýzy údajov NMR a MS boli objasnené ich štruktúry. 20 zlúčenín je uvedených v tabuľke 2 a špecifické analytické údaje monomérov sú uvedené v prílohe 1.

3.3. Validačná analýza účinných zlúčenín

3.3.1. Validačná analýza antioxidačných zlúčenín.

E1, E2, E3, E4 a E5 majú antioxidačné účinky. 1e hlavné zlúčeniny izolované z vyššie uvedených zložiek bolidrechslerol-B (zlúčenina 9), cyklohexanol 3-palmitát (zlúčenina 10), 5-acetoxymetyl-2-furaldehyd (zlúčenina 11), 5-hydroxymetylfurfural ( zlúčenina 12), diosmetín (zlúčenina 13), apigenín (zlúčenina 14), chryzoberyl (zlúčenina 15), luteolín (zlúčenina 16), 4′-hydroxy-scutellarin (zlúčenina 17), kvercetín (zlúčenina 18), 3′, {{ Hlavnými zlúčeninami boli glykozidy, čo naznačuje, že glykozidy majú dobré antioxidačné účinky. Fenolové kyseliny, ako napríklad 5-acetoxymetyl-2-furaldehyd (zlúčenina 11), 5-hydroxymetylfurfural (zlúčenina 12), diosmetín (zlúčenina 13), apigenín (zlúčenina 14), chryzoberyl (zlúčenina 15) ,luteolín (zlúčenina 16), 4′-hydroxyscutellarin (zlúčenina 17), kvercetín (zlúčenina 18) a 3′,5-dihydroxy-7-(-Dglukopyranozyloxy)-4′-metoxyflavón, majú tiež dobré antioxidačné aktivity vďaka fenolovej hydroxylovej skupine a nenasýteným dvojitým väzbám [26, 27]. 1e výsledky sú znázornené na obrázku 4.

Obrázok 4: Miera prežitia buniek (v percentách) antioxidačného experimentu rôznych zlúčenín z extraktov Trichosanthes

3.3.2. Validačná analýza zlúčenín inhibujúcich melanín.

E11, E12, E13, E16, E17 a E18 majú dobré inhibičné účinky na syntézu melanínu. Hlavné zlúčeniny izolované z vyššie uvedených zložiek sú uvedené v tabuľke 2. Podľa metódy v časti 2.4.2 sa stanovil účinok každej zlúčeniny na syntézu melanínu. Každá zlúčenina bola hodnotená pri nasledujúcich koncentráciách: 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 400 ug/ml, 200 ug/ml a 100 ug/ml. Každé meranie sa uskutočnilo trojmo a vypočítala sa miera inhibície syntézy melanínu.

Protokatechuát (zlúčenina 5), ​​5-acetoxymetyl-2-furaldehyd (zlúčenina 11), 5-hydroxymetylfurfural (zlúčenina 12), diosmetín (zlúčenina 13), p-hydroxybenzaldehyd (zlúčenina 1), kyselina salicylová (zlúčenina 2),kyselina vanilka (zlúčenina 3), kyselina izovanilová (zlúčenina 4), kyselina trans-škoricová (zlúčenina 6), 4-kyselina kumarová (zlúčenina 7), apigenín (zlúčenina 14), chryzoberyl (zlúčenina 15) ), luteolín (zlúčenina 16), 4′-hydroxyscutellarin (zlúčenina 17), kvercetín (zlúčenina 18), 3′,5-dihydroxy-7-(-D-glukopyranozyloxy)-4′ -metoxyflavón (zlúčenina 19), ofloxacín-7-O- -D-glukozid (zlúčenina 20) môže inhibovať produkciu melanínu [28]. Najmä kyselina vanilka (zlúčenina 3), kyselina izovanilová (zlúčenina 4), protokatechuát (zlúčenina 5), ​​kyselina transškoricová (zlúčenina 6) a kyselina 4-kumarová (zlúčenina 7) majú vysokú inhibíciu melanínu. 1e výsledky sú znázornené na obrázku 5.

3.3.3. Overenie a analýza zlúčenín inhibujúcich aktivitu tyrozinázy.

E2, E3, E4, E7, E8 a E9 majú dobré inhibičné účinky natyrozinázačinnosť. Hlavné zlúčeniny izolované z vyššie uvedených zložiek sú uvedené v tabuľke 2. Podľa metódy uvedenej v časti 2.4.3 sa ako kontrola použil arbutín a koncentrácia zlúčeniny bola 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 400 ug/ml 200 ug/ml a 100 ug/ml. Každé meranie sa uskutočnilo 5-krát a vypočítala sa miera inhibície tyrozinázy. 1e výsledky sú znázornené na obrázku 6.

Výsledky ukazujú, že diosmetín (zlúčenina 13), apigenín (zlúčenina 14), chryzoberyl (zlúčenina 15), luteolín (zlúčenina 16), 4'-hydroxyscutellarin (zlúčenina 17), kvercetín (zlúčenina 18), 3′, {{10} }dihydroxy-7-(-D-glukopyranozyloxy)-4′-metoxyflavón (zlúčenina 19), ciprofloxacín-7-O- -D-glukozid (zlúčenina 20), p-hydroxybenzaldehyd (zlúčenina 1), kyselina salicylová (zlúčenina 2), kyselina vanilová (zlúčenina 3), kyselina izovanilová (zlúčenina 4), protokatechuát (zlúčenina 5), ​​kyselina transškoricová (zlúčenina 6), kyselina 4-kumarová (zlúčenina 7) ) a kyselina trans-ferulová (zlúčenina 8) majú všetky zrejmétyrozinázainhibičné aktivity.

Rastlina Cistanche inhibuje aktivitu tyrozinázy.

Kliknite na obrázok a získajte ďalšie podrobnosti.

Hydroxylom substituované zlúčeniny na benzénovom kruhu, ako je p-hydroxybenzaldehyd (zlúčenina 1), kyselina salicylová (zlúčenina 2), kyselina vanilová (zlúčenina 3), kyselina izovanilová (zlúčenina 4), protokatechuát (zlúčenina 5), ​​kyselina trans-škoricová ( zlúčenina 6), 4-kyselina kumarová (zlúčenina 7), kyselina trans-ferulová (zlúčenina 8) a flavonoidy vykazovali vysokú inhibíciu tyrozinázy a miera inhibície para-substituovaných zlúčenín bola výrazne vyššia ako u orto-substituovaných zlúčenín . Napríklad inhibičná aktivita p-hydroxybenzaldehydu bola signifikantne vyššia ako inhibičná aktivita kyseliny salicylovej a inhibičná aktivita kyseliny vanilovej bola signifikantne vyššia ako inhibičná aktivita kyseliny ovanilovej. Okrem toho inhibičná aktivita p-hydroxybenzaldehydu bola významne vyššia ako inhibičná aktivita kyseliny salicylovej, kyseliny vanilovej, kyseliny izovanilovej a protokatechuátu. Dôvodom môže byť, že nukleofilné skupiny okolo aktívneho centratyrozináza, ako sú –SH, –NH2 a –OH, zaberajú priestor okolo aktívneho centra a tým zabraňujú tyrozínu v útoku na aktívne centrum. Nakoniec bola inhibovaná syntéza melanínu [28]. Inhibičná aktivita zlúčenín obsahujúcich o-dihydroxyskupinu bola silnejšia ako u para-hydroxyzlúčenín a inhibičná aktivita protokatechuátu bola významne vyššia ako u kyseliny vanilínovej. 1e vyššie uvedené javy existujú aj vo flavonoidoch. Inhibičná miera flavonoidov obsahujúcich 7 a 4′ hydroxylové skupiny bola významne vyššia ako pri nahradení 7 a 4′ hydroxylových skupín. Napríklad inhibičná aktivita chryzoberylu bola výrazne vyššia ako aktivita diosmetínu, zatiaľ čo inhibičná aktivita diosmetínu bola vyššia ako aktivita 3′,5-dihydroxy-7-(-D-glukopyranozyloxy)-4 ′- metoxyflavón a ciprofloxacín-7-O- -D-glukozid. Inhibičná miera flavonoidov obsahujúcich 3-hydroxyskupinu bola výrazne vyššia ako u zlúčenín bez 3-hydroxyskupiny alebo ak bola 3-hydroxyskupina nahradená. Napríklad inhibičná aktivita kvercetínu bola signifikantne vyššia ako aktivita 4'-hydroxyscutellarinu, ale inhibičná aktivita 4'-hydroxyscutellarinu bola vyššia ako aktivita kvercetínu{28}}glukozidu. Okrem toho je inhibičná aktivita koellinu vyššia ako aktivita apigenínu, ale nižšia ako aktivita luteolínu. Navrhuje sa, že substituenty B-kruhu, najmä hydroxylová skupina, môžu zvýšiťtyrozinázainhibičnú aktivitu a ortodihydroxyskupina B-kruhu mala vyššiu inhibičnú aktivitu [29].