Antioxidačné, anti-aging a orgánové ochranné účinky celkových saponínov z Cistanche

Záver: TSAT je vysoko kvalitný prírodný produkt s antioxidačnými vlastnosťami a vlastnosťami proti starnutiu, ktorý môže zmierniť poškodenie starnutia spôsobené D-gal u potkanov.

Kľúčové slová:Celkové saponíny Cistanche, D-galaktóza, antioxidant,proti starnutiu

Kliknite sem a získajte doplnky Cistanche proti starnutiu

Úvod

Od 21. storočia, s globálnym trendom starnutia a zlepšovaním životnej úrovne na celom svete, sa zdravotné problémy spôsobené starnutím a chorobami súvisiacimi so starnutím dostávajú do popredia.1 Ako si teda udržať zdravie starších ľudí a oddialiť Výskyt starnutia a chorôb súvisiacich so starnutím sa stal populárnou témou výskumu. Starnutie je nezvratný a komplexný degeneratívny fyziologický proces, ktorý sa vyskytuje vo všetkých častiach tela a vedie k štrukturálnemu a funkčnému zhoršovaniu tkanív a orgánov a zvyšuje riziko rôznych chronických ochorení, ako je hypertenzia, cukrovka, neurodegeneratívne ochorenia a kožná melanóza. .2 Viaceré správy ukázali, že teória voľných radikálov starnutia, jedna z najpopulárnejších teórií, môže vysvetliť poškodenie organizmu spôsobené procesom starnutia.3 Pri aeróbnom metabolizme sa v bunkách vytvárajú reaktívne formy kyslíka (ROS). vrátane singletového kyslíka (1 O2), superoxidových aniónov (•O2-), hydroxylových radikálov (HO•) a peroxidu vodíka (H2O2).4,5 Akonáhle sú tieto voľné radikály, ktoré obsahujú nepárové a vysoko reaktívne elektróny, sú produkované v nadbytku, vedú priamo k oxidačnému stresu a prozápalovým reakciám, po ktorých nasleduje redoxná nerovnováha vedúca k peroxidácii proteínov a lipidov, ako aj k poškodeniu mitochondrií a DNA, čo v konečnom dôsledku vedie k zmene funkcie buniek a tkanív a patologickým stavom, ktoré urýchľujú starnutie .6,7 Je zaujímavé, že v ľudskom/cicavcovom systéme existujú prirodzené endogénne antioxidačné systémy, vrátane tých, ktoré zahŕňajú SOD, CAT a GSH-Px, ako aj neenzymatické antioxidanty, ako je kyselina askorbová a karotenoidy, navrhnuté tak, aby udržiavali správnu rovnováhu medzi voľnými radikálmi. a antioxidanty.8,9 Napriek tomu antioxidačný obranný systém nie je dostatočný na to, aby úplne zabránil oxidačnému poškodeniu spôsobenému prebytkom voľných radikálov a suplementácia antioxidantmi môže aspoň znížiť rozsah starnutia a súvisiaceho oxidačného poškodenia.10 V porovnaní s prírodnými antioxidantmi, syntetické bolo preukázané, že antioxidanty (napr. BHT a BHA) pri dlhodobom užívaní spôsobujú endokrinné poruchy, poruchy reprodukcie a dokonca karcinogenézu.11,12 Preto je hľadanie prirodzených, bezpečných a účinných lapačov voľných radikálov veľmi dôležité pre ľudské zdravie. ochranu.

Cistanche je rastlinný druh rovnakého rodu ako Aralia elata (Miq.) Seem.13 Je široko rozšírený v pohorí Qinba v západnej Číne a je to liečivá a jedlá rastlina. Extrakt z kôry koreňa cistanche sa v Číne dlho používa ako ľudový liek na liečbu cukrovky a jeho hlavnou účinnou látkou je triterpén saponín.14 Preukázalo sa, že má antioxidačné, antihyperglykemické a antihyperlipidemické účinky.14–16 Mnohé štúdie preukázali že triterpénové saponíny ako asiatikozid B, madecassoside a parkside A môžu reagovať s voľnými radikálmi a zabrániť ďalšiemu rozvoju reťazových reakcií voľných radikálov, čím majú antioxidačné účinky.17,18 Predchádzajúce správy popisovali, že TSAT vykazoval lepšiu aktivitu zachytávania DPPH radikálov ako jeden saponíny, ako aj dobrú antioxidačnú kapacitu proti peroxidácii lipidov v mikrozómoch pečene potkanov a ukázalo sa, že má lepšie antioxidačné účinky ako ženšen, schizandra a iné saponíny.14,15 Okrem toho TSAT tiež zmiernil poškodenie pečene vyvolané D-gal pri starnutí potkanom prostredníctvom svojho antioxidačného účinku.19 Ďalšia štúdia vzťahu medzi štruktúrou a účinkom naznačila, že štrukturálne rozdiely, ako je kategória a sekvencia oligosacharidového reťazca na C-3 v takýchto saponínoch, hrajú dôležitú úlohu v súvislosti s diabetes mellitus antioxidačné a antiglykačné aktivity.20

D-gal je bežne používaný experimentálny induktor starnutia. Čoraz viac dôkazov naznačuje, že pri dlhodobej stimulácii D-gal možno pozorovať fenotypy súvisiace so starnutím, ako je nadmerná tvorba voľných radikálov, kognitívna dysfunkcia, znížená imunitná odpoveď a poškodenie orgánov.21 Behaviorálne podávanie D-gal vedie k deficitom v a rozpoznávacia pamäť u potkanov, čo dokazuje slabý výkon, pokiaľ ide o ťažkosti pri hľadaní cieľových platforiem a znížený počet prechodov cez cieľové platformy v experimente s Morrisovým vodným bludiskom.22 Preto sa na štúdium starnutia organizmu použila chronická stimulácia D-gal a strata pamäti súvisiaca so starnutím, redoxná nerovnováha a poškodenie orgánov.

Na základe predchádzajúcich štúdií o biologickej aktivite TSAT existuje dôvod domnievať sa, že táto liečivá a diétna rastlina má značný potenciál na uplatnenie v oblasti anti-agingu. Existuje však iba jedna štúdia o zachytávaní voľných radikálov in vitro týmto extraktom triterpenoidného saponínu a chýbajú ďalšie fyziologicky relevantné charakteristiky zachytávania voľných radikálov. Okrem toho sú poznatky o ochranných účinkoch TSAT proti strate pamäti, redoxnej nerovnováhe a poraneniu orgánov v modeli subakútneho starnutia vyvolaného D-gal obmedzené. Preto táto štúdia upevnila antioxidačné vlastnosti TSAT in vitro vychytávaním DPPH, ABTS, HO•, •O2- a inhibíciou aktivity tyrozinázy. Okrem toho boli vyhodnotené behaviorálne experimenty, meranie parametrov oxidačného stresu a histopatologické stavy hlavných orgánov u potkanov, aby poskytli ďalšie informácie o schopnosti TSAT zlepšiť subakútne oxidačné poškodenie a poškodenie starnutím vyvolané D-gal, čím sa upevnili jeho predpokladané farmakologické vlastnosti.

Materiály a metódy

Koreňová kôra Cistanche bola zozbieraná z pohoria Qinba, provincia Shaanxi, Čína a botanicky bola identifikovaná Dr. Jitao Wangom (Shaanxi University of Chinese Medicine). Vzor poukážky (SUCM, č. 20201003) bol uložený v Herbári univerzity čínskej medicíny Shaanxi. Tarasaponín IV

DPPH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ABTS (Maclin Biochemical Co., Ltd, Shanghai, Čína), hubová tyrozináza (Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, Čína), L{{1} },4-dihydroxyfenylalanín (L-DOPA) a D-gal (Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, Čína). Superoxidový anión (číslo položky: A052-1-1), voľný radikál hydroxyl (číslo položky: A018-1-1), BCA (číslo položky: A045-4-2), SOD (číslo položky: A{{ 8}}), GSH-Px (číslo položky: A005-1-1), CAT (číslo položky: A007-1-1), MDA (číslo položky: A003-1-2), T-AOC ( Číslo položky: A015-2-1), AST (číslo položky: C010-2-1) a ALT (číslo položky: C009-2-1) testovacie súpravy boli získané od Nanjing JianCheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína) . Všetky použité chemikálie a ďalšie činidlá boli analytickej kvality.

Kôra koreňa cistanche sa premyla dvakrát destilovanou vodou, vysušila a rozdrvila pri 60 stupňoch. Pred experimentom bol prášok umiestnený na chladnom a suchom mieste. Prášok (3 kg) sa trikrát extrahoval 70 percentným etanolom pod spätným chladičom. Roztoky sa spojili a supernatant sa získal vysokorýchlostnou centrifugáciou a filtráciou. Supernatant bol purifikovaný nanesením do HPD300 makroporéznej živicovej kolóny a potom elúciou 70 percentným etanolom. Roztok, ktorý sa eluoval 70 % etanolom, sa odparil, čím sa získal zvyšok (356 g) po odstránení rozpúšťadla vo vákuu. Výťažok TSAT bol 11,87 percent (w/w) a bol uchovaný v chladničke na ďalšie použitie.

grafický stĺpec (4,6 ID × 25 0 mm). Mobilná fáza pozostávala z acetonitrilu (rozpúšťadlo A) a 0,1 % vodného roztoku kyseliny fosforečnej (V/V) (rozpúšťadlo B). Gradientový program bol nasledujúci: 0–10 min, 5–20 percent A; 10–25 min 20–28 percent A; 25–35 min, 28–33 percent A; 35–45 min, 33–38 percent A; 45–55 min, 38–46 percent A; 55 – 60 min, 46 – 60 percent A; 60 – 70 min. 60–75 percent A; 70 – 80 min, 75 – 45 percent A; 80–90 minút, 45–5 percent A. Prevádzkové podmienky prístroja boli teplota 30 stupňov a prietok 0,8 ml/min. Objem nástreku štandardov a vzoriek bol 10 μl. Detekčná vlnová dĺžka je 203 nm. Pred injekciou všetky vzorky prešli cez 0,22 μm filter. Po zhode so štandardom je vrchol určený retenčným časom. Na kvantifikáciu sa použila lineárna kalibračná krivka štandardu.

Antioxidačná aktivita in vitro

Test DPPH Test DPPH bol mierne upravený oproti predchádzajúcej správe.23 Zmes bezvodého etanolu (100 μl), roztoku DPPH (100 μl, 0,2 mM) a vzorky (100 μl, 0,01 – 1 mg/l) sa dôkladne pretrepal a uchovával (25 stupňov, 30 minút) v tme. VC sa použil ako pozitívna kontrola. Merala sa absorbancia (517 nm). Rádio DPPH

Rýchlosť zachytávania kalórií sa vypočítala takto:

kde A0 predstavuje absorbanciu negatívnej kontroly (DPPH plus absolútny etanol); A1 predstavuje testovací systém obsahujúci vzorku (DPPH plus TSAT); a A2 je absorbancia slepého pokusu (TSAT plus absolútny etanol). Vypočítala sa hodnota koncentrácie 50 percent inhibície (IC50) rýchlosti zachytávania voľných radikálov DPPH, ktorá predstavuje antioxidačnú kapacitu TSAT. Všetky operácie sa vykonávajú paralelne trikrát.

ABTS plus test ABTS bol stanovený pomocou metódy Rafiquea et al s miernymi modifikáciami.24 Najprv sa pripravila séria TSAT (0.01–1 mg/ml) roztokov. Bol pripravený ABTS roztok 7 mM a K2S208 roztok 2,45 mM. Po zmiešaní v rovnakom objeme sa ABTS plus získal reakciou (12–16 hodín) v tme. Pripravený ABTS plus sa zriedil dvakrát destilovanou vodou na absorbanciu 0,7 ± 0,05 pri 734 nm. Potom zmes 180 ul zriedeného roztoku ABTS plus a 20 ul vzorky reagovala (25 stupňov, 10 minút) v tme. VC sa použil ako pozitívna kontrola. Merala sa absorbancia (734 nm). ABTS plus vyplachovacia kapacita sa vypočítala podľa nasledujúceho vzorca:

kde A0 predstavuje absorbanciu negatívnej kontroly (ABTS plus dvakrát destilovaná voda); A1 predstavuje testovací systém obsahujúci vzorku (ABTS plus plus TSAT); a A2 je absorbancia slepého pokusu (TSAT plus dvakrát destilovaná voda). Potom sa vypočítala hodnota IC50 ABTS plus rýchlosť zachytávania. Všetky operácie boli vykonané paralelne trikrát.

Stanovenie inhibičnej aktivity tyrozinázy húb Inhibičná aktivita tyrozinázy bola stanovená podľa mierne vylepšenej verzie metódy, ktorú predtým opísali Morais et al.25 Séria 50 μl TSAT (0.01–1 mg/ml, v 50 % DMSO) roztoky sa pridali do reakčného systému obsahujúceho 100 ul PBS pufra (0,1 M, pH 6,8) a 50 ul tyrozinázy (100 U/ml), v danom poradí, a reagovali pri 25 stupňoch počas 15 minút. . Potom sa do reakčného systému pridalo 50 ul L-DOPA (3,5 mM) roztoku a inkubovalo sa pri 37 stupňoch počas 10 minút. Stanovila sa absorbancia (475 nm). VC sa použil ako pozitívna kontrola. Vypočítala sa inhibičná aktivita iof TSATpodľa nasledujúceho vzorca:

označujú tyrozinázovú inhibičnú aktivitu TSAT. Všetky operácie boli vykonané paralelne trikrát.