Odolnosť starnúcich buniek voči apoptóze je prirodzenou bariérou pre senolýzu indukovanú srdcovými glykozidmi, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Porušenie homeostázy K*/Nat spôsobené ouabaínom vedie k rôznym fyziologickým reakciám v kontrolných a senescentných A549 a END-MSC

Po zistení skutočnosti, že senolytický účinok ouabaínu je závislý od typu bunky, sme sa ďalej pokúsili objasniť, čo môže byť základom odhalených rozdielov v odpovediach hMSC a A549. Na tento účel sme analyzovali starnutie END-MSC a etopozidu vyvolané oxidačným stresom. -indukoval starnutie A549 presnejšie.výhody cynomoriumHlavným molekulárnym mechanizmom účinku rôznych srdcových glykozidov je inhibícia Nat/K plus -ATPázy [44]. Nat/K plus -ATPáza je enzým plazmatickej membrány, ktorý pumpuje sodík von z bunky a zároveň pumpuje draslík do bunky proti koncentračným gradientom. a tým sa podieľajú na udržiavaní homeostázy K plus a Na plus. Preto sme sa pýtali, či môžu existovať nejaké rozdiely v bazálnej a ouabaínom indukovanej iónovej homeostáze medzi kontrolnými a starnúcimi bunkami dvoch typov.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Porucha homeostázy K plus a Na plus spôsobená ouabaínom by mala nakoniec viesť k rozptýleniu potenciálu plazmatickej membrány. Ďalej sme teda použili špecifickú fluorescenčnú sondu DiBAC4 (3) na meranie transmembránového potenciálu neexcitabilných buniek. Zvýšená fluorescencia tohto farbiva odráža depolarizáciu membrány.púštny hyacintV každom testovanom type bunky ouabain vyvolal predvídateľnú depolarizáciu membrány, čo potvrdzuje iónovú nerovnováhu (obr. 10a). Pozoruhodné je, že sme pozorovali porovnateľné úrovne depolarizácie membrány v kontrolných a starnúcich END-MSC, zatiaľ čo starnúca A549 bola charakterizovaná významne viac depolarizovanou membránou v porovnaní s kontrolnými bunkami A549.

Ďalšími dôležitými dôsledkami iónovej deregulácie sú zmeny v mitochondriálnom membránovom potenciáli (MP).

S použitím fluorescenčnej sondy JC-1 sme teda hodnotili MMP v kontrolných a starnúcich bunkách po ošetrení ouabaínom. Malo by sa špecificky zdôrazniť, že starnúce bunky sa bežne vyznačujú zníženou MMP, ktorá odráža nesprávne fungovanie mitochondrií, zmeny v energetickom metabolizme a zvýšené hladiny intracelulárnych reaktívnych foriem kyslíka [45]. Ako sa očakávalo, MMP v senescentných bunkách END-MSC a A549 bola nižšia ako v kontrolných bunkách,

hoci tento pokles neovplyvnil životaschopnosť senescentných buniek (obr. Id, 6a, 10b).metóda extrakcie flavonoidov pdfPodobne ako vyššie uvedené výsledky, ouabain indukoval výraznú depolarizáciu MMP v senescentnom A549 v porovnaní s ich proliferujúcimi náprotivkami, zatiaľ čo vplyv na MMP kontrolných a senescentných END-MSC bol minimálny (obr. 10b). Zhrnutím výsledkov popísaných v tejto časti môžeme konštatovať, že blokovanie Na plus /K plus -ATPázy ouabaínom vedie k dramatickej depolarizácii plazmatickej membrány a poklesu MMP v prípade starnúcej A549, na rozdiel od starnúcej END-MSCS.

Zmeny v mechanizmoch K plus importu sprostredkovávajú ouabainovú rezistenciu starnúcich END-MSC

Na objasnenie mechanizmov sprostredkujúcich zmeny v polarizácii membrány a MMP vyvolané ouabaínom medzi senescentnými A549 a END-MSC sme ďalej použili pokročilý bioinformatický prístup. Cieľom analýzy bolo odhaliť možné transkriptomické znaky sprostredkúvajúce rezistenciu na ouabaín alebo citlivosť starnúcich buniek závislú od bunkového typu. Inými slovami, položili sme otázku: ako sa senescencia END-MSC (bunky rezistentné na ouabain) líši od starnutia A549 (bunky citlivé na ouabain)? Na zodpovedanie tejto otázky sme použili tri nezávislé súbory údajov sekvenovania RNA (RNA-Seq). Prvou bola analýza RNA-Seq

Obr. 6 Validácia etopozidom indukovaného modelu starnutia A549. Senescentné bunky A549 vykazujú stratu proliferácie, b získajú zvýšenú veľkosť buniek, c úroveň autofluorescencie a d SA-b-Gal aktivitu v porovnaní s kontrolnými. e Hladiny fosforylácie p53 a Rb a hladiny expresie proteínov p21 a HMGBI v kontrolnom a starnúcom A549. Uvedené hodnoty sú priemer ± SD. Pre viaceré skupiny sa použili porovnania pri jednosmernej analýze ANOVA, n=3, ns nevýznamné,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoidyMierka pre obrázky je 500 μm. GAPDH sa použil ako kontrola načítania kontrolných a senescentných END-MSC, ktoré sme vykonali. Druhým bol súbor údajov pre kontrolný a starnúci A549 stiahnutý z GEO [43]. Je potrebné poznamenať, že stavy vyvolávajúce starnutie sa zhodovali s podmienkami použitými v tejto štúdii a v pilotných štúdiách senolýzy indukovanej srdcovými glykozidmi. A tretí súbor údajov bol pre kontrolu a starnúcu IMR-90 získanú priamo zo štúdie o srdcových glykozidoch ako senolytických zlúčeninách [25]. Dôležité je, že sa ukázalo, že IMR-90 je náchylný na analýzu vyvolanú ouabaínom. Treba poznamenať, že porovnávanie iba dvoch súborov údajov relevantných pre END-MSC a A549 by v konečnom dôsledku viedlo k nesprávnym výsledkom, pretože v takejto analýze by bol hľadaný rozdiel medzi procesom starnutia v END-MSC a A549 nerozoznateľný od variácií sprostredkovaných rôzne technické dávkové efekty (tj typ sekvencovacieho stroja, podmienky behu vzorky). Aby sme minimalizovali akékoľvek dávkové účinky, porovnali sme jeden súbor údajov pre bunky rezistentné na ouabaín (END-MSC) a dva pre bunky citlivé na ouabaín (A549, IMR-90). Na overenie relevantnosti ďalšej porovnávacej analýzy sme vykonali analýzu hlavných zložiek pre podskupinu génov súvisiacich s GO termínom "bunková starnutie" (GO 0090398) na základe súhrnného súboru údajov obsahujúceho vzorky zo všetkých troch opísaných experimentov. V skutočnosti sa vzorky pre každý typ buniek zoskupili do dvoch samostatných skupín – kontrolnej a starnúcej (obr. 10d).

cistanche môže proti starnutiu

Na vykonanie analýzy rozdielne exprimovaných génov (DEG) počas starnutia buniek rezistentných a citlivých na ouabain sme vytvorili štatistický model, ktorý zhrnul dva prediktory a ich interakciu. Schematická prezentácia analýzy je znázornená na obr. 10c. Stručne povedané, prvý prediktor v modeli rozdelil všetky vzorky podľa kontrolných a stareckých podskupín, druhý podľa rezistencie na ouabaín alebo citlivosti na ouabaín a posledná zložka v modeli odrážala interakcia oboch prediktorov. Výsledok testovania diferenciálnej expresie pre poslednú premennú je uvedený v doplnkovej tabuľke 1.

Potom sme vykonali analýzu obohatenia génovej sady (GSEA) v podmienkach génovej ontológie (GO) pre biologické procesy (BP) (doplnková tabuľka 2). Medzi výrazne obohatenými procesmi sme zistili, že „import draslíkových iónov“ a „pozitívna regulácia transmembránového transportu katiónov je up-regulovaná počas starnutia END-MSC rezistentných na ouabaín v porovnaní so starnutím buniek citlivých na ouabaín (obr. 10e ). Zoznamy základných génov obohatenia súvisiace s týmito procesmi zahŕňali KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4, ktoré boli významne upregulované v senescentných END-MSC (obr. 10f). Proteíny kódované génmi KCNJ sú draslíkové kanály typu dovnútra usmerňujúceho, ktoré majú väčšiu tendenciu umožniť draslíku prúdiť do bunky a nie von z bunky.užíva hesperidínSLC12 rodina transportérov chloridov s obsahom katiónov. Gén WNK4 kóduje serín/treonín kinázu, ktorá pôsobí ako aktivátor chloridových kotransportérov spojených so sodíkom a inhibítor chloridových kotransportérov spojených s draslíkom. Spoločne tieto zistenia umožnili naznačovať, že senescentné END-MSC môžu obnoviť vyčerpané intracelulárne hladiny K plus efektívnejšie ako starnúce bunky A549, a teda dokážu zvládnuť iónovú nerovnováhu vyvolanú ouabaínom.

Senescentný displej END-MSC je zvýšený

apoptózovej rezistencie v porovnaní s kontrolnými, zatiaľ čo senescentný A549 nie

Úloha intracelulárneho K plus v regulácii bunkovej smrti je dobre známa [46]. Odhalené rozdiely medzi senescentnými END-MSC a bunkami A549 v schopnosti udržiavať intracelulárnu K plus homeostázu nás prinútili porovnať celkovú odolnosť voči stresu získanú počas starnutia oboch typov buniek. Je známe, že exogénne stresy sú sprevádzané poruchou iónovej homeostázy, čo vedie k rýchlej výmene rôznych iónov, vrátane K plus, medzi bunkou a jej prostredím [46]. Výsledky stresových vplyvov sú do značnej miery závislé od schopnosti buniek obnoviť vhodnú vnútrobunkovú iónovú rovnováhu. Ako je znázornené na obr. 10e, f, starnutie END-MSC bolo sprevádzané zvýšenou reguláciou K plus importu, čo naznačuje, že počas

Obr. 10 Senescentné END-MSC rezistentné na ouabain sú schopné obnoviť narušenie homeostázy K plus/Nat spôsobené ouabaínom prostredníctvom účinného importu K plus, zatiaľ čo senescentné bunky citlivé na ouabain túto schopnosť nemajú. a Stanovenie membránového potenciálu kontrolných a senescentných END-MSC a buniek A549 pred a 24 hodín po ošetrení ouabaínom s použitím fluorescenčnej sondy DiBAC4(3). b Hodnotenie potenciálu mitochondriálnej membrány kontrolných a starnúcich buniek END-MSC a A549 pred a 24 hodín po liečbe ouabaínom pomocou fluorescenčnej sondy JC-1. c Návrh komparatívnej bioinformatickej analýzy troch nezávislých súborov údajov RNA-Seq. d Analýza hlavných komponentov pre podskupinu génov súvisiacich s termínom GO "bunková starnutie" (GO 0090398) na základe kombinovaných údajov z troch nezávislých súborov údajov RNA-Seq . Výsledky GSEA pre rozdielne exprimované gény medzi bunkami odolnými voči analýze sprostredkovanej ouabaínom (END-MSC) a bunkami citlivými na analýzu sprostredkovanú ouabaínom (A549 a IMR-90) pre „Pozitívnu reguláciu transmembránového transportu katiónov“ a Biologické procesy importu iónov draslíka. f Teplotná mapa odrážajúca základné gény obohatenia pre biologické procesy „Pozitívna regulácia transmembránového transportu katiónov“ a „Import iónov draslíka“. Hodnoty sú priemer ± SD. Štatistická významnosť bola hodnotená Studentovým t-testom: ns nevýznamné,*p<><><>

vývoj starnutia END-MSC zlepšujú svoju schopnosť obnoviť hladiny K plus. Je zaujímavé, že sme neboli schopní odhaliť podobnú tendenciu starnutia A549, takže sa zdalo, že A549 nezískal žiadne špecifické vlastnosti súvisiace s importom K* počas progresie starnutia. Podľa literárnych údajov stresom vyvolaný pokles intracelulárneho K* a neschopnosť obnoviť jeho hladinu uprednostňujú aktiváciu kaspáz a nukleáz, a preto sa považujú za proapoptotický faktor [46].

V súlade s týmto návrhom sme pomocou bioinformatickej analýzy vyššie uvedených súborov údajov RNA-seq odhalili významnú down-reguláciu procesov súvisiacich s apoptózou počas starnutia END-MSC v porovnaní s A549 a IMR-90 (obr. lla) . Navyše, starnutie A549 a IMR-90 je charakterizované významnou up-reguláciou proapoptotických génov, vrátane BAD, BAX, BOK, BAK-1 a NOXA (obr. 11b). Tieto údaje naznačujú, že END-MSC získavajú fenotyp odolný voči apoptóze počas starnutia, zatiaľ čo senescentné IMR-90 a A549 sa stali náchylnými na apoptózu (obr. 11b). Na posilnenie tohto pozorovania sme dodatočne analyzovali mikročipový súbor údajov pre kontrolné a replikatívne senescentné AD-MSC, ktoré si počas starnutia zachovali aj rezistenciu voči ouabaínu, ako je uvedené vyššie (obr. 4g). Pri analýze hladín expresie génov súvisiacich s apoptózou sme pozorovali odlišný fenotyp senescentných AD-MSC odolných voči apoptóze podobný fenotypu senescentných END-MSC (doplnkový obrázok S8a, b).

Na overenie výsledkov transkriptomickej analýzy sme odhadli hladiny expresie génov súvisiacich s apoptózou a K plus importom v oboch typoch senescentných buniek - END-MSC a A549 pomocou RT-PCR (doplnkový obrázok S9). Okrem toho sme analyzovali expresiu rovnakého zoznamu génov pomocou iných bunkových modelov rezistentných na ouabaín a citlivých na ouabaín, senescentných DP-MSC ošetrených doxorubicínom a senescentných SK-Help ošetrených etopozidom (doplnkový obrázok S9). Ako je znázornené na doplnkovom obrázku S9, oba typy buniek END-MSC a DP-MSC rezistentných na ouabain vykazovali podobné vzory génovej expresie, konkrétne KCNJ2, SLC12A a WNK4 podieľajúce sa na obnove K plus boli upregulované, proapoptotický BAX bol downregulovaný, zatiaľ čo antiapoptotický MCL-I bol upregulovaný. Okrem toho sa vzor expresie tých istých génov líšil od vzorcov pozorovaných pre A549 a SK-Hep1 citlivé na ouabain. Tieto výsledky potvrdzujú naše transkriptomické údaje a posilňujú záver týkajúci sa rôznych profilov apoptózy získaných počas starnutia rôznych typov buniek.

Ďalej sme testovali, či pozorované rozdiely v pozadí apoptózy počas starnutia END-MSC a A549 môžu mať vplyv na celkovú odolnosť starnúcich buniek voči stresu. Aby sme tak urobili, hodnotili sme životaschopnosť buniek po oxidačnom strese a staurosporíne, ktoré sa zvyčajne používajú na vyvolanie apoptózy. V skutočnosti sa ukázalo, že starnúce END-MSC sú podstatne odolnejšie voči obom namáhaniam v porovnaní s ich kontrolnými náprotivkami (obr. 1lc). Naopak, bunky A549 demonštrovali opačnú situáciu, pretože senescentné bunky vykazovali tendenciu byť citlivejšie voči bunkovej smrti vyvolanej stresom (obr. 11d). Toto pozorovanie posúva existujúcu paradigmu, že zvýšená odolnosť voči smrti je bežnou črtou akéhokoľvek druhu senescentných buniek, čo demonštruje jeho zjavnú bunkovú špecifickosť.

Na základe vyššie uvedených údajov sme predpokladali, že zníženie apoptózovej „obrany“ senescentných END-MSC by malo vytvoriť priaznivé podmienky pre ďalšiu analýzu. V tejto súvislosti sme sa zamerali na dobre známeho antiapoptotického člena rodiny proteínov BCL-2 – MCL-1, pretože jeho expresia bola upregulovaná v senescentných END-MSC odolných voči apoptóze (obr. 1lb a doplnkový obr. S9a). Na tento účel sme vopred ošetrili kontrolné a starnúce END-MSC s A-1210477 špecifickým MCL-1 inhibítorom a potom sme aplikovali srdcové glykozidy na vyvolanie analýzy. Je potrebné poznamenať, že samotná A-1210477 nemala žiadny vplyv na proliferačnú kapacitu kontrolných buniek a na životaschopnosť starnúcich buniek, ako je uvedené na rastových krivkách (obr. 1le). Následná aplikácia srdcových glykozidov viedla k zníženiu počtu životaschopných buniek, avšak účinok bol výraznejší v senescentných ESC (obr. 11f). Preto inhibícia MCL-1 pomocou A-1210477 predisponovala senescentné ESC k smrti vyvolanej ouabaínom, čo naznačuje analýzu. Posledný dôkaz o rezistencii na apoptózu získanú počas starnutia END-MSC je vnútornou bariérou pre účinnú analýzu spúšťanú srdcovými glykozidmi.

Diskusia

V rámci tejto štúdie sme testovali senolytické účinky srdcových glykozidov, konkrétne ouabaínu a bufalínu, na hMSC. Nedávno sa zistilo, že obe zlúčeniny majú selektívny cytotoxický účinok na starnúce bunky (modely starnutia vyvolané onkogénom/terapiou) rôzneho pôvodu, vrátane primárnych buniek IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ C-28 a rakovinové bunky SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26]. Neočakávane sme neboli schopné odhaliť žiadne preferenčné cytotoxické účinky ani ouabaínu, ani bufalínu na senescentné END-MSC v porovnaní s kontrolnými. Dôležité je, že absencia analýzy bola overená pomocou hMSC získaných z tukového tkaniva, zubnej drene a Wartonovej želé a rôznych modelov starnutia. To nás viedlo k návrhu, že rezistencia na analýzu indukovanú srdcovými glykozidmi môže byť spoločným znakom hMSC. Zároveň sa nám podarilo navodiť apoptózu prednostne u senescentných A549 a SK-Help, čím sme reprodukovali senolytický účinok srdcových glykozidov popísaný v príslušných článkoch [25,26]. S dostupnými bunkami odolnými a citlivými na analýzu indukovanú ouabaínom (rezistentné na ouabaín / citlivé na ouabaín) sme sa pokúsili objasniť základné príčiny tohto rozdielu. Spoločným molekulárnym mechanizmom účinku srdcových glykozidov je väzba na Nat/K plus -ATPázu a blokovanie jej aktivity. Hydrolýzou ATP tento enzým zaisťuje pumpovanie Na plus z bunky a import K plus do buniek, a tým udržiava fyziologický elektrochemický gradient, iónovú homeostázu, bunkové pH a bunkový objem, ktoré sú nevyhnutné pre prežitie a fungovanie buniek [47]. Preto sme špekulovali, že senolytická schopnosť ouabaínu môže závisieť od závažnosti nerovnováhy K plus / Nat v ošetrených bunkách. V súlade s týmto návrhom sme odhalili, že ouabaín indukoval výraznejšiu depolarizáciu plazmatickej membrány a pokles MMP v senescentnom A549 citlivom na ouabaín.

Vo všeobecnosti sa ukázalo, že vplyv inhibície Nat/K plus -ATPázy na prežitie buniek je špecifický pre bunkový typ. Napríklad sa ukázalo, že ouabain zosilňuje apoptózu v lymfocytoch, Jurkatových bunkách a psích epiteliálnych bunkách, zatiaľ čo nedokázal vyvolať smrť v epitelových bunkách z potkanej aorty, potkaních cerebrálnych granulárnych buniek a prasacích renálnych proximálnych tubulárnych LLC-PK1 lymfocytov napriek podobnej modulácii katiónového pomeru [48-54]. Jedným z navrhovaných mechanizmov proapoptotického pôsobenia ouabaínu je deplécia intracelulárnych buniek, čo podporuje apoptotické zmršťovanie, aktiváciu kaspáz a iniciáciu apoptotického programovania [46, 47]. Vzhľadom na porovnateľnú stratu K plus, ale opačný účinok na indukciu smrti získaný pre modely rezistentné na ouabain a citlivé na ouabain, navrhli sme rozdiely v kompenzačných systémoch katiónov. Pokles intracelulárnej hladiny K plus by mal v podstate viesť k aktivácii importu K plus z extracelulárneho priestoru, aby sa kompenzoval nedostatok tohto katiónu. Preto účinnosť obnovy K plus môže byť základom predispozície k apoptóze po liečbe ouabaínom. Na otestovanie tohto návrhu sme použili komplexnú bioinformatickú analýzu porovnávajúcu zmeny v transkriptomických podpisoch počas starnutia buniek rezistentných na ouabaín (END-MSC) a buniek citlivých na ouabaín (A549 a IMR-90). Pozorovali sme silnú upreguláciu procesov súvisiacich s importom iónov draslíka počas starnutia END-MSC, zatiaľ čo počas starnutia oua-bain-senzitívnych A549 a IMR-90 tieto procesy zostali nezmenené alebo dokonca znížené. Na základe toho môžeme špekulovať, že senescentné END-MSC sa dokážu účinne vyrovnať s depléciou K plus vyvolanou ouabaínom prostredníctvom aktívnych systémov importujúcich katión, čo zabraňuje indukcii apoptózy. Naopak, starnúce A549 a IMR-90 citlivé na naše bain sa zdajú byť menej schopné prekonať stratu K plus, a preto sú náchylné na apoptózu. V prospech tohto predpokladu ouabain indukoval významnejšiu depolarizáciu plazmy a mitochondriálnych membrán v senescentné bunky A549, ktoré preukazujú výraznú iónovú nerovnováhu typickú pre umierajúce bunky.

Pokles intracelulárneho obsahu K plus je pravdepodobne bežnou charakteristikou apoptotickej smrti vyvolanej rôznymi stresmi, napr. liečbou staurosporínom a oxidačným stresom, a nie jedinečným znakom apoptózy indukovanej ouabaínom [46]. V súlade s tým by znížená schopnosť starnúceho A549 obnoviť cytoplazmatický K plus mala v konečnom dôsledku viesť k poklesu celkovej odolnosti voči stresu. Táto predstava je však v rozpore s modernou definíciou starnutia buniek, ktorá uvádza, že starnúce bunky sú vysoko odolné voči apoptóze [16]. Malo by sa osobitne zdôrazniť, že zvýšená odolnosť voči apoptóze vytvorila základ pre vývoj analytiky [16, 17].

Prvá zmienka o zvýšenej odolnosti starnúcich buniek voči stresu sa datuje do roku 1995, keď sa zistilo, že replikatívne starnúce fibroblasty sú odolnejšie voči odberu séra v porovnaní s kontrolnými [55]. Po tejto počiatočnej štúdii nasledoval obmedzený počet výskumov, ktoré naznačujú, že starnúce bunky sú odolnejšie voči UV svetlu, staurosporínu, thapsigarginu a iným stresom ako ich proliferujúce náprotivky [56, 57]. Nie sme však ani zďaleka prví, ktorí nastolili otázku zvýšenej odolnosti voči apoptóze ako všeobecného znaku senescentných buniek. V prehľade publikovanom v roku 2003 sa teda uvádza, že „... odolnosť voči apoptóze nie je všeobecným znakom starnúcich buniek, ktoré môžu byť tiež náchylné na apoptózu v závislosti od typu bunky a apoptotických stimulov...“[58]. Niekoľko údajov skutočne preukázalo vyššiu citlivosť starnúcich buniek na stresom indukovanú apoptózu ako kontrolných buniek [59-61]. Napríklad senescentné bunky HUVEC boli náchylnejšie na apoptózu indukovanú oxidovaným LDL alebo TNFa v porovnaní s kontrolnými bunkami [61]. Napriek zjavnej kontroverzii sa posledná pochybnosť objavila v roku 2015 a znela takto: „Zdá sa pochybné, že globálna rezistencia na apoptózu je všeobecným znakom buniek starnutia“[62]. V tom istom roku bola publikovaná prvá štúdia odhaľujúca analýzu [16 ]. V rámci tejto štúdie autori zdôraznili zvýšenú expresiu génových sietí pre prežitie v senescentných bunkách, čo prispelo k ich zvýšenej odolnosti voči apoptóze. Senolytiká teda spočiatku predstavovali lieky na zacielenie proteínov, ktoré chránili starnúce bunky pred apoptózou. Objav analytiky spolu s pôsobivými výsledkami odstraňovania senecentných buniek pomocou transgénnych myší INK-ATTAC spustil záplavu štúdií, ktoré hľadali nové zlúčeniny s hemolytickou aktivitou [16-26,63]. Za posledné dva roky bolo publikovaných množstvo recenzií o analytike [13-15,64-66]. Od roku 2015 však zvýšená rezistencia senescentných buniek na apoptózu nebola predmetom diskusie, hoci v skutočnosti sa v rámci týchto štúdií netestovala.

Je zaujímavé, že pri porovnaní transkriptomických podpisov buniek rezistentných na ouabaín (END-MSC) a buniek citlivých na ouabaín (A549 a IMR-90) sme zistili, že iba starnutie END-MSC bolo sprevádzané získaním viditeľných antiapoptotický profil. Naopak, starnutie A549 a IMR-90 je charakterizované významnou up-reguláciou proapoptotických génov vrátane BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA atď. Dôležité je, že tieto výsledky boli rozšírené s použitím iných buniek DP-MSC rezistentných na ouabatín. Na jednej strane tieto výsledky poskytujú ďalšie molekulárne vysvetlenie neprítomnosti analýzy indukovanej ouabaínom v hMSC a na druhej strane jasne ukazujú, že A459 a IMR-90 sa stávajú predisponovanými k apoptóze počas starnutia. Je potrebné poznamenať, že naše údaje týkajúce sa transkriptomických zmien v génoch súvisiacich s apoptózou pri starnúcej IMR{18}} sa zhodovali s výsledkami prezentovanými, ale nediskutovanými v článku publikovanom Guerrerom et al., ako súbory údajov pre kontrolu a starnúcu IMR{18} {19}} buniek pochádza z tejto štúdie [25]. Presná analýza tepelnej mapy poskytnutej v rámci tejto štúdie odhalila zvýšenú reguláciu BAX, BAD, BAD, BAKI a NOXA v senescentnom IMR-90 v porovnaní s kontrolnými bunkami. Okrem toho Baar a kol. tiež odhalili "neočakávanú" upreguláciu proapoptotických a downreguláciu antiapoptotických génov v senescenčnom IMR-90, pričom sa uvádza, že starnúce IMR-90 by malo byť primované na apoptózu [21].

Aby sme posilnili naše pozorovanie, porovnali sme rezistenciu kontrolných a senescentných END-MSC a A459 s najbežnejšími stimulmi indukujúcimi apoptózu, oxidačným stresom a staurosporínom. Podľa výsledkov našej bioinformatickej analýzy sa senescentné END-MSC ukázali ako oveľa odolnejšie voči stresu ako kontrolné bunky. V rovnakom čase starnúca A549 demonštrovala opačnú reakciu, ktorá bola o niečo citlivejšia ako kontrolné bunky na oba typy stresových stimulov. Senolytický účinok srdcových glykozidov, aspoň pre A549, môže byť teda sprostredkovaný predispozíciou starnúcich buniek tohto pôvodu k apoptóze v porovnaní s ich kontrolnými náprotivkami, zatiaľ čo neprítomnosť senolýzy indukovanej ouabaínom v hMSC môže byť vysvetlená zvýšením celkovú apoptotickú rezistenciu počas starnutia týchto buniek. Okrem toho oslabenie „antiapoptickej obrany“ inhibíciou MCL-1 predisponovalo END-MSC k senolýze vyvolanej srdcovými glykozidmi. Hoci sme boli schopní dosiahnuť požadovanú senolýzu END-MSC inhibíciou MCL-1, stratégia modulácie expresie konkrétnych antiapoptotických génov na predisponovanie senescentných hMSC k senolýze sa nezdá byť veľmi sľubná, pretože expresia dynamika konkrétnych anti- alebo proapoptotických génov sa môže medzi bunkami rôzneho pôvodu líšiť. Domnievame sa, že za rezistenciu voči ouabainu je zodpovedné skôr získanie takzvaného „antiapoptotického“ profilu počas starnutia bunky, než zmeny v konkrétnych anti- alebo proapoptotických génoch, v tomto ohľade môže byť možnosť zmeniť celý profil. zdajú byť rozumnejšie.

Naše závery zdôrazňujúce odolnosť voči apoptóze získanú počas starnutia hMSC ako vnútornú bariéru pre účinnú analýzu môžu byť rozšírené ďaleko za srdcové glykozidy. Predovšetkým sa zistilo, že senescentné hMSC sú odolné voči iným senolytickým zlúčeninám. Analýzou existujúcich dôkazov sme skutočne zistili, že rôzne zlúčeniny s uvedenou senolytickou aktivitou, vrátane navitoclaxu, nikotínamid ribozidu, danazolu geldanamycínu, ganetespibu, fisetínu, inhibítorov BCL-XL, kvercetínu, etomoxiru, antimycínu A, FOXO4-DRI ,17-DMAG sa ukázal ako neúčinný na cielené odstránenie senescentných ľudských preadipocytov (prekurzorových buniek podobných fibroblastom odvodených z ľudského tukového tkaniva) a hMSC z kostnej drene [17-19, 36, 40]. Údaje týkajúce sa absencie analýzy v hMSC sú trochu v rozpore s inšpirujúcimi výsledkami získanými pomocou in vivo myších modelov, ktoré preukazujú pozitívne výsledky pri systémovej aplikácii analytiky [37, 38]. Napríklad sa ukázalo, že klírens senescentných kmeňových buniek slinných žliaz pomocou ABT263 môže zabrániť xerostómii vyvolanej rádioterapiou [38]. Okrem toho odstránenie senescentných MSC kostnej drene kvercetínom zlepšilo tvorbu kostnej drene [37]. Dôležité je, že sa ukázalo, že starnúce myši a potkanie MSC na rozdiel od hMSC reagujú na analýzy. Napríklad quercetin, quercetin-tin＋dasatinib a ABT263 významne odstránili senescentné myšacie MSC [16]. Tiež sa ukázalo, že 17-DMAG výrazne znižuje starnúce bmMSC v modeli progeroidných myší [19]. Preto sa predpokladá, že zlepšenia fungovania rôznych orgánov a systémov opísané v týchto štúdiách sú dôsledkom cieleného odstránenia senescentných myších kmeňových buniek. Tieto analýzy však ešte nepreukázali žiadne funkčné omladenie hMSC. Takýto zrejmý rozdiel medzi reakciou myší a ľudských MSC na analýzu naznačuje, že zlepšenia zo senolytických terapií sa nemusia zachovať u druhu. Výsledky získané pre senolytickú zlúčeninu UBX0101 možno považovať za dobrú ilustráciu potvrdzujúcu posledné tvrdenie. Ukázalo sa, že toto činidlo odstraňuje starnúce bunky v myšom modeli osteoartritídy, čo významne znižuje bolesť a podporuje opravu poškodenej chrupavky [20]. Bohužiaľ, UBX0101 nedokázal zmierniť progresiu ochorenia a bolesť u pacientov so stredne ťažkou až stredne ťažkou bolestivou osteoartritídou počas klinických štúdií fázy II [67-69]. Podobné obavy sa objavujú v súvislosti so senolytickou kombináciou dasatinib＋querce-cín[68].

Zhrnuté, zo získaných údajov vyplývajú dva dôležité závery. Prvý z nich ukázal, že srdcové glykozidy nie sú schopné vyčistiť starnúci hMSC. Neprítomnosť analýzy môže byť sprostredkovaná účinným bunkovým importom K plus a zvýšenou odolnosťou voči apoptóze v senescentných hMSC. Ten druhý je zásadnejší a odhaľuje, že rezistencia na apoptózu nie je všeobecnou črtou starnúcich buniek, keďže počas starnutia niektoré bunky získajú fenotyp „rezistentný na apoptózu“, zatiaľ čo iné nie. Dôležité je, že iba senescentné bunky A549 náchylné na apoptózu mohli byť účinne vyčistené srdcovými glykozidmi. Na základe toho môžeme špekulovať, že účinnosť iných senolytických prístupov môže závisieť od toho, či sú starnúce bunky skutočne odolné voči apoptóze v porovnaní s ich proliferujúcimi náprotivkami. Napokon, hoci je „analytika“ horúcou témou a uverejňuje sa veľa inšpiratívnych údajov, závery týkajúce sa účinnosti analýzy by sa mali brať s rezervou, pretože heterogenita starnutia buniek stále zostáva „hádankou“.

Tento článok je prevzatý z Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x