Vodné extrakty z kultivovanej Cistanche Deserticola YC Ma ako polysacharidové adjuvans podporujú imunitné reakcie

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

ABSTRAKT

Etnofarmakologický význam:Rastlinné polysacharidy sa ukázali skveleimúnny- zvyšovanie potenciálu. Adjuvans sú kľúčovým nástrojom na vývoj účinných vakcín. V našej predchádzajúcej štúdii vo vode rozpustný polysacharid extrahovaný z voľne žijúcich živočíchovCistanche deserticola YC Mavykazovali silnú imunostimulačnú aktivitu.

Cieľ štúdie:V tejto štúdii,imúnnyprofily a účinnosť vodných extraktov kultivCistanche deserticola YC Ma(AECCD) na ICR myšiach proti ovalbumínu (OVA). V in vitro experimentoch sa hodnotil možný mechanizmus aktivácie DC pomocou AECCD.

Materiály a metódy: AECCDsa extrahovali horúcou vodou a potom sa surové polysacharidy vyzrážali etanolom. Myši boli najprv imunizované subkutánne OVA (10 ug na myš) samotným alebo OVA (10 ug na myš) s obsahom rôznych dávok AECCD (200, 400 a 800 ug na myš) v dňoch 1 a 14 a veľkosť a kinetika protilátky a bunkami sprostredkované reakcie sa potom hodnotili.

Výsledky: AECCDvyvolalo silné a dlhodobé IgG odpovede so zmiešanými Th1/Th2 odpoveďami a upregulovanými hladinami Th-asociovaných cytokínov (CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- a CD8 plus IFN-). Navyše AECCD indukoval silnú bunkuimúnnyreakciu charakterizovanú zvýšenou proliferáciou splenocytov, ako aj reakciou aktivovaných T buniek. Je pozoruhodné, že AECCD významne zvýšilo dozrievanie dendritických buniek (DC) a inhibovalo Tregs. Experimenty in vitro Predbežné testy ukázali, že AECCD indukuje aktiváciu DC podporou fenotypového dozrievania, cytokínovej sekcie a alostimulačnej aktivity. Toll-like receptor 4 (TLR4) bol nevyhnutným receptorom pre DC na priamu väzbu AECCD. Inhibítory NF-KB znížili hladiny expresie CD40, CD80, CD86 a MHC-II a produkciu IFN-, TNF- a IL-6 prostredníctvom DC.

Závery:Napokon tieto zistenia tomu nasvedčovaliAECCDby mohli vyvolať silnú a trvalú antigén-špecifickosťimúnnyreakcie prostredníctvom aktivácie DC, ktorá sa podieľala na regulácii markerov dozrievania a expresie cytokínov prostredníctvom dráhy NF-KB súvisiacej s TLR{0}}. Štúdia naznačuje, že AECCD je potenciálny imunomodulátor.

Cistanche herbazlepšujeimunita.

1. Úvod

Mnohé štúdie naznačili, že adjuvanty môžu zvýšiť účinnosť vakcín proti rôznym infekčným chorobám, ako je HIV, COVID{0}}, chrípka a slintačka a krívačka (Cao a kol., 2020; Giuseppe a kol., 2018 ). Adjuvans môže indukovať rôzne typy a veľkosti imunitných odpovedí, takže vhodne vybrané adjuvans môže indukovaťimúnnyodpoveď potrebná pre daný patogén alebo antigén (Reed et al., 2013). Prírodné bylinné extrakty sú už dlho široko používané v každodennom živote alebo v zdravotníctve. V mnohých prípadoch tradičná čínska medicína (TCM) a jej aktívne zložky, najmä viacnásobné adjuvansy odvodené od polysacharidov TCM, významne zlepšili účinnosť vakcín. Polysacharidy TCM (Advax™, Astragalus polysacharid, ženšenový polysacharid, Lycium barbarum polysacharid a Ganoderma lucidum polysacharid) mali niekoľko výhod oproti iným adjuvans, ako je lepšia bezpečnosť, biokompatibilita, silnáimúnnyzlepšenie a nízka reaktogenita (Li a Wang, 2015; Schijns et al., 2020). Zlúčeniny a formulácie na báze polysacharidov TCM majú preto potenciál ako kandidáti na adjuvans.

Cistanche deserticola YC Ma(Roucongrong v čínštine) je tradičná čínska medicína zaznamenaná v Čínskom liekopise a v Číne sa už stovky rokov používa ako posilňujúca potravina (Komisia pre čínsky liekopis, 1992). Moderné farmakologické štúdie preukázali jeho viaceré farmakologické a imunomodulačné aplikácie (Dong a kol., 2007; Fu a kol., 2017). V našej predchádzajúcej štúdii surové polysacharidy odvodené z divokej Cistanche deserticola YC Ma podporovali antigénovo špecifické humorálne a bunkové reakcie a regulovali dozrievanie dendritických buniek (DC) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). Divoká Cistanche deserticola YC Ma však bola nadmerne preskúmaná a uvedená ako ohrozený druh.Cistanche deserticola YC Mabol vysadený vo veľkom meradle a je široko používaný pri vývoji a aplikácii zdrojov TCM. Avšak adjuvantný potenciál kultivovanej Cistanche deserticola YC Ma je ​​stále nejasný.

DC sú základnými regulátormi proti infekčným chorobám. Po aktivácii DC povrchové molekuly a prozápalové cytokíny na DC interagujú so zodpovedajúcimi receptormi, aby aktivovali T bunky a vyvolali antigén-špecifické reakcie a produkciu cytokínov smerujúcich adaptívneimúnnyodpovede (Banchereau a Steinman, 1998). Uvádza sa, že toll-like receptor 4 (TLR4) na DC funguje ako dôležitý polysacharidový receptor (Park a kol., 2014; Qi a kol., 2016). Mnohé polysacharidy môžu skutočne interagovať priamo alebo nepriamo s TLR4 na DC, aby aktivovali downstream jadrový faktor-kappa B (NF-κB), ktorý môže indukovať expresiu rôznych prozápalových génov, ako sú IFN-, TNF- a IL{{11 }} a zápalová odpoveď na elimináciu patogénov (Tian a kol., 2019; Zhou a kol., 2017; Zhu a kol., 2013). Preto boli DC a NF-KB rozsiahle študované ako potenciálne ciele pre terapiu chorôb.

V štúdii so stratégiou in vivo (ICR myši) sme najskôr hodnotili imunostimulačné účinky vodných extraktov kultivovanýchCistanche deserticola YC Ma(AECCD) s rôznymi dávkami (nízkymi, strednými a vysokými), aby sa vyvolala imunitná odpoveď proti OVA a vysvetlil sa in vitro spôsob aktivácie DC a následných dráh súvisiacich s receptorom. S myšacím modelom sme odhalili, že AECCD podporuje dlhodobú protilátkovú odpoveď so zvýšenými titrami IgG a bunkamiimúnnyodpoveď. Dôležité je, že AECCD indukovalo Th-asociované cytokíny, najmä produkciu IFN-, čo viedlo k Th1 reakcii proti infekciám. Indukčný účinok úzko koreloval so zvýšeným dozrievaním DC a zníženým Tregs. mechanicky,AECCDpodporovala aktiváciu DC prostredníctvom dráhy NF-KB súvisiacej s TLR4-. Stručne povedané, štúdia potvrdila silnú adjuvantnú aktivitu AECCD pri podpore adaptívnej odpovede. Štúdia položila základ pre vývoj polysacharidových adjuvans AECCD.

2. Materiály a metódy

2.1. Činidlá

Ovalbumín (OVA), 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazóliumbromid (MTT), polymyxín B (PMB), konkanavalín A (ConA), lipopolysacharid (LPS), mitomycín C a 3,3',5,5'-tetrametylbenzidín (TMB) boli získané od Sigma (USA). Fetálne bovinné sérum (FBS) bolo zakúpené od Biological Industries. Súprava na počítanie buniek-8 (CCK-8) bola zakúpená od spoločnosti Biosharp (Čína). Kozie anti-myšie IgG/IgG1/IgG2a-HRP konjugáty boli od Southern Biotech (USA). Inject Alum bol od Thermo Scientific Pierce (USA). GM-CSF bol od Peprotech (USA). Fluorescenčne značené protilátky (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti-IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm a Perm/Wash buffer boli všetky od BD Bioscience (USA). Regulačná súprava na farbenie T-buniek bola od eBiosciences (USA). TAK-242 pochádzal z MedchemExpress (Shanghai, Čína). PDTC bol od Beyotime Biotechnology (Čína). Multianalytová súprava prietokového testu bola od Biolegend (USA).

2.2. Príprava AECCD

C. deserticola (vzor kupónu č. CD10041602) identifikoval profesor Jiang He.AECCDbol získaný extrakciou vodou, zrážaním etanolom a metódou deproteinizácie s malými úpravami (Zhang et al., 2018). V stručnosti, kultivovaná C. deserticola bola najprv mnohokrát extrahovaná vodou a potom boli surové polysacharidy cez noc precipitované pridaním etanolu v objemovom pomere 1:4. Potom boli získané surové polysacharidy deproteinizované metódou Sevag (Liu et al., 2012). Celkový obsah cukru bol zistený na 76,82 percent metódou antron-kyselina sírová (Dubois et al., 1951).

cistanche mužské výhodyvimunita

2.3. Infračervená spektroskopická analýza

Na účely analýzy organických funkčných skupínAECCDs KBr sa lisoval do peliet na meranie infračerveného (IR) spektra. IČ spektrá vzoriek boli stanovené v rozmedzí 4000–400 cm-1.

2.4. Experimenty in vivo

2.4.1. Imunizácia zvierat

Samice myší C57BL/6 a myši ICR (vo veku 6 týždňov) z lekárskej univerzity Xinjiang (Urumqi, Čína) sa aklimatizovali počas 3 dní. Všetky experimentálne postupy sa uskutočnili v súlade s nariadeniami Výboru pre etiku pokusov na zvieratách Kľúčového laboratória biologických zdrojov a genetického inžinierstva Xinjiang na univerzite v Xinjiang (BRGE-AE001).

Myši boli subkutánne imunizované samotným OVA alebo OVA s rôznymi koncentráciami AECCD a posilnená v deň 14 podľa rôznych skupín nasledovne (6 myší v každej skupine): Kontrolná skupina (0,9 percent NaCl), skupina OVA ( 10 ug OVA),AECCD-H skupina (AECCD 800 ug), OVA/AECCD-L skupina (10 ug OVA, AECCD 200 ug), OVA/AECCD-M skupina (10 ug OVA, AECCD 400 ug), OVA/AECCD -H skupina (10 ug OVA, AECCD 800 ug) a skupina OVA/Alum (10 ug OVA, Alum 100 ug). Vakcinačné formulácie v 100 ul 0,9 percenta NaCl boli injikované do dvoch rôznych miest (50 ul na každé miesto) do kože chrbta každej myši. Po vakcinácii sa odobrali vzorky krvi z retroorbitálneho plexu a získali sa séra, ktoré sa skladovali pri -80 ◦C na ďalšiu analýzu detekcie IgG. Proliferácia splenocytov a detekcia cytokínov, podskupín T buniek, povrchových markerov DC a Treg sa uskutočnili po rovnakom vakcinačnom protokole.

2.4.2. Analýza protilátok

Titre IgG v sére proti OVA boli stanovené pomocou ELISA v dňoch 14, 28, 42 a 56 po primárnej vakcinácii uvedenej vyššie (Zhang et al., 2018). IgG1 a IgG2a sa merali v deň 21. Absorbancia pri 450 nm/630 nm sa získala pomocou čítačky (Bio-Rad, USA). Výsledky protilátkovej odpovede sú vyjadrené ako IgG titre a IgG1 a IgG2a izotypy sú vyjadrené ako zodpovedajúce absorbancie.

2.4.3. Test proliferácie splenocytov

Test proliferácie splenocytov u myší sa uskutočnil pomocou testovacej súpravy CCK{0}} podľa pokynov výrobcu. V deň 21 po prvej imunizácii boli splenocyty izolované zo sleziny imunizovaných myší a erytrocyty boli lyzované po rozomletí. Splenocyty (1 x 106 buniek/jamka) boli stimulované OVA (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/ml), ConA (10 ug/ml) a LPS (10 ug/ml) pre dva dni a ako kontrola sa použili prázdne bunky. Proliferačná aktivita sa vyjadrila ako stimulačný index (SI), ktorým sa vypočítal pomer absorbancie stimulovanej bunky k nestimulovanej bunke pri vlnovej dĺžke 570/630 nm.

Obr. 1. FTIR spektrá AECCD.

2.5. Experimenty in vitro

2.5.1. Generovanie DC, životaschopnosť buniek a hladiny endotoxínu

DC odvodené z kostnej drene myší C57BL/6 sa získali podľa spôsobu opísaného skôr (Inaba a kol., 1992). V stručnosti, bunky sa kultivovali s kompletným médiom RPMI-1640 (20 ng/ml GM-CSF a 5 ng/ml IL-4). Po šiestich dňoch sa všetky suspendované bunky zhromaždili ako nezrelé DC na následné testy. Percento CD11c plus DC v neadherentných bunkách sa stanovilo ako 94 percent pomocou prietokovej cytometrie.

Životaschopnosť buniek DC a splenocytov z myší po AECCD sa detegovala pomocou súpravy CCK-8 podľa pokynov výrobcu. Bunky z DCS a splenocytov boli získané a potom stimulované rôznymi koncentráciamiAECCD(0, 10, 100, 400, 800 a 1600 ug/ml). Životaschopnosť buniek bola vyjadrená ako pomer absorbancie liečenej skupiny k absorbancii kontrolnej skupiny) x 100 percent.

Na účely vylúčenia účinku endotoxínu v AECCD, potom, čo boli AECCD (100, 200 a 400 ug/ml) a LPS (100 ng/ml) vopred ošetrené PMB (100 ug/ml) počas 60 minút, DC (5 x 105 buniek/ml) sa inkubovalo s vopred ošetreným AECCD (100, 200 a 400 ug/ml) a LPS počas 12 hodín. Po vyššie uvedenej liečbe sa vyhodnotili hladiny CD40, CD86, CD80 a MHCII.

2.5.2. Analýza fenotypu DC

Hladiny kostimulačných molekúl boli určené na vyhodnotenie dozrievania DC prostredníctvom in vitro experimentov. Na šiesty deň boli DC liečené sAECCD(20, 100, 200 a 400 ug/ml) alebo LPS (100 ng/ml) počas 12 hodín. Potom boli DC zafarbené povrchovými molekulami a analyzované prietokovou cytometriou.

2.5.3. Produkcia cytokínov DC in vitro

Supernatant bunkovej kultúry sa odobral na meranie hladiny cytokínov pomocou súpravy ELISA alebo súpravy na multianalytový prietokový test metódou CBA. Všetky experimentálne kroky boli uskutočnené podľa pokynov výrobcu.

2.5.4. Alogénna zmiešaná lymfocytová reakcia (MLR)

Splenocyty z myší BALB/c boli asepticky získané v médiu RPMI{0}} (Zhang et al., 2018). Zrelé C57BL/6 DC (dozrievajúce v prítomnosti rôznych koncentráciíAECCDalebo LPS) boli vopred ošetrené 50 ug/ml mitomycínu C počas 60 minút pri 37 °C. Po premytí sa DC zmiešali so splenocytmi v pomere 1:5 alebo 1:10 počas 2 dní. Bunková proliferácia bola stanovená MTT testom.

Obr. 2. Titre protilátok špecifických pre OVA a izotypy IgG v sére. Vzorky séra sa odobrali po primárnej a posilňovacej imunizácii na protilátky pomocou ELISA

2.6. Štatistická analýza

Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Významná úroveň štatistických rozdielov bola stanovená pomocou jednocestnej ANOVA a Tukeyho viacnásobného porovnávacieho testu. P < 0.05="" sa="" považuje="" za="" štatisticky="">

3. Výsledky

3.1. FTIR spektroskopia

Hlavné absorpčné vrcholyAECCDna obr. 1 boli charakteristické absorpčné vrcholy glykozidických štruktúr zodpovedajúce vibráciám naťahovania O–H pri 3342,95 cm-1. Pás pri 2933,54 cm-1 mal charakteristickú slabú absorpciu naťahovacích vibrácií C-H. Vrchol pri 1657,39 cm-1 bol pripísaný O–H ohybovej vibrácii. Absorpcia pri 1411.00 cm-1 bola pripísaná naťahovacím vibráciám O–H alebo C–H a C–O. Vrcholy pri 1018,38 cm-1 tiež indikovali vibrácie glykozidového pásu CO a C–O–C.

3.2. OVA-špecifická sérová protilátková odpoveď

Séra z imunizovaných myší sa testovali na kontrolu prítomnosti vytvorených protilátok (IgG, IgG1 a IgG2a) proti OVA. Ako je znázornené na obr. 2A, IgG titre u myší imunizovaných OVA/AECCD-M elicited higher total IgG (titers: 220,000, 250,000 and 250,000) relative to those of OVA group (titers: 100,000, 100,000 and 120,000), and was close to Alum group (titers: 250,000, 250,000 and 270,000) on Days 28, 42 and 56 after primary vaccination. OVA/AECCD-M/H significantly enhanced IgG1 levels compared to the OVA group (P < 0.05) and the difference between OVA/AECCD-M/H group and Alum group was not significant (P>{{0}}.05). OVA/AECCD-M/H tiež výrazne zvýšili hladiny IgG2a v porovnaní s OVA skupinou a kamencovou skupinou (obr. 2B a C) (P < 0,05).="" zvýšené="" hladiny="" igg2a="" môžu="" zabrániť="" ochoreniu="" vyžadujúcemu="">imúnnyodpoveď.

3.3. Bunkové imunitné reakcie

Proliferácia lymfocytov sleziny sa skúmala testom MTT pri restimulácii OVA alebo OVA323-339. Analýza proliferácie odhalila, že OVA/AECCD-M oba výrazne zvýšili proliferáciu splenocytov po expozícii OVA, OVA323-339, Con A alebo LPS v porovnaní so skupinou OVA. OVA a OVA323-339 signifikantne zlepšili vyššiu proliferačnú odpoveď ako v skupine s kamencom (obr. 3) (P < 0="">

Obr. 3. Proliferácia splenocytov po liečbe AECCD in vivo

3.4. Aktivácia podskupín T buniek v drenážnych lymfatických uzlinách a slezine

Lymfatické uzliny a slezina z imunizovaných myší sa odobrali na detekciu podskupín T buniek v deň 21 po primárnej vakcinácii. Percento podskupín T buniek (CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus T bunky) z lymfatických uzlín v skupine OVA/AECCD-M bolo významne vyššie ako v skupine OVA a skupine Alum (obr. 4A–D) (P < 0.05).="" percentá="" podskupín="" t="" buniek="" (cd4="" plus,="" cd8="" plus,="" cd44="" plus="" a="" cd62l="" plus="" t="" bunky)="" v="" slezine="" boli="" významne="" vyššie="" ako="" v="" skupine="" ova="" (obr.="" 4e-j)="" (p="">< 0,05).="" tieto="" zistenia="" tomu="">AECCDpodporované bunkami sprostredkovanéimúnnyodpoveď.

3.5. Cytokíny vylučované restimulovanými splenocytmi in vivo

Th1/Th2 cytokíny zo sleziny imunizovaných myší boli stanovené intracelulárnym farbením v deň 21 po prvej vakcinácii. Hladiny CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- a CD8 plus IFN- v skupine OVA/AECCD-M boli významne vyššie ako hladiny v skupine OVA a skupine Alum (P< 0.05,="" fig.="" 5).="" the="" differences="" indicated="" that="">AECCDby mohli stimulovať Th1/Th2 reakcie, najmä sprostredkované T-bunkamiimúnnyodpoveď.

3.6. DC zrenie a Tregs in vivo

Aktivácia DC môže spustiť adaptívnu imunitu. ÚčinkyAECCDna DC zrenie u imunizovaných myší boli hodnotené v deň 3 po prvej imunizácii. OVA/AECCD-M indukoval najvyššie hladiny CD40, CD80, CD86 a MHCII na DC v porovnaní so skupinou OVA a rozdiel medzi skupinou OVA/AECCD-M a Alum skupina bola signifikantná (obr. 6A–D) (P < 0,05).="" frekvencia="" cd4="" plus="" cd25="" plus="" foxp3="" plus="" tregs="" v="" skupine="" ova/aeccd-m="" bola="" dramaticky="" nižšia="" ako="" frekvencia="" v="" skupine="" ova="" (obr.="" 6e)="" (p="">< 0,05).="" tieto="" údaje="" naznačujú,="" že="" aeccd="" môže="" aktivovať="" dc="" a="" znížiť="" frekvenciu="">

3.7. Testy cytotoxicity a endotoxínovej kontaminácie

Po ošetrení rôznymi koncentráciamiAECCDpočas 2 dní sa bunky z DC a splenocyty myší použili na stanovenie potenciálnej cytotoxicity pomocou súpravy CCK-8. V bunkovej životaschopnosti DC a splenocytov nebola žiadna signifikantne inhibovaná proliferačná odpoveď v porovnaní s kontrolnými skupinami (obr. 7A–B) (P > 0.05). Tieto výsledky ukázali, že AECCD v koncentrácii 10–1600 ug/ml nevykazovala žiadnu významnú cytotoxicitu voči DC a splenocytom v porovnaní s kontrolou (P > 0,05). Koncentrácia AECCD v nasledujúcich experimentoch bola teda nastavená pod 1600 ug/ml. Aby sa vylúčila interferencia kontaminácie endotoxínom v účinkoch AECCD na aktiváciu DC, na vylúčenie kontaminácie endotoxínom sa použilo PMB, antibiotikum široko uznávané vďaka svojmu LPS-neutralizačnému účinku (Morrison a Jacobs, 1976). Ako je znázornené na obr. 7C-F, hladiny expresie CD40, CD80, CD86 alebo MHC-II v DC liečených AECCD v prítomnosti PMB nevykazovali žiadnu významnú zmenu (P > 0,05). Avšak dramatický pokles hladín expresie CD40, CD80 CD86 a MHC-II bol pozorovaný v DC liečených LPS v prítomnosti PMB (P < 0,001).="" tieto="" výsledky="" ukázali,="" že="" aeccd="" neobsahovala="" kontamináciu="">

3.8. Fenotypové dozrievanie a funkčná aktivácia DC in vitro

Na základe vyššie uvedených imunizačných experimentov sa ďalej skúmalo fenotypové dozrievanie DC po liečbe s AECCD in vitro. V deň 6 boli nezrelé DC stimulované danou koncentráciou AECCD alebo LPS na analýzu povrchových molekúl.AECCDindukované dozrievanie buniek charakterizované významným zvýšením percenta CD40, CD80 CD86 a MHC II spôsobom závislým od dávky (P < 0,001,="" obr.="" 8a–d).="" podobné="" fenotypové="" dozrievanie="" dc="" bolo="" tiež="" pozorované="" po="" stimulácii="" 100="" ng/ml="" lps.="" údaje="" analýzy="" ukázali,="" že="" aeccd="" zlepšilo="" zrenie="" dc.="" z="" vyššie="" uvedených="" výsledkov="" aeccd="" zlepšilo="" fenotypové="" dozrievanie="" dc.="" aby="" sa="" pozoroval="" účinok="" aeccd="" na="" funkciu="" dc="" in="" vitro,="" skúmala="" sa="" schopnosť="" dc="" ošetrených="" aeccd="" stimulovať="" alogénnu="" proliferáciu="" t="" buniek="" v="" mlr="" pri="" pomere="" dc-splenocyty="" 1:5="" alebo="" 1:10.="" dc="" ošetrené="" rôznymi="" koncentráciami="" aeccd="" indukovali="" významnú="" proliferáciu="" t="" buniek="" v="" porovnaní="" s="" neošetrenými="" dc="" (obr.="" 8e–f)="">< 0.001).="" dc="" maturation="" could="" induce="" the="" production="" of="" cytokines.="" next,="" the="" supernatants="" of="" dcs="" treated="" with="" aeccd="" or="" lps="" were="" detected="" by="" elisa="" kit.="" the="" levels="" of="" il-12="" and="" tnf-α="" in="" the="" supernatants="" of="" dcs="" were="" dramatically="" increased="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (p="" <="" 0.001,="" fig.="">

3.9. TLR4, receptor pre AECCD na DC

DC môžu iniciovať bunkovú signalizáciu membránovými receptormi. Aby sa určila úloha TLR4 pri účasti na maturácii DC ošetrených AECCD, po predbežnej liečbe inhibítorom TLR4 TAK-242 boli DC stimulované danou koncentráciouAECCD,a potom sa stav aktivácie DC skúmal prietokovým cytometrom. Hladiny expresie cytokínov v kultivačných supernatantoch boli analyzované multianalytovou súpravou prietokového testu. Upregulácia CD40, CD80, CD86 a MHC-II indukovaná AECCD bola významne inhibovaná blokovaním dráh TLR4 (P< 0.01,="" fig.="" 9a–d).="" moreover,="" compared="" to="" untreated="" control,="" blocking="" tlr4="" with="" tak-242="" had="" a="" more="" significant="" inhibition="" effect="" on="" the="" production="" of="" ifn-γ,="" tnf-α,="" and="" il-6="" (p="" <="" 0.01,="" fig.="">

3.10. Aktivácia DC pomocou AECCD prostredníctvom dráhy NF-KB súvisiacej s TLR4-

Aby sa zistilo, či expresia povrchových molekúl a cytokínov DC ošetrených AECCD bola regulovaná pomocou NF-KB po tom, čo boli nezrelé DC vopred ošetrené inhibítorom NF-KB PDTC stimulované AECCD počas 12 hodín, hladiny expresie kostimulačných molekúl a cytokínov sa merali pomocou prietokový cytometer. Hladiny CD40, CD80 CD86 a MHC-II vyvolanéAECCDboli významne znížené v porovnaní s neliečenou kontrolou blokovaním dráh NF-κB zodpovedajúcimi inhibítormi (P < 0.001,="" obr.="" 10a–d).="" súčasne="" bola="" expresia="" ifn-,="" tnf-="" a="" il-6="" tiež="" významne="" inhibovaná="" pdtc="" (p="">< 0,05,="" obr.="">

4. Diskusia

V súčasnosti sa skúmali rôzne polysacharidy z TCM ako adjuvans pre ľudské a zvieracie vakcíny (Sun et al., 2018; Rey-Ladino et al., 2011). V tejto štúdii,imúnny-modulačné účinky AECCD a primárny aktivačný mechanizmus DC boli skúmané in vivo a in vitro sériou experimentov, aby sa vyhodnotila adaptívna imunitná odpoveď proti OVA a stav aktivácie DC. Experimenty in vivo ukázali, že AECCD pozoruhodne podporuje produkciu OVA-špecifických izotypov IgG a IgG, zvyšuje proliferáciu splenocytov a indukuje aktiváciu T buniek a cytokínov (IL-4/IFN-). okrem tohoAECCDzlepšilo zrenie DC a vykazovalo znížené Tregs. Tieto zistenia naznačujú, že funkcia AECCD ako účinného adjuvans bola realizovaná podporou dozrievania DC a inhibíciou Tregs. Experimenty in vitro ukázali, že AECCD podporovalo fenotypové dozrievanie DC, cytokínovú sekciu a alostimulačnú aktivitu prostredníctvom NF-κB dráhy súvisiacej s TLR{0}}. Tieto experimentálne výsledky ukázali, že AECCD má významný potenciál ako stimulátor posilňujúci imunitu.

Každý adjuvans je jedinečnýimúnnycharakteristiky proti rôznym antigénom, čo naznačuje, že adjuvans majú aplikačný potenciál pri rôznych ochoreniach. Po prvé, adjuvantné vlastnosti spoločného podávania AECCD s OVA sa testovali stanovením ich účinkov na adaptívnu imunitnú odpoveď u myší. Mnohé štúdie ukázali, že imunostimulačné aktivity boli priamo úmerné dávke v určitom rozmedzí (Li a kol., 2020; Reed a kol., 2020; Zhang a kol., 2017). Podobne v štúdii analýza protilátky a izotypu odhalila, že AECCD v určitom rozsahu dávok zosilňovalo OVA-špecifické odpovede IgG, IgG1 a IgG2a a že stredná dávka AECCD bola optimálnou dávkou. V nasledujúcich experimentoch sme skúmali najmä stimulačný účinok AECCD pri optimálnej strednej dávke. Stredná dávkaAECCDvýznamne zvýšilo reakciu proliferácie splenocytov u imunizovaných myší, čo naznačuje, že AECCD podporoval bunkuimúnnyreakcie proti OVA. Tieto výsledky naznačujú, že AECCD zvýšilo humorálne aj bunkové imunitné reakcie, ktoré súviseli s adjuvantným potenciálom.

cistancherecenzieoimunita

Vyvolaná podstatná aktivita T-buniek môže viesť k eradikácii ochorenia. Počas animúnnyaktivované T bunky môžu dosiahnuť sekundárne lymfoidné tkanivá, vrátane sleziny a lymfatických uzlín (Steinman, 2012). Stredná dávkaAECCDúčinne zlepšila účinnosť vakcíny, pretože by mohla významne zvýšiť reakcie T buniek CD4, CD8, CD44 a CD62L v drenážnych lymfatických uzlinách a slezine. Aktivované CD8 T bunky sprostredkovali eradikáciu patogénu sekréciou IFN-. Proliferované CD4 T bunky boli diferencované na Th1 bunky a Th1 bunky. Th1 bunky vylučovali Th1 cytokín na stimuláciu proliferácie lymfocytov a Th2 bunky vylučovali Th2 cytokín na zvýšenie produkcie protilátok (Seder et al., 2008). V štúdii sa hladiny CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- a CD8 plus IFN- zvýšili pomocou AECCD pri strednej dávke. AECCD vyvolalo vyváženú Th1/Th2 odpoveď a usmerniloimúnnyodpoveď zmenou cytokínovej siete.

Adjuvans by malo indukovať špecifickú imunitu a kontrolovať výsledok imunitnej odpovede reguláciou stavu DC v mnohých bodoch (Carrera Silva et al., 2013). Expresia povrchových molekúl na DC je kľúčovým ukazovateľom pre hodnotenie dozrievania DC a typicky koreluje s diferenciáciou T lymfocytov (Steinman, 2012). V tejto štúdii AECCD zosilnil expresiu kostimulačných molekúl a uľahčil dozrievanie DC, keď sa použil ako adjuvans proti OVA. Toto môže byť jeden zo spôsobov, ako AECCD podporoval humorálne a bunkovéimúnnyodozvy. medzitýmAECCDtiež znížila frekvenciu CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs, čo poskytlo vyváženú imunitu po očkovaní. Naše výsledky podporili nedávne zistenia, že rôzne polysacharidy z TCM boli regulátorom dozrievania DC (Bo a kol., 2019; Li a kol., 2015; Zhu a kol., 2016).

Aktivácia adaptívnehoimúnnyreakcie polysacharidových adjuvancií sú sprostredkované predovšetkým ich rozpoznávaním špecifickými receptormi DC (Akira, 2004). DC aktivované prostredníctvom dráh súvisiacich s TLR4- môžu vylučovať rôzne imunomodulátory ako kritický mediátor proti infekciám (Akira, 2007). Preto sme v nasledujúcich experimentoch predbežne preskúmali molekulárny mechanizmus stimulačného účinku AECCD na DC in vitro. Aby sa mohla pozorovať cytotoxicita AECCD, bola najprv stanovená životaschopnosť buniek DC a splenocytov z myší. AECCD pri 10–1600 ug/ml nevykazoval žiadnu cytotoxicitu voči DC a splenocytom. Aby sme vylúčili kontamináciu LPS, AECCD sme vopred ošetrili PMB. Hladiny expresie CD40, CD80 CD86 a MHC-II v DC ošetrených AECCD neboli znížené, ale PMB účinne inhibovalo expresiu kostimulačných molekúl v DC ošetrených LPS. To preukázalo, že AECCD neobsahovala kontamináciu endotoxínmi. Ďalej sa ďalej skúmal stav aktivácie DC. Podobne ako DC ošetrené LPS, spôsobom závislým od dávky,AECCD-liečené DC zvýšili hladiny CD40, CD80 CD86 a MHC II, ako aj produkciu prozápalového cytokínu, ktorý bol parametrom funkčného dozrievania DC. V MLR sa hodnotila schopnosť proliferácie alogénnych T buniek v DC ošetrených AECCD. AECCD môže aktivovať a aktivovať alogénne T bunky. DC boli najprv vopred ošetrené mitomycínom C a potom dôkladne premyté, aby sa odstránilo toto činidlo, takže účinky AECCD na DC sa pravdepodobne nepripisovali mitogénnej aktivite. Experimentálne údaje odhalili, že fenotypové dozrievanie a funkčná aktivácia DCs možno pripísať stimulácii z AECCD.

Množstvo polysacharidov TCM môže stimulovať dozrievanie DC prostredníctvom TLR4. NF-κB ako člen TLR4-súvisiacej downstream dráhy hrá dôležitú úlohu pri regulácii fenotypového a funkčného dozrievania DC a indukcii expresie rôznych génov zapojených doimúnnyodpovede (Qi a kol., 2016; Re a Strominger, 2001; Wei a kol., 2016; Zhu a kol., 2013). Prostredníctvom in vitro experimentov sme zistili, že AECCD podporovalo dozrievanie DC a že TAK-242 (inhibítor TLR4) a PDTC (inhibítor NF-κB) znížili hladiny expresie CD40, CD80, CD86 a MHC -II a hladiny sekrécie IFN-, TNF- a IL-6 na DC ošetrených AECCD. Tieto zistenia ukázali, že TLR4 a NF-KB sa podieľali na aktivácii DC indukovanej AECCD a sekrécii cytokínov. Tieto výsledky boli v súlade s predtým hlásenými štúdiami, pretožeAECCDako adjuvans zlepšilo zacielenie antigénu na DC.

V súhrne naše výsledky ukázali, že AECCD vyvolalo trvalé a Th1/Th2 reakcie, najmä sprostredkované T-bunkamiimúnnyodpoveď proti OVA. AECCD aktivovalo DC prostredníctvom TLR4-sprostredkovanej NF-κB dráhy, čím sa zvýšila produkcia imunomodulátorov a alogénna proliferácia T buniek. AECCD sa môže použiť ako účinné adjuvans pri vývoji vakcín. Vykoná sa však presná analýza komponentov, aby sa určilo, ktorý komponent je súčasťouAECCDaktivované DC. So zameraním na mechanizmy týkajúce sa toho, ako AECCD zvyšuje imunogenicitu, vrátane optimalizácie adjuvantných formulácií a spôsobu podávania vakcíny, budeme ďalej skúmať imunomodulačné zložky a špecifické adjuvantné vlastnosti AECCD za účelom navrhovania účinných vakcínových adjuvans proti infekčným ochoreniam.

cistanchezlepšiťimunita