Apikálny strihový stres Zvýšený transport organických katiónov v ľudských OCT2/MATE1-transfekovaných Madin-Darbyho psích obličkových bunkách zahŕňa ciliárne snímanie

Pre viac informácií:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz a Shuvo Roy

Katedry bioinžinierstva a terapeutických vied (AJ, PS, DLK, SR) a pediatrie (PRB),

Kalifornská univerzita San Francisco (UCSF), San Francisco, Kalifornia;

a Katedra medicíny, Divízia nefrológie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSTRAKT

Aktívna doprava podľaobličkovéproximálne tubuly zohrávajú významnú úlohu pri dispozícií liekov. Počas vývoja lieku sa odhady oobličkovévylučovanie sú nevyhnutné na stanovenie dávky. Obličkové bioreaktory, ktoré reprodukujú fyziologických bratrancov obličiek, ako je šmykové napätie vyvolané prietokom, môžu lepšie predpovedať správanie liečiva in vivo ako súčasné modely in vitro. V tejto štúdii sme skúmali úlohu šmykového napätia na aktívny transport 4-(4-(dimetylamino)-styryl)-N-metylpyridíniumjodidu (ASP plus) psom Madin-Darbyobličkybunkyexogénne exprimujúce ľudské transportéry organických katiónov transportér organického katiónu 2 (OCT2) a proteín 1 (MATE1) vytláčaný viacerými liečivami a toxínmi. Bunky kultivované na paralelnej platni pod kontinuálnou perfúziou média vytvorili tesnú monovrstvu s vysokou bariérou pre inulín. V reakcii na zvyšujúce sa úrovne šmykového napätia (0.2-2 dyn/cm) bunky vykazovali zodpovedajúce zvýšenie transportu ASP plus , pričom dosiahli maximálne 4.{7}}násobné zvýšenie pri 2. dyn/cm² v porovnaní s bunkami kultivovanými za statických podmienok. Tento transport bol inhibovaný imipramínom, čo naznačuje, že aktívny transport bol prítomný v podmienkach šmykového napätia. Bunky vystavené šmykovému namáhaniu 2 dyny/cm² tiež vykazovali zvýšenie expresie RNA transfekovaných ľudí a endogénneho OCT2(3.7- a 20-násobne). Odstránenie riasiniek síranom amónnym eliminovalo účinky šmyku na transport ASP plus pri 0,5 dyn/cm² bez vplyvu na transport ASP plus za statických podmienok. Tieto výsledky naznačujú, že šmykové napätie ovplyvňuje aktívny transport organických katiónov vobličkovérúrkovýepitelových buniek spôsobom závislým od riasiniek.

Cistanche je dobrý na funkciu obličiek

Úvod

Napriek veľkému pokroku v predklinických metódach výberu optimálnych kandidátov na lieky zostáva vývoj liekov dlhým a nákladným procesom, ktorý má veľmi nízky výťažok nových molekulárnych entít predávaných na trhu (Watkins, 2011). Hlavným nedostatkom predklinických modelov je neschopnosť predpovedať klírens a toxicitu u ľudí. Približne 30 percent liekov, ktoré sú úspešné v predklinických štúdiách, zlyhá u ľudí v dôsledku neočakávaných hodnôt klírensu alebo toxicity (Kola a Landis, 2004).

Oblička je obzvlášť dôležitým cieľom pre modelovanie bunkových kultúr in vitro, pretože je zodpovedná za elimináciu viac ako tretiny všetkých liekov a väčšiny metabolitov (Morrissey et al., 2013). Theobličkovéproximálny tubul je dôležitý pre testovanie liečiv počas vývoja, pretože vykonáva väčšinu aktívneho transportu kandidátnych liečiv a je obzvlášť citlivý na toxické poškodenie (Giacominiet al., 2010). Theobličkovétubuluje monovrstva epitelových buniek s filtrátom prúdiacim cez apikálny povrch. Pod tubulárnym epitelom sa nachádza bazálna membrána a priľahlé peritubulárne kapiláry umožňujú reabsorpciu vody a salutov. Mikroprostredie proximálneho tubulu, najmä šmykové napätie tekutiny a apikobazálne onkotické gradienty, nie je úplne reprodukované konvenčnými technikami bunkovej kultúry. Bioreaktory epitelových buniek, ktoré zachytávajú výraznú fyziológiu in vivo, môžu zlepšiť presnosť predpovedí klírensu a toxicity odvodených z in vitro testov (Pfaller a Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Rastúce dôkazy naznačujú, že morfológia a funkčnosť buniek proximálneho tubulu sa môže meniť v závislosti od rastového prostredia, ako je pórovitosť povrchu rastu, vystavenie tekutine na oboch stranách a/alebo šmykové napätie tekutiny. Predchádzajúca práca od Essiga a Friedlandera (2003), ako aj z nášho laboratória (Ferrell et al. 2010), preukázala, že tubulárnym prietokom tekutiny indukované preskupenie v apikálnom aktínovom cytoskelete buniek proximálneho tubulu (Ferrell et al., 2010) . Následne niekoľko štúdií preukázalo, že šmykové napätie ovplyvňuje hladiny expresie a lokalizáciu viacnásobných absorpcií a efluxných transportérov, vrátane sodíkovo-vodíkového antiportéra 3. Na/K-ATPáza, transportéry glukózy, epiteliálny sodíkový kanál a receptory endocytózy, megalín a tubulín (Duan et al., 2010; Raghavan et al., 2014; Jansen et al.. 2016; Ernandez et al., 2018). Iná práca ukázala, že šmykové prúdenie v rúrkovom bioreaktorovom systéme sa orientuje a predlžujeobličkovérúrkovýbunky pozdĺž dráhy toku (Venzac et al. 2018). Dôkazy in vitro naznačujú, že niektoré zmeny v štruktúre cytoskeletu a transportnej funkcii pravdepodobne súvisia s mechanosenzorickou funkciou riasiniek (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014); len málo štúdií však zvažovalo vplyv šmykového napätia na transportéry liečiv v obličkových bunkách. Okrem toho je málo známe o vplyve rôznych šmykových rýchlostí na funkčnosť buniek, najmä pri dlhodobom vystavení šmykovému stresu. Väčšina štúdií zvažovala jedinú mieru šmykového napätia a vykonala len krátkodobé experimenty (1-6 hodín), čo sťažuje rozlíšenie medzi skutočnými účinkami šmyku a reakciou bunkového stresu na náhle zmeny v mikroprostredí (Duan a kol.2010;Jang a kol.2013: Maggiorani a kol.2015).

Tu sa použil mikrofluidný bioreaktor na preskúmanie vplyvu stupňovitých úrovní šmykového napätia naobličkovétransportéry liečiv buniek proximálnych tubulov transportér organického katiónu 2 (OCT2) a proteín 1 na vytláčanie viacerých liečiv a toxínov (MATE1). Ukazujeme, že zvýšenie apikálneho šmykového napätia vedie k zvýšeniu transportu organických katiónov a expresii transportéra a že riasinky sa podieľajú na tejto bunkovej odpovedi na šmykový stres.

Materiály a metódy

Výroba a montáž zariadenia. Už sme publikovali náš návrh bioreaktora s paralelnými platňami, ktorý poskytuje dráhu toku tekutiny s nastaviteľnou výškou cez apikálnu stranu buniek a statickú nádrž na bazálnej strane (Brakeman et al., 2016). Pre tu prezentovanú prácu sme prispôsobili náš predchádzajúci dizajn tak, aby sme vytvorili multiplexné zariadenie so štyrmi samostatnými prietokovými cestami, ktoré umožňujú testovať štyri biologické stavy naraz (obr. 1). Každé zariadenie sa skladá z troch vrstiev: základňa s 5-ml apikálnym zásobníkom, stredná doska na uchytenie vložky Snapwell（Costar, Corning, Corning, NY）s plochou 1,12 cm² a vrchná doska obsahujúca 1-až 2-ml bazolaterálneho rezervoára. Taniere

boli vyrobené z polysulfónu, aby sa umožnila sterilizácia autoklávovaním. Laserom vyrezané silikónové tesnenia s výškou 500- až 1000-um boli vložené medzi každú sadu dosiek na utesnenie priehradiek na tekutiny a na apikálnej strane na definovanie výšky kanála. Bioreaktor bol zostavený pomocou skrutiek. Zásobník média a zachytávač bublín bol zabudovaný v kolóne. Vstupy a výstupy boli pripojené pomocou ostnatých konektorov k silikónovým hadičkám Masterflex LS14 s vnútorným priemerom 1.6- mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Prúdenie tekutiny a tým apikálne šmykové napätie boli nastavené a riadené peristaltickým čerpadlom (Cole Parmer).

Bunková kultúra a tok. MDCK bunky transfekované buď prázdnym vektorom alebo párom vychytávacích a efluxných transportérov (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) poskytol Dr. Martin Fromm (Erlangen, Nemecko) a kultivované v minimálne základné médium s Earlovým vyváženým soľným roztokom (UCSF Cell Culture Facility) s 10 percentami fetálneho bovinného séra (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a 1 percentom penicilín-streptomycínu (UCSF Cell Culture Facility). Päťsto mikrogramov na mililiter hygromycínu (UCSF Cell Culture Facility) a 100 mg/h ml geneticínu (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) sa pridalo do média pre dvojito transfekované bunky. Pre prietokové experimenty boli bunky hOCT2/hMATE1 MDCK boli nanesené na spodnú stranu vložiek Snapwell (Corning) v hustote 300,000 buniek/jamka (250,000 buniek/cm"), pestované za statických podmienok až do konfluencie. a potom umiestnené do bioreaktor. Prietok apikálneho média sa počas 7 dní zvyšoval z 0,1 na 1-6 ml/min, kým sa nedosiahlo požadované šmykové napätie, a potom sa pred experimentom nechal stabilný 72 hodín. Bunky rástli za statických podmienok rovnaký čas ako kontroly .

Imunofluorescencia. Bunky boli fixované 4 percentami paraformaldehydu (Thermo Fisher Scientific), permeabilizované 0,1 percentným Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) a blokované hovädzím sérovým albumínom (Sigma-Aldrich). Následne boli inkubované s 1:50 zriedenou myšacou monoklonálnou protilátkou zonula occludens-1 Alexa 488 (Life Technologies, Carlsbad, CA) alebo primárnou acetylovanou - tubulínovou myšacou monoklonálnou protilátkou (Life Technologies) počas 60 minút. Bunky ošetrené a-tubulínovou protilátkou sa potom inkubovali so sekundárnou 561 anti-myšou kozou protilátkou (Life Technologies) a faloidínom (Thermo Fisher Scientific) na farbenie F-aktínom. Zobrazovanie sa uskutočnilo pomocou spektrálneho konfokálneho mikroskopu Nikon (Tokio, Japonsko) s olejovým objektívom 40x.

Výkon bariéry. Inulín, 5000 Da polymér, je dobre známym markerom rýchlosti glomerulárnej filtrácie a je markerom netesnosti proximálneho tubulu in vivo (Sohtell et al, 1983):

Inulín značený FITC (Sigma-Aldrich) sa pridal do apikálneho média a nechal sa pretiecť cez zariadenia. Vzorky sa odoberali z bazálneho rezervoáru každých 24 hodín a analyzovali sa na obsah inulínu pomocou fluorescenčnej čítačky platní Genios Pro (Tecan, Mannedorf, Švajčiarsko). Bariérová funkcia bunkovej monovrstvy sa vypočítala z hladín inulínu nameraných v apikálnom a bazálnom kompartmente, ako je opísané v rovnici 1. Tu je Capital koncentrácia inulínu v apikálnom kompartmente a C Mal je koncentrácia v bazálnom kompartmente. Únik inulínu sa vypočítal ako koncentrácia v bazálnom (darcovskom) oddelení delená plochou buniek po 24 hodinách.

ASP plus doprava. Transdukované transportné gény boli indukované 10 mM Na-butyrátom (Sigma-Aldrich) 24 hodín pred transportným experimentom, ako už bolo opísané (Konig et al, 2011). Keď to bolo vhodné, bunky sa inkubovali s inhibítorom (500 μM imipramínom alebo 1 mM cimetidínom (Sigma-Aldrich)) na bazálnej strane počas 30 minút, po čom nasledovalo pridanie 25 μM 4-（4-dimetylamino）- styryl-N-metylpyridínium (ASP plus) (Life Technologies) a inkubácia počas 1 hodiny. Vzorky sa odobrali z apikálneho a bazálneho média. Bunky sa potom trikrát premyli ľadovo studeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom a lyžovali sa na meranie ASP plus akumulácie a transportu. Transportné experimenty sa súčasne uskutočňovali na bunkách pod šmykovým napätím a kultivovali sa za statických podmienok. Koncentrácia ASP plus bola kvantifikovaná na Genios Pro fluorescenčnej platničkovej čítačke (Tecan) pri excitačnej vlnovej dĺžke 485 nm a emisnej vlnovej dĺžke 590 nm.

Kvantifikácia bielkovín. Bunky boli lyzované s 1% SDS-10M NaOH lyzačným pufrom za trepania cez noc. Obsah proteínu sa meral pomocou štandardnej súpravy na stanovenie proteínov Pierce BCA (Thermo Fisher). Tam, kde to bolo vhodné, bol obsah proteínu normalizovaný na oblasť rastu buniek.

Expresia RNA. RNA sa extrahovala z buniek pomocou súpravy na extrakciu RNA RNeasy (Qiagen, Hilden, Nemecko) a cDNA sa generovala pomocou súpravy skriptov (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA sa použila na detekciu ľudských a psích OCT2 a MATE1 a psí P-glykoproteín (P-GP) kvantitatívnou reverznou transkriptázou-polymerázovou reťazovou reakciou s použitím Tagmanovho testu a sond (Applied Biosystems) na zariadení Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). Ribozomálny proteín S18 (RS-18) sa použil ako kontrola. Účinok šmykového napätia na expresiu transportéra bol analyzovaný pomocou metódy 4ACt s použitím hladín transportéra vyjadrených relatívne k RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen a Livak,2008). P-GP sa použil ako miera globálnych účinkov šmykového napätia na expresiu transportéra.

Deciliácia. Bunky boli pestované do konfluencie a potom inkubované v neprítomnosti alebo prítomnosti 30 mM síranu amónneho (Fluka AG) počas 24 hodín pred meraním ASP plus transport (Oxergard et al 2009). Prítomnosť riasiniek sa stanovila zobrazením a-tubulínu, ako je už opísané v tomto dokumente.

Štatistiky. Všetky experimenty sa uskutočňovali trojmo s minimálne dvoma technickými replikáciami v rámci každého experimentu. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD a vynesené do grafu ako rámčekové a fúzové grafy. Štatistické analýzy sa uskutočňovali nepárovou jednosmernou alebo dvojcestnou analýzou rozptylu a P-hodnoty<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Výsledky

Bunková morfológia a bariérová funkcia. Nedávna analýza buniek umiestnených pod prúdom od spoločnosti Immunofluo odhalila jednotnú tvorbu monovrstvy s proteínom s tesným spojením, zonula ocludens{1}}, lokalizovaným v tesných spojeniach medzi bunkami za statických aj prietokových podmienok (obr. 2, A–C). Kvantifikácia celkového obsahu bielkovín preukázala až 1,5{4}}násobné zvýšenie obsahu bielkovín na štvorcový centimeter monovrstvy v reakcii na šmykové napätie (obr. 2D). Ďalej sme merali permeabilitu inulínu, markera netesnosti proximálneho tubulu, cez monovrstvu. Zariadenia si zachovali bariérovú výkonnosť 97,9 percenta 6 1,42 percent počas 7 dní kultivácie pri šmykovom napätí až 2 dyny/cm2 (obr. 2E), čo viedlo ku konečnej rýchlosti úniku inulínu na 6. deň { {15}},13–0,69 mg/cm2 za deň.

Vplyv šmykového napätia na transport organických katiónov. Transport ASP plus, autofluorescenčného substrátu OCT2 a MATE1, sa meral počas 1 hodiny pri rôznych úrovniach šmykového napätia（0.2-2 dyn/cm²）. Bunky MDCK exogénne exprimujúce hOCT2 a hMATE1 vykazovali 4.2--násobné zvýšenie ASP plus transport v reakcii na šmykové napätie 2 dynov/cm², čo sa odráža v meraniach bunkovej akumulácie (obr. 3A) a transcelulárneho transportu (obr. 3B). Účinok šmykového napätia na ASP plus akumuláciu alebo transcelulárny transport bol podobný pri šmykovom napätí 0,5 a 2 dyn/cm². Aby sa určilo, či sa zvýšil aktívny transport ASP plus, meral sa transport ASP plus bunkami vystavenými 0,2 dyn/cm šmykového stresu s alebo bez predbežného ošetrenia 500 uM imipramínu, OCT{{20} } a špecifický inhibítor MATE{21}}. ASP plus transport bol inhibovaný imipramínom na 60,3 percent ± 15,8 percent za podmienok šmykového napätia v porovnaní so 47,6 percentami ± 19,7 percent za statických podmienok (obr. 3C).

Na ďalšie pochopenie tohto pozorovania sa meral účinok šmykového stresu na expresiu ľudského OCT2 (transfekovaného), psieho OCT2 (endogénneho) a psieho P-GP (endogénneho) v bunkách vystavených rôznym úrovniam strihu počas 72 hodín po pomalý nárast šmyku počas 7 dní (obr. 4). V porovnaní s bunkami kultivovanými za statických podmienok vykazovali MDCK bunky vystavené strihu zvýšenú expresiu transfekovaného ľudského a endogénneho OCT2 (až 3.7- a 20-násobne), bez významného účinku na expresiu transfekovaného MATE1 alebo endogénneho P-GP.

Úloha Cilie v reakcii na strih. Zobrazovanie ukázalo, že dvojito transfekované MDCK bunky exprimujú riasinky za statických aj prietokových podmienok (obr. 5, A a E). Vystavenie buniek 30 mM síranu amónnemu počas 24 hodín spôsobilo úplnú stratu riasiniek (obr. 5, C a G). Dôležité je, že deciliácia nemala žiadne hrubé účinky na spojenia bunka-membrána, ako sa meralo zobrazením F-aktínu, ktorý ukotvuje proteíny s tesným spojením na spojeniach bunka-membrána v epitelových bunkách (obr. 5.D a HD (Stevenson a Begg. 1994). Hoci na týchto snímkach je určité zhrubnutie farbenia F-aktínu, nebolo to konzistentné zistenie, a preto sme tento efekt nekvantifikovali. Deciliácia nemala žiadny vplyv na transport bunkami kultivovanými za statických podmienok. eliminovali účinky šmykového napätia na ASP plus transport v bunkách vystavených šmyku 0,5 dyna/cm² (obr. 6).

Diskusia

Obličky zohrávajú ústrednú úlohu pri eliminácii liečiv v ľudskom tele. Pri testovaní liečiv in vitro je dôležité presne napodobniť zložitosť fyziológie obličiek, najmä pokiaľ ide o prietok tekutín. Ukázalo sa, že šmykové napätie z prúdenia tekutiny ovplyvňuje bunkovú morfológiu a iónové transportéry in vitro, ale málo je známe o účinkoch na transportéry liečiv (Duan a kol., 2010; Ferrell a kol., 2012; Jansen a kol., 2016) . Okrem toho väčšina predchádzajúcich štúdií merala iba účinok krátkodobého šmyku (1-6 hodín), čo pravdepodobne úplne neizoluje účinky šmykového stresu od iných reakcií bunkového stresu (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015). V týchto štúdiách sme sa zamerali na účinky trvalého (7 dní) šmykového napätia z prúdenia tekutiny na transport liečiva, aby sme lepšie napodobnili trvalé šmykové napätie, ktoré zažívaobličkovérúrkovýbuniek in vivo.

Pochopenie toho, ako transportéry liekov reagujú na trvalé šmykové napätie, môže zlepšiť in vitro predpovede manipulácie s liekmi in vivo obličkami. Presne navrhnuté in vitro modely obličiek môžu štandardizovať predklinické testovanie a znížiť mieru zlyhania lieku.

V tejto práci sa mikrofluidný bioreaktor s paralelnými doskami použil na určenie účinkov trvalého šmykového napätia na transport organických katiónov pomocou OCT2 a MATE1 vobličkovétubulubunkovej línie. Pre tieto štúdie sa zvažovalo niekoľko bunkových línií vrátane ľudských bunkových línií, ako sú ľudské bunky proximálnych tubulov zo skupiny Hopfer (Orosz et al, 2004) a RPTEC (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser a kol., 2008), ale dvojito transfekované bunky hOCT2 / hMATE1 MDCK sa považovali za najvhodnejšiu voľbu pre túto štúdiu z niekoľkých dôvodov. Po prvé, bunky MDCK dôsledne demonštrujú robustné pripojenie k vložkám transwell, čo im umožňuje odolať počiatočnému stresu prúdenia tekutiny. Po druhé, tieto bunky tvoria tesné monovrstvy, čo zabraňuje úniku a je nevyhnutné pre štúdium transcelulárneho transportu markerových substrátov. Nakoniec, exogénna expresia transportérov umožňuje lepšiu detekciu aktívneho transportu a účinku porúch.

Bunky umiestnené pod tokom vytvorili konfluentnú monovrstvu a lokalizovali proteín s pevným spojením na periférii bunky. Tiež si zachovali vysokú bariérovú funkciu meranú permeabilitou inulínu. Schopnosť epitelových buniek vytvárať monovrstvu, ktorá zabraňuje úniku tekutín a bielkovín, je mimoriadne dôležitá pre správnu funkciu tubulu. Tu bol únik cez bunky MDCK minimálny, menej ako 1 ug/cm² za deň a výrazne nižší ako cez ľudské bunky. Už sme predtým ukázali, že monovrstvy ľudských obličkových buniek majú 10-20 ug/cm² za deň únik inulínu (Brakeman et al., 2016), čo podporuje záver, že bunky hOCT2/hMATE1 MDCK vytvorili robustnú monovrstvu.

Transport ASP plus sa významne zvýšil v bunkách hOCT2 / hMATE1 MDCK vystavených rôznym úrovniam šmykového napätia počas 72 hodín v porovnaní so statickými kontrolami. ASP plus je prijímaný OCT2 (SLC22A2) a efluxovaný MATE1 (SLC47A1), dvoma transportérmi organických katiónov, ktoré spolupracujú na uľahčeníobličkovésekrécia bežne používaných liekov, ako je metformín a cisplatina (Biermann a kol. 2006; Wittwer a kol. 2013). Podobné účinky šmykového napätia boli zaznamenané pre transportéry iónov proximálnych tubulov. Zvýšenie vychytávania albumínu, reabsorpcie iónov a expresie a funkcie megalínu a tubulínu bolo hlásené ako odpoveď na zvýšený šmykový stres (Overgaard a kol. 2009; Duan a kol. 2010: Ferrell a kol.. 2012: Raghavan a kol., 2014). Vystavenieobličkovéšmykové napätie buniek proximálnych tubulov je tiež spojené so zníženou apoptózou a rýchlejším zotavením z akútnej toxicity cisplatiny a zvýšenou inhibíciou transportu organických aniónov (Jang et al.2013). Pretože šmykové napätie z prietoku tekutiny je neustále prítomné v proximálnom tubule, tieto zistenia spoločne podporujú použitie fyziologickejších in vitro modelových systémov na predpovedanie renálnej dispozície a toxicity. Je pozoruhodné, že medzi 0,5 a 2.0 dyn/cm² šmykového napätia nie je žiadny významný rozdiel vo funkcii transportéra. Predchádzajúce štúdie Essiga a Friedlandera (2003) zistili, že na vyvolanie zmeny morfológie buniek je potrebná minimálna úroveň šmyku 0,17 dyna/cm2 a ďalšie štúdie merali účinky na fyziológia pri až 1 dyne/cm²（Duan et al.,2010）. Toto je prvá štúdia, ktorá skúma účinky radu vyšších a trvalých hladín šmykového napätia na funkčnosť renálnych transportérov liečiv a je možné, že veľkosť biologického rozdielu medzi šmykovým napätím 0,5 a 2,0 dyn/cm² hodnotená nebola dostatočne veľká na to, aby umožnila identifikáciu rozdielov medzi týmito hladinami šmykového napätia v našich testoch. Aj keď je potrebné ďalšie skúmanie, naše výsledky objasňujú požadované podmienky pre fyziologicky relevantné modely a účinky zvýšených hladín šmykového napätia v dôsledku ochorenia na obličkovú manipuláciu s liekom.

Jedným z obmedzení našich experimentálnych metód je, že sme riešili transport iba pri pH 7,4 pomocou média s pH 7,4 na apikálnej aj bazálnej strane, čo napodobňuje experimentálne metódy opísané skôr pre bunky hOCT2/hMATE1 MDCK (Konig et al..2011). Apikálny až bazálny gradient pH môže ovplyvniť funkciu OCT2 a MATE1 a zvyčajne existuje gradient pH za fyziologických podmienok (Muller et al., 2013). Naše metódy preto obmedzili našu schopnosť hodnotiť interakciu medzi apikálnym a bazálnym pH gradientom a šmykovým napätím na funkciu OCT2 a MATE1. Pretože sme použili konzistentné pH 7,4 vo všetkých experimentálnych podmienkach, je nepravdepodobné, že by tento nedostatok gradientu pH ovplyvnil naše zistenia, ale potenciálne obmedzuje použiteľnosť našich zistení na transport OCT2 a MATE1 v prítomnosti apikálneho až bazálneho gradientu pH.

Prekvapivo sa expresia mRNA transfekovaného ľudského a endogénneho OCT2 zvýšila v bunkách vystavených všetkým úrovniam šmykového stresu v porovnaní so statickými kontrolami. Táto zvýšená regulácia expresie transportéra bola špecifická, bez merateľného účinku na expresiu endogénneho P-GP alebo transfekovaného MATE1. Upregulácia expresie transportéra poskytuje pohľad na mechanizmus za zvýšeným transportom a môže byť výsledkom zvýšenej stability mRNA alebo zvýšenej transkripcie mRNA. Je zaujímavé poznamenať, že transfekované aj endogénne transportéry boli upregulované, čo je neočakávané, pretože transfekovaný OCT2 bol exprimovaný pod cytomegalovírusovým promótorom a nemal by podliehať regulačným mechanizmom endogénnej génovej expresie. Hoci je toto pozorovanie prekvapujúce, nie je bezprecedentné. Bol hlásený podobný účinok na bunky proximálneho tubulu transfekované OAT1 vystavené perfúzii, ale mechanizmus zvýšenej expresie zostáva nejasný (Jansen et al., 2016). V inej štúdii sa zistilo, že signalizácia Nrf2 hrá úlohu pri zvyšovaní endogénnej expresie MATE2-K v reakcii na šmykový stres (Fukuda et al., 2017). Ďalšie skúmanie tejto problematiky je opodstatnené a bude predmetom budúcich vyšetrovaní.

Tiež sme zistili, že zavedenie apikálneho šmykového toku zvýšilo obsah bielkovín na štvorcový centimeter buniek. Tento účinok mal rovnakú veľkosť pre 0,5 a 2 dyn/cm² šmyku, podobný účinku pozorovanému pre expresiu mRNA a transport ASP plus. Existujú určité dôkazy, že šmykové napätie vyvoláva vyššieobličkovéepitelové bunky, čo by viedlo k väčšiemu objemu buniek na štvorcový centimeter, a teda k pravdepodobnému zvýšeniu proteínu na štvorcový centimeter; tento predtým publikovaný jav bol však len malým pozorovaním vo väčšom množstve údajov a nebol kvantifikovaný (Long et al., 2017). Zvýšenie celkového proteínu v bunkách pestovaných v prítomnosti apikálneho šmykového toku môže predstavovať normálny obsah proteínu pre zdravýchobličkovérúrkovýepitelové bunky, ktoré možno dosiahnuť len vystavením buniek apikálnemu šmykovému toku. Preto nižšie hladiny obsahu proteínov v bunkách pestovaných v statickej kultúre môžu predstavovať abnormálny bunkový stav, ktorý by sa mohol klinicky vyskytnúť v situáciách nízkeho apikálneho toku filtrátu, ako je akútne poškodenie obličiek. Tento fenomén si zaslúži ďalšie štúdium.

Cilia sú známe tým, že majú mechanosenzorické úlohy v proximálnom tubule (Raghavan a Weisz, 2016). Preto, aby sa zistilo, či zohrávajú rozhodujúcu úlohu vo zvýšenom transporte sprostredkovanom OCT2 a MATE1-, ktorý je tu uvedený, bol meraný účinok odstránenia mihalníc na funkciu transportéra. Úplná blokáda zvýšenia ASP a transportu závislého od šmyku odstránením riasiniek v našich štúdiách je podobná účinku zistenému v štúdiách Raghavana et al. (2014), ktorí preukázali zvýšenú reguláciu endocytózy závislú od riasiniek v reakcii na prietok tekutín. Síran amónny má pravdepodobne ďalšie necharakteristické účinky na správanie a funkčnosť buniek, ktoré môžu nepriamo ovplyvniť transport rozpustenej látky. Napriek možným účinkom mimo cieľa táto metóda deciliácie testuje úlohu ciliárneho snímania na pohyb organických rozpustených látok sprostredkovaný transportérom. Mechanizmus signalizácie medzi mechanicko-senzorickými proteínmi v mihalniciach a transportérom nie je v súčasnosti známy. Jednou z hypotéz je, že funkcia transportérov organických katiónov sa mení zmeneným transportom iónov. Je známe, že odstránenie riasiniek mení motilitu rozpustenej látky v bunkách proximálneho tubulu, konkrétne znížením Nat/K plus. Lokalizácia membrány ATPázy a modifikácia paracelulárneho transportu (Overgaard et al., 2009). Je možné, že to vedie k zmenám vo funkcii MATE1, antiportéra závislého od H gradientu. Ďalšou hypotézou je, že snímanie šmykového napätia ovplyvňuje expresiu transportérov organických katiónov. Šmykové napätie moduluje funkciu MATE2-K prostredníctvom signalizácie Nrf2 (Fukuda et al., 2017). Iné transportéry organických katiónov môžu reagovať podobne na šmykové napätie, ktoré by sa odstránilo odstránením mechanosenzorických riasiniek. Veľa z toho je neznámych a vyžaduje si ďalšie štúdium. Je zaujímavé, že odstránenie riasiniek nemalo významný vplyv na ASP plus transport bunkami vystavenými 0,2 dyn/cm² šmykového napätia, ale silný účinok sa pozoroval, keď sa šmykové napätie zvýšilo na 0,5 dyn/cm2. To naznačuje, že mihalnice vnímajú prahovú úroveň šmykového napätia; na druhej strane, zmeny signálu mihalníc v expresii a funkcii transportéra sa očakávajú pred merateľnými účinkami na transport. Celkovo závislosť transportu organických katiónov od ciliárneho snímania šmykového napätia poskytuje pohľad na zapojenú mechanosenzorickú signálnu dráhu a minimálnu úroveň stresu, ktorá môže byť potrebná na spustenie silnej reakcie na strih.

V súhrne tieto údaje ukazujú, že šmykové napätie z prúdenia tekutiny má významný vplyv na funkciu a expresiu organického katiónového transportéra v MDCK bunkách. Okrem toho bola zvýšená regulácia transportu organických katiónov závislá od prítomnosti riasiniek. Navrhujeme, aby apikálne šmykové napätie bolo dôležitou súčasťou akéhokoľvek modelovania in vitroobličkovérúrkovýbuniek a je pravdepodobne dôležitou zložkou modelovania renálneho sekrečného klírensu a nefrotoxicity liekov. Špecifický mechanizmus, ktorým signály mechanického stresu zvyšujú aktivitu a expresiu transportéra, je stále nejasný a vyžaduje si ďalšie štúdium.

Referencie

Astashkina A, Mann B a Grainger DW (2012) Kritické hodnotenie modelov bunkových kultúr in vitro pre vysokovýkonný skríning liekov a toxicitu. Pharmacol Ther 134:82-106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E a Ciarimboli G (2006) Charakterizácia regulačných mechanizmov a stavov ľudského transportéra organických katiónov 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521-C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH a Ferrell N (2016) Modulárny mikrofluidný bioreaktor so zlepšenou priepustnosťou na hodnotenie polarizovaných renálnych epitelových buniek. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S a Wang T (2010) Zmeny lokalizácie a expresie membránového transportéra v bunkách proximálnych tubulov myší vyvolané šmykovým stresom. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY a Feraille E (2018) Union nefrektómia a šmykové napätie apikálnej tekutiny znižujú množstvo ENaC v hlavných bunkách zberného kanála. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M a Friedlander G (2003) Tubulárne šmykové napätie a fenotyp renálnych proximálnych tubulárnych buniek. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD a Fissell WH (2010) Mikrofluidný bioreaktor s integrovanými elektródami na meranie transepiteliálneho elektrického odporu (TEER) na hodnotenie renálnych epitelových buniek. Biotechnol Bioeng 107:707-716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT a Fissell WH (2012) Manipulácia s albumínom obličkovými tubulárnymi epitelovými bunkami v mikrofluidnom bioreaktore. Biotechnol Bioeng 109:797-803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT a Fissell WH (2012) Mikrofluidný bioreaktor pre štúdie epitelových buniek pri šmykovom namáhaní tekutín. FASEB J 26:911,3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M a Kawamata Y (2017) Šmykový stres tekutiny stimuluje expresiu MATE2-K prostredníctvom aktivácie dráhy Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM a kol.; International Transporter Consortium (2010) Membránové transportéry vo vývoji liekov. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY a Ingber DE (2013) Proximálny tubul na čipe ľudskej obličky pre transport liečiv a hodnotenie nefrotoxicity. Integr Biol 5:1119-1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF a kol. (2016) Bioinžinierske obličkové tubuly účinne vylučujú uremické toxíny. Sci Rep 6:26715.

Kola I a Landis J (2004) Môže farmaceutický priemysel znížiť mieru opotrebovania? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C a Fromm MF (2011) Dvojito transfekované bunky MDCK exprimujúce ľudské OCT1/MATE1 alebo OCT2/MATE1: determinanty vychytávania a transcelulárnej translokácie organických katiónov. Br J Pharmacol 163:546-555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ a Weisz OA (2017) Apikálna endocytóza proximálneho tubulu je modulovaná šmykovým stresom tekutiny prostredníctvom dráhy závislej od mTOR. Mol Biol Cell 28:2508-2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL a kol. (2015) Zmena organizácie epitelu v ľudských renálnych tubulárnych bunkách vyvolaná šmykovým stresom. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L a Giacomini KM (2013) Renálne transportéry vo vývoji liekov. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503-529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K a Fromm MF (2013) Úloha organického katiónového transportéra OCT2 a proteínov MATE1 a MATE2-K vytláčania viacerých liečiv a toxínov pre transport a liekové interakcie antivírusového lamivudínu. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI a kol. (2004) Rast, imortalizácia a diferenciačný potenciál normálnych dospelých ľudských buniek proximálneho tubulu. In vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A a Yeaman C (2009) Deciliácia je spojená s dramatickou prestavbou spojov epitelových buniek a povrchových domén. Mol Biol Cell 20:102-113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR a Day MJ (2007) Vývoj a aplikácia viacerých interných referenčných (housekeeper) génových testov na presnú normalizáciu štúdií expresie psích génov. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W a Gstraunthaler G (1998) Testovanie nefrotoxicity in vitro--čo vieme a čo potrebujeme vedieť. Environ Health Perspect 106 (Suppl 2): ​​559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD a Weisz OA (2014) Regulácia apikálnej endocytózy v bunkách proximálneho tubulu obličiek sprostredkovaná primárnymi riasinkami závislá od šmykového stresu. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V a Weisz OA (2016) Rozlišovanie úlohy mechanosensory pri regulácii funkcie proximálneho tubulu. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD a Livak KJ (2008) Analýza dát PCR v reálnom čase komparatívnou metódou C(T). Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B a Ulfendahl H (1983) FITC-inulín ako marker obličkových tubulov u potkanov. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR a Begg DA (1994) Účinky cytochalazínu D závislé od koncentrácie na tesné spojenia a aktínové vlákna v epitelových bunkách MDCK. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S a kol. (2018) Vytvorenie malých skúmaviek so zmenami v priemere na štúdium organizácie obličkových buniek. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Vedy o bezpečnosti liekov a prekážka vo vývoji liekov. Clin Pharmacol Ther 89:788-790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J a Grillari-Voglauer R (2008) samotný hTERT imortalizuje epitelové bunky proximálnych tubulov obličiek bez zmeny ich funkčných charakteristík. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y a Giacomini KM (2013) Objav silných, selektívnych inhibítorov transportéra extrúzie viacerých liečiv a toxínov 1 (MATE1, SLC47A1) prostredníctvom profilovania liekov na predpis a výpočtového modelovania. J Med Chem 56:781-795.