Golgi Alpha1,2-Manozidáza IA podporuje účinnú degradáciu NKCC2 spojenú s endoplazmatickým retikulom

Abstraktné

Mutácie v apikálne umiestnenom obličkovom kotransportéri Na-K-2Cl NKCC2 spôsobujú Bartterov syndróm typu I, život ohrozujúcu poruchu obličiek. Predtým sme ukázali, že transport z ER predstavuje limitujúcu fázu v ceste NKCC2 na bunkový povrch. Napriek tomu je veľmi málo známe o zložkách kontroly kvality ER špecifických pre NKCC2 a jeho mutanty spôsobujúce ochorenie. Tu uvádzame identifikáciu Golgiho alfa1, 2-manozidázy IA (ManIA) ako nového väzobného partnera nezrelej formy NKCC2. Interakcia ManIA s NKCC2 prebieha hlavne v cis-Golgiho sieti. Koexpresia ManIA znížila celkové množstvo proteínu NKCC2, zatiaľ čo knockdown ManIA vyvolal opačný účinok. Dôležité je, že koexpresia ManIA mala hlbší účinok na skladacie mutanty NKCC2. Cykloheximidový chase test ukázal, že v bunkách nadmerne exprimujúcich ManIA je stabilita a dozrievanie NKCC2 silne narušené. Vymazanie cytoplazmatickej oblasti ManIA zoslabilo jeho interakciu s NKCC2 a inhibovalo jeho účinok na dozrievanie kotransportéra. ManIA-indukované zníženia expresie NKCC2 boli kompenzované inhibítorom proteazómu MG132. Podobne liečba kifunenzínom výrazne znížila účinok ManIA, čo silne naznačuje, že orezávanie manózy sa podieľa na zvýšenom ERAD kotransportéra. Okrem toho zbavenie ManIA jej katalytickej domény úplne zrušilo jej účinok na NKCC2. V súhrne naše údaje demonštrujú prítomnosť ManIA-sprostredkovanej ERAD dráhy v obličkových bunkách, ktorá podporuje zadržiavanie a degradáciu chybne zložených proteínov NKCC2. Navrhujú model, v ktorom Golgi ManIA prispieva k ERAD NKCC2 podporovaním retencie, recyklácie a ERAD nesprávne poskladaných proteínov, ktoré spočiatku unikajú dohľadu nad kontrolou kvality proteínov v rámci ER.

Kľúčové slová

obličky; NKCC2; kontrola kvality bielkovín; ERAD; Golgi; alfa1,2-manozidáza IA; membrána; obchodovanie s ľuďmi; Bartterov syndróm; hypertenzia

Kliknutím sem sa dozviete o výhodách Cistanche

Úvod

Rovnováha sodíka a jeho regulácia obličkami prostredníctvom regulácie extracelulárneho objemu je kľúčovým determinantom dlhodobej kontroly krvného tlaku (BP), ako ilustrujú zriedkavé monogénne syndrómy ovplyvňujúce renálne zaobchádzanie so soľou a značne meniace TK [1, 2]. Hoci k patogenéze a udržiavaniu zvýšenia krvného tlaku prispieva niekoľko faktorov, predpokladá sa, že primárnu úlohu zohrávajú obličkové mechanizmy, ako pôvodne predpokladal Guyton [1]. Hrubá vzostupná vetva Henleho kľučky (TAL) obličky je zodpovedná za reabsorpciu 20–30 percent filtrovanej záťaže NaCl [3–5]. Na molekulárnej úrovni je reabsorpcia TAL Na-Cl sprostredkovaná luminálnym Na-K-2Cl kotransportérom NKCC2 [5]. V dôsledku toho má transportná funkcia NKCC2 značný vplyv na konečné vylučovanie solí močom, čo následne ovplyvňuje dlhodobú rovnováhu sodíka v krvi [3,5]. V dôsledku toho dedičné variácie kotransportéra a/alebo jeho regulátorov ovplyvňujú BP u ľudí [3,6–8]. Inaktivácia NKCC2 skutočne spôsobuje Bartterov syndróm typu I (BS1), život ohrozujúce ochorenie obličiek s nízkym TK spolu s elektrolytovými abnormalitami [9], zatiaľ čo zvýšená aktivita kotransportéra je spojená s vysokým TK [2,10– 13]. Okrem toho v niekoľkých zvieracích modeloch hypertenzie citlivej na soľ [14,15] je expresia proteínu NKCC2 zvýšená a prispieva k rozvoju hypertenzie. Okrem svojej úlohy v homeostáze BP je aktivita NKCC2 tiež nevyhnutná pre reguláciu vodnej bilancie [5,16]. Na podporu tejto predstavy inaktivácia NKCC2 u pacientov s BS1 a BS5 spôsobuje rozvoj ťažkej polyúrie [7,8,17]. Navyše zhoršená schopnosť koncentrovať moč starnúcich obličiek sa prinajmenšom čiastočne pripisuje zníženej hladine proteínu NKCC2 [18,19]. Je potrebné zdôrazniť, že vo všetkých zvieracích modeloch hypertenzie a starnutia sa zdá, že NKCC2 je regulovaný hlavne posttranslačnými mechanizmami [5,16,19], čo preto zdôrazňuje potrebu študovať faktory regulujúce biogenézu a obchodovanie s NKCC2. Napriek tomu naše znalosti o molekulárnych mechanizmoch, ktoré sú základom intracelulárneho obchodovania s divokým typom a mutovaných proteínov NKCC2 v bunkách cicavcov, najmä jeho regulácia interakciou proteín-proteín, zostali veľmi slabé. Okrem toho sa veľká väčšina predchádzajúcich správ sústredila hlavne na post-Golgiho reguláciu kotransportéra, najmä fosforyláciou [20–22], a preto je dnes veľmi málo známe o regulácii transportérov na ER a pred Golgiho úrovni.

Aby NKCC2 fungoval správne, musí byť správne zacielený na apikálny bunkový povrch a musí byť dostatočne exprimovaný, aby umožnil TAL bunkám prispôsobiť sa fyziologickým alebo patologickým výzvam [3,23]. Ako všetky transmembránové proteíny, príprava na vhodný prenos NKCC2 do bunkovej membrány začína, keď sa kotransportérový proteín syntetizuje v endoplazmatickom retikule (ER) a pokračuje, keď proteín prechádza cez Golgiho sieť [24,25]. Podobne, podobne ako prakticky všetky proteíny určené pre plazmatickú membránu, aj proteíny NKCC2 translokované do endoplazmatického retikula (ER) podliehajú kontrole kvality, takže sekrečnou dráhou sa pohybujú iba zložené proteíny [26,27]. Kontrola skladania proteínov v ER často súvisí s N-glykozyláciou, posttranslačnou modifikáciou iniciovanou kovalentnou väzbou špecifického oligosacharidu (Glc3Man9GlcNAc2) na vznikajúci proteín [28,29]. Akonáhle je tento oligosacharid prenesený, nasleduje niekoľko po sebe idúcich krokov dozrievania proteínu pozdĺž sekrečnej dráhy [28,30]. Po odstránení troch glukózových zvyškov a začiatku orezávania manózy v ER, ako súčasť procesu kontroly kvality, sú správne poskladané proteíny prenesené do Golgiho aparátu na zrenie [26,28]. N-glykány s vysokým obsahom manózy sa potom ďalej upravujú špecifickými manozidázami, ako sú Golgiho 1,2-manozidázy v cis-Golgi [31,32]. Pridanie GlcNAc, galaktózy, kyseliny sialovej a fukózových cukrov vytvára hybridné a komplexné N-glykány v mediálnom a trans-Golgiho kompartmente [33,34]. Následne sú zrelé N-glykozylované proteíny zamerané na ich konečné miesto určenia. Keď proces skladania zlyhá, koncové manózové zvyšky z jadrovej glykánovej štruktúry sa postupne orezávajú a defektné proteíny sa translokujú cez membránu na degradáciu cytosolického proteazómu prostredníctvom mechanizmov známych ako ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation [26,35]). Zostávajúce aberantné proteíny, ktoré môžu tvoriť agregáty alebo ich nemožno detegovať chaperónmi ERAD, sa dodávajú do lyzozómov na odstránenie prostredníctvom dráh, ktoré sa súhrnne nazývajú ER-page [36,37]. Napriek tomu niektoré chybne poskladané proteíny môžu stále uniknúť z ER a postúpiť do Golgiho aparátu, kde sú podrobené Golgiho kontrole kvality (GQC) a cielené na lyzozóm alebo proteazóm na degradáciu [38]. Divoký typ aj mutantné varianty transmembránových proteínov sú náchylné na kontrolu kvality a degradáciu ER. Najlepším príkladom je proteín chloridového kanála CFTR (transmembránový regulátor vodivosti cystickej fibrózy), charakterizovaný ako prvý integrálny membránový cicavčí ERAD substrát [39,40]. Za normálnych podmienok je prostredníctvom ERAD degradovaných až 70 percent CFTR divokého typu [39,40]. Ešte pôsobivejšie je, že delécia fenylalanínu 508 (∆F508), mutácia CFTR zodpovedná za cystickú fibrózu, znižuje účinnosť skladania, čo vedie k tomu, že takmer 99 percent mutantného CFTR je degradovaných skôr, ako sa dostane na plazmatickú membránu [39,40]. Podobne ako v prípade CFTR a niekoľkých ďalších transmembránových proteínov, ako sú HERG [41], ROMK [42] a NCC [43], sme predtým ukázali, že väčšina novosyntetizovaných proteínov NKCC2 bola zachytená v ER a určená na degradáciu, proces ktorá zahŕňa hlavne proteazómovú dráhu [44–46]. ERAD začína detekciou nesprávne poskladaného proteínu molekulárnymi chaperónmi [47]. Typ chaperónov zapojených do tohto procesu závisí hlavne od polohy skladacej lézie substrátu, ktorá sa môže vyskytnúť buď v ER lúmene, ER membráne alebo cytoplazme [27,47]. V dôsledku toho boli navrhnuté tri rôzne dráhy ERAD ako ERAD-L (ERAD substrátov s nesprávne poskladanými léziami v lúmene ER), ERAD-M (membrána) a ERAD-C (cytoplazma) [27,47,48]. Napríklad ERAD vznikajúceho CFTR zahŕňa cytoplazmatické aj ER luminálne chaperóny [49]. Podobne NCC, ďalší transmembránový proteín, zapája niekoľko cytoplazmatických chaperónov pre svoj ERAD [43,50]. Podobne ako súvisiaci elektroneutrálny NCC špecifický pre obličky, NKCC2 má 12 transmembránových oblastí, dve veľké cytoplazmatické domény a veľkú exofaciálnu slučku exponovanú ER [5]. Pretože NKCC2 obsahuje domény v ER a cytoplazme, je mysliteľná interakcia kotransportéra s ER molekulovými chaperónmi na oboch stranách alebo na oboch stranách ER membrány. Okrem toho, vzhľadom na to, že C-terminálna doména NKCC2 je predominantnou cytoplazmatickou oblasťou [5], je pravdepodobné, že je hlavným miestom interakcie proteín-proteín, a preto zohráva rozhodujúcu úlohu v biogenéze a prenose kotransportéra. V súlade s touto predstavou sme predtým identifikovali niekoľko väzbových partnerov C-konca NKCC2 [46,51–53]. Spomedzi nich sme ukázali, že aldoláza B a SCAMP2 sa viažu na C-koniec NKCC2 na post-Golgiho úrovni a regulujú subcelulárnu redistribúciu kotransportéra [51,52]. Nedávno sme poskytli dôkaz, že STCH, Hsp70 a proteín-lektín OS9 interagujú s nezrelou formou NKCC2 hlavne na ER, aby regulovali jeho degradáciu spojenú s ER [46,53]. V tejto správe popisujeme novú interakciu proteín-proteín medzi C-koncovým chvostom NKCC2 a Golgiho 1,2-manozidázou IA (Golgi ManIA, tiež nazývanou Man9-manozidáza), všadeprítomným proteínom, ktorý patrí do rodiny I. triedy -1,2 manozidáz, ktorá zahŕňa ER-manozidázu I (MAN1B1) a dve ďalšie Golgiho 1,{106}manozidázy, Golgiho-manozidázu IB [MAN1A2] a Golgiho-manozidázu IC [MAN1C1] [31,54–56]. Je zaujímavé, že narastajúce množstvo dôkazov naznačuje, že -1,2-manozidázy sa podieľajú nielen na skladaní a dozrievaní proteínov, ale zohrávajú kľúčovú úlohu aj pri degradácii nesprávne poskladaných proteínov [57–60]. Tu ukazujeme, že ManIA interaguje s nezrelou formou NKCC2 hlavne v sieti cis-Golgi a podporuje jej degradáciu proteazómovou dráhou, čím sa odhaľuje ďalší kontrolný bod pri sledovaní a odstraňovaní nesprávne zložených proteínov NKCC2. V dôsledku toho môžu tieto zistenia otvoriť nové cesty pri štúdiu kontroly kvality ER a Golgiho proteínov NKCC2, aby pomohli pri vývoji nových stratégií na prevenciu a / alebo liečbu porúch obličiek súvisiacich s aberantným obchodovaním a expresiou NKCC2.

Doplnok Cistanche

Materiály a metódy

1. Kvasinkový dvojhybridný test

Kvasinkový dvojhybridný (Y2H) skríning sa uskutočnil tak, ako už bolo podrobne opísané [51], pričom sa ako návnada použila proximálna oblasť C-konca NKCC2 (zvyšky 661–1095). Stručne, AH109 exprimujúca návnadu bola spárovaná s kvasinkovým kmeňom Y187 transformovaným s knižnicou cDNA ľudskej obličky. Na selekciu pozitívnych klonov kódujúcich domnelé interagujúce proteíny boli spárované kvasinkové bunky najskôr pestované na selekčných platniach s nízkou prísnosťou (−Leu, −Trp, −His) a potom na doštičkách s vysokou prísnosťou (−Leu, −Trp, −His, − Ade). Vybrané kolónie sa tiež testovali na -galaktozidázovú aktivitu a DNA z pozitívnych klonov sa izolovala z kvasinkových buniek pomocou súpravy na izoláciu kvasinkových plazmidov RPM (BIO 101 Systems). Po záchrane plazmidov koristi transformáciou do baktérií DH5 (Invitrogen) a izoláciou pomocou súpravy Qiagen boli plazmidy cDNA sekvenované a hodnotené pomocou programu BLAST.

2. Konštrukcia plazmidu a miestne riadená mutagenéza

Generovanie WT Myc-NKCC2, neglykozylovaného Myc-NKCC2 ((N442Q/N452Q) a WT EGFP-NKCC2 už bolo opísané [45,46,51] Myšia kódujúca sekvencia ManIA bola subklonovaná do cicavčieho expresného vektora pcDNA3.1/V5 (Invitrogen, Paríž, Francúzsko) na generovanie konštruktu WT ManIA-V5 Plazmid obsahujúci ManIA bez C-koncového konca (ManIA-∆Cter) sa generoval prostredníctvom amplifikácie z expresného konštruktu WT MAnIAV5 s použitím priameho priméru 50 CCGGAGCGATGAAGTTCGTGCTGCTGC 30 a reverzného priméru 50 TTTCTCTTTGCCATCAATTTC 30. Konštrukt obsahujúci ManIA zbavený svojej N-koncovej oblasti (ManIA-∆Nter) sa generoval aj z plazmidu WT MAnIA-V5 metódou miestne cielenej mutagenézy QuikChange (Stratagene, Les Ulis, Francúzsko) s použitím dopredného priméru CACTGAATGATGTAGGAAAGATAGGG 3 0 a reverzný primér 50 ATTCCAAGCATGGGTCATCTACTCTTTGATCTTTGCCCTC 30. Všetky mutácie a skrátenia boli potvrdené sekvenovaním.

3. Bunková kultúra

Obličkové bunky vačice (OKP bunky) sa udržiavali v DMEM (Gibco 42430) doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom (Eurobio, Les Ulis, Francúzsko), penicilínom (100 U/ml) a streptomycínom (100 U/ml) pri 37 ◦ C vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 percent CO2. Bunky ľudskej embryonálnej obličky (HEK) 293 sa pestovali v médiu DMEM doplnenom 10 percentami fetálneho hovädzieho séra a 1 percentom penicilínu/streptomycínu. Na transfekciu plazmidovej DNA sa bunky pestovali do 60 až 70 percent konfluencie a potom sa prechodne transfekovali počas 5 hodín pomocou súpravy Lipofectamine plus podľa pokynov výrobcu (Invitrogen, Paríž, Francúzsko). Pre experimenty s degradáciou proteínov boli bunky ošetrené MG132 (2 uM) alebo chlorochínom (100 uM) 6 hodín pred lýzou buniek, ako bolo opísané vyššie [53,61]. 6 hodín pred lýzou buniek sa použil kifunenzín (Sigma k1140, Saint-Quentin-Fallavier, Francúzsko) v koncentrácii 25 uM.

4. Príprava proteínu, imunoblotovanie a imunoprecipitácia

Po transfekcii sa bunky premyli studeným PBS a potom sa solubilizovali v lyzovacom pufri obsahujúcom 120 mM Tris/Hepes, pH 7,4; 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 3 mM KCI; 1 percento (v/v) Triton X-100 a inhibítory proteázy (Complete Roche 1697498, Meylan, Francúzsko). Vzorky sa potom odobrali a centrifugovali pri 16,{{10}} otáčkach za minútu počas 15 minút pri 4 °C. Na imunoprecipitáciu boli bunky solubilizované lyzačným pufrom obsahujúcim 0,4 M NaCl; 1,5 mM MgCl2; 10 mM Hepes, pH 7,9; 5 percent (v/v) glycerolu; 0,5 percenta (v/v) Nonidet P-40) a inhibítory proteázy (Complete, Roche Diagnostics). Imunoprecipitácia sa uskutočnila s použitím anti-V5 (Invitrogen) alebo anti-ManIA (Sigma) protilátky a afinitná purifikácia s použitím guľôčok s proteínom G-agarózy (Dynabeads, Invitrogen, Paríž, Francúzsko). Po inkubácii s guľôčkami proteín G-agarózy počas 1 hodiny pri teplote miestnosti sa imunokomplex premyl v PBS (Invitrogen). Proteínové vzorky sa potom povarili v nanášacom pufri, spustili sa na gradiente 7,5 percenta alebo 10 percent alebo 15 percent SDS-polyakrylamidových gélov a sondovali sa s primárnymi požadovanými protilátkami a sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou. Proteíny boli vizualizované zvýšenou chemiluminiscenčnou detekciou (Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, Francúzsko) podľa pokynov výrobcu.

5. Imunocytochémia

Dvadsaťštyri až štyridsaťosem hodín po transfekcii sa konfluentné bunky premyli PBS plus plus (pH 8, 1 mM MgCl2 a 0,1 mM CaCl2). Bunky sa potom fixovali s 2 percentami paraformaldehydu v PBS počas 2 0 minút pri teplote miestnosti a potom sa inkubovali s 50 mM NH4CI a permeabilizovali s 0,1 percentami Triton X-100 počas 1 minúty. Aby sa zablokovala žiadna špecifická protilátková väzba, bunky sa inkubovali s DAKO (riedidlo protilátky so zložkami redukujúcimi pozadie) počas 30 minút. Fixované bunky sa inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s primárnou požadovanou protilátkou. Primárne protilátky použité v tejto štúdii sú nasledovné: myšie anti-V5 (Invitrogen, Paríž, Francúzsko), myšie anti-Myc (Takara, Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Francúzsko), potkanie anti-V5 (Abcam, Paríž, Francúzsko), králičie anti-Calnexin (Abcam), králičie anti-Giantin (Abcam), králičie anti-GM130 (Abcam), králičie anti-ManIA (Abcam), Sekundárne použité protilátky sú nasledovné: kozia anti-králičia Alexa Fluor 555 (Invitrogen), kozí anti-králičí Alexa Fluor 488 (Invitrogen), kozí anti-králičí FITC (DakoCytomation, Trappes, Francúzsko), kozí antimyší Texas červený (Invitrogen), kozí anti-krysí Alexa Fluor 555 (Invitrogen), koza anti-potkania Alexa Fluor 488 (Invitrogen), Alexa Texas Red konjugovaný anti-myší (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK), kuracie anti-myšie Alexa Fluor 647 (Invitrogen). Po inkubácii s primárnymi a sekundárnymi protilátkami, ktoré sú predmetom záujmu, boli bunky potom premyté PBS a pripevnené pomocou Vectashield.

Bylinka Cistanche

6. Cykloheximid-chase testy

Na monitorovanie stability a dozrievania NKCC2 sa k bunkám OKP alebo HEK 14 až 16 hodín po transfekcii plazmidmi NKCC2 pridal cykloheximid v koncentrácii 100 uM. Počas obdobia sledovania sa bunkové lyzáty zbierali 0, 1, 2 a 4 hodiny po ošetrení cykloheximidom a analyzovali sa imunoblotovaním.

7. Knockdown siRNA

ManIA siRNA boli zakúpené od Dharmacon ako ON-TARGET plus SMART pools (L-012174-00-0005). Bunky HEK boli najskôr transfekované kontrolnými alebo špecifickými siRNA ManIA s Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) s použitím špecifikácií výrobcu, ako bolo uvedené vyššie [46,53]. Jeden deň po transfekcii siRNA boli bunky transfekované plazmidmi NKCC2. Po 24 až 48 hodinách sa bunkové lyzáty analyzovali na každý proteín pomocou uvedených protilátok.

8. Štatistické analýzy

Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SE. Rozdiely medzi priemermi sa hodnotili pomocou párových alebo nepárových t-testov alebo ANOVA podľa potreby. p < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.

Diskusia

Táto štúdia sa uskutočnila s cieľom získať prehľad o molekulárnych mechanizmoch, ktoré sú základom regulácie degradácie spojenej s ER počas biogenézy NKCC2. Pomocou kvasinkovej dvojhybridnej analýzy a koimunoprecipitačných testov sme identifikovali GolgiMannozidázu IA ako nového väzbového partnera NKCC2. Asociácia implikuje iba nezrelú a vysoko manózovú glykozylovanú formu kotransportéra a prebieha hlavne v cis-Golgiho sieti. Zistili sme, že knock-down ManIA zvyšuje množstvo proteínu NKCC2, zatiaľ čo jeho nadmerná expresia má opačný účinok. Koexpresia ManIA narušila dozrievanie NKCC2 podporou jeho retencie, recyklácie do ER a degradácie prostredníctvom proteazómovej dráhy. Dôležité je, že skladacie mutanty NKCC2 sú náchylnejšie na dráhu ERAD sprostredkovanú ManIA. Tieto zistenia môžu pomôcť lepšie pochopiť, ako abnormality v obchodovaní s proteínmi NKCC2 vedú k Bartterovmu syndrómu, ktorý je nevyhnutný na objasnenie patofyziológie BS1 a na zlepšenie dostupných liečebných postupov.

Teraz je jasne preukázané, že orezávanie manózy triedou I 1,2-manozidázami je zapojené do štádia rozpoznávania ERAD glykoproteínov, pretože tento proces je značne redukovaný ich inhibítormi 1-deoxymannojirimycín a kifunenzín [67, 70 – 73]. Pôvodne sa na základe štúdií uskutočnených hlavne na kvasinkách predpokladalo, že tieto zlúčeniny bránia ERAD inhibíciou ER 1,2-manozidázy I, ktorá primárne štiepi manózu zo strednej B vetvy Man9 za vzniku Man8, glykánového signálu. navrhol začať ERAD [70,74]. V cicavčích bunkách však táto hypotéza nemusí byť nevyhnutne správna vzhľadom na to, že kifunenzín aj 1-deoxymannojirimycín tiež inhibujú Golgiho 1,2-manozidázy. Okrem toho pribúdali dôkazy v bunkách cicavcov, ktoré dokazujú, že ďalšie orezávanie troch až štyroch 1,{16}}prepojených manózových zvyškov za vzniku Man6GlcNAc2 (M6) alebo Man5GlcNAc2 (M5), prispieva tiež k spusteniu degradácie nesprávne poskladaných glykoproteínov [ 32,75-77]. Nebolo však jasné, ktorá 1,2-manozidáza je zodpovedná za toto dodatočné orezanie. Jedným z kandidátov je samotná ER a 1,{29}}manozidáza I, pretože jej nadmerná expresia vedie k zvýšenému orezávaniu manózy a zrýchleniu ERAD [78–80]. Ďalšími možnými kandidátmi by mohli byť proteíny podobné manozidáze (EDEM) zvyšujúce degradáciu ER, pretože sa uvádza, že EDEM1 aj EDEM3 stimulujú orezávanie manózy a urýchľujú glykoproteín ERAD, keď sú nadmerne exprimované v bunkách [81,82]. Ďalším možným kandidátom by mohla byť Golgi manozidáza IA, ktorá upravuje Man9 na Man6 a Man5 [31,54]. Ukázalo sa, že tento enzým a dve ďalšie Golgiho 1,2 manozidázy (IB a IC) zvyšujú degradáciu a orezávanie manózy substrátu ERAD-L, NHK 1-antitrypsínu, keď sú nadmerne exprimované v kultivovaných bunkách [57]. V tejto štúdii sme preukázali špecifickú interakciu ManIA s NKCC2, obličkovým transmembránovým proteínom. Dôležité je, že sme demonštrovali, že asociácia ManIA in vivo zahŕňa iba nezrelú formu kotransportéra. Najdôležitejšie je, že sme poskytli dôkaz, že väzba ManIA sa podieľa na retencii a degradácii NKCC2 spojenej s ER.

Kapsuly Cistanche

Predtým sme poskytli dôkaz, že ERAD a export z ER predstavujú významný regulátor dozrievania NKCC2 a expresie na povrchu buniek [8,44–46]. V skutočnosti sme preukázali, že väčšina novo syntetizovaných proteínov NKCC2 je zameraná na degradáciu spojenú s ER zahŕňajúcu proteazómové a lyzozómové dráhy [8, 44–46, 53]. Okrem toho sme ukázali, že STCH a proteín lektín OS9 sa podieľajú na týchto procesoch interakciou s nezrelou formou NKCC2 hlavne na ER [46,53]. Podobne ako v prípade OS9 a STCH sa zapojenie ManIA do ERAD kotransportéra prvýkrát navrhlo v súčasnej štúdii pomocou koimunoprecipitačných testov, ktoré odhaľujú, že spojenie proteínov zahŕňa iba nezrelú formu NKCC2. Je potrebné poznamenať, že delécia cytoplazmatického konca ManIA znížila, ale nie úplne inhibovala jeho interakciu s NKCC2, čím sa otvorila možnosť interakcie kotransportéra s inými oblasťami proteínu ManIA. Okrem toho, napriek interakcii ManIA iba s jadrovou glykozylovanou a nezrelou formou NKCC2, naše imunocytochemické štúdie odhalili, že ManIA sa nelokalizuje s NKCC2 na ER. V tejto súvislosti stojí za zmienku, že ManIA bola hlásená buď v Golgiho, alebo v ER [31,83–85]. Iná nezávislá štúdia uvádza, že manozidáza IA sa môže nachádzať aj vo vezikulách kontroly kvality [58]. V dôsledku toho, pretože bunková distribúcia ManIA môže závisieť od typu bunky, uskutočnili sme našu štúdiu v dvoch rôznych obličkových bunkových líniách, OKP a HEK bunkách. Lokalizačné štúdie uskutočnené v týchto bunkách jasne ukázali, že ManIA je exprimovaný v Golgiho aparáte v oboch bunkových líniách a odhalili, že miestom interakcie s kotransportérom je cis-Golgiho sieť. Je potrebné poznamenať, že vzhľadom na to, že N-glykán glykoproteínov na vstupe do Golgiho aparátu je stále vysokomanózového typu, je možné, že interakcia NKCC2 s ManIA môže skutočne nastať v cis-Golgiho sieti. Použitím prístupov siRNA a nadmernej expresie sme ukázali, že ManIA interaguje s nezrelým NKCC2, aby podporila jeho degradáciu spojenú s ER. Dôležité je, že účinku ManIA na zrelú formu NKCC2 sa zabránilo, keď sa deletoval cytoplazmatický koniec ManIA. Ešte pôsobivejšie je, že účinok ManIA na nezrelé aj zrelé formy NKCC2 bol úplne zrušený, keď bol enzým zbavený svojej katalytickej domény. Okrem toho sa regulácii NKCC2 pomocou ManIA zabránilo aj v prítomnosti inhibítora proteazómu MG132, ale nie pomocou chlorochínu, inhibítora lyzozomálnej funkcie, čo naznačuje, že ManIA sa zameriava na nezrelú formu kotransportéra na dráhu ERAD závislú od proteazómu. Na ďalšiu podporu úlohy ManIA v ERAD NKCC2 sme testovali aj účinok inhibítora orezávania manózy kifunenzínu. Je zaujímavé, že ošetrenie kifunenzínom inhibovalo účinok ManIA na NKCC2, čo naznačuje, že orezávanie manózy je dôležitým procesom pri degradácii NKCC2 spojenej s ManIA. Účinku ManIA však kifunenzín úplne nezabránil, čo znamená, že aspoň čiastočne pôsobenie ManIA na kotransportér nie je úplne závislé od N-glykánu. Na podporu tejto predstavy mutácie glykozylačných miest NKCC2 úplne neinhibovali účinok ManIA na kotransportér, čo teda potvrdzuje, že aspoň za našich experimentálnych podmienok môže byť časť účinku ManIA nezávislá od N-glykánu. Na podporu tejto myšlienky Ron a kol. poskytol dôkaz, že v podmienkach stresu ER zvýšená expresia EDEM1, ďalšieho proteínu alfa-manozidázy, obchádza proces orezávania manózy a dodáva glykoproteín priamo do neskorých štádií ERAD [86]. V skutočnosti jasne ukázali, že po nadmernej expresii EDEM1 nebola degradácia glykoproteínu H2a blokovaná kifunenzínom [86]. Toto je obzvlášť zaujímavé, pretože naše experimentálne prostredie, tj heterológna nadmerná expresia sekrečných a membránových proteínov (NKCC2) spôsobuje ER stres [87–89], ktorý môže aspoň čiastočne vysvetliť pretrvávanie účinku ManIA, nezávisle od orezávania manózy. , na spoluprepravcu za týchto podmienok. Stojí za zmienku, že zostávajúci účinok ManIA na neglykozylovaný proteín NKCC2 bol úplne blokovaný MG132, čo ďalej potvrdzuje názor, že ManIA podporuje ERAD NKCC2 v dráhe závislej od proteazómu.

Akumulácia nesprávne poskladaných a agregovaných polypeptidov je škodlivá pre bunkové zdravie [90–92]. Väčší počet (viac ako 70) ľudských ochorení vzniká v dôsledku defektov v skladaní sekrečných a membránových proteínov [91,92]. Aby sa zabránilo nesprávnemu poskladaniu proteínov a udržala sa homeostáza proteínov v sekrečnej dráhe, eukaryotické bunky majú viaceré mechanizmy kontroly kvality (QC) [26]. Zahŕňajú kontrolu kvality ER (ERQC) cestou degradácie spojenej s endoplazmatickým retikulom (ERAD) [36,48] a ER-page [93] Golgiho kontrola kvality (QCG) [38] a kontrola kvality plazmatickej membrány (PM) [94 ]. Preto sa nesprávne poskladané proteíny, najmä transmembránové proteíny s komplexnými topológiami, ako je NKCC2, prísne kontrolujú postupnými kontrolnými bodmi kontroly kvality predtým, ako dosiahnu svoje konečné miesto určenia [26,94]. Okrem toho môžu dráhy QC spolupracovať, aby účinne pôsobili proti nesprávnemu poskladaniu jedného proteínu. Napríklad, hoci väčšina nesprávne poskladaných transmembránových proteínov je degradovaná pomocou ERAD, niektoré aberantné proteíny, najmä v podmienkach stresu ER, môžu uniknúť dohľadu ER, aby boli zabalené do vezikúl COPII na anterográdny prenos do Golgiho [95–97]. Dôkazy získané z niekoľkých štúdií podporujú názor, že Golgiho aparát slúži ako kontrolný bod kontroly kvality [26,38] V skutočnosti nesprávne poskladané alebo nezostavené proteíny, ktoré sa vyhýbajú ERAD a ER-page, opúšťajú ER a stávajú sa substrátmi GQC, ktoré sú smerované do vakuoly/ lyzozóm na degradáciu [26,38]. V tomto ohľade je veľmi nepravdepodobné, že GQC dráha zacielená na lyzozómy/vakuoly je mechanizmom, ktorý je základom ManIA-indukovanej down-regulácie NKCC2, vzhľadom na to, že lyzozómový inhibítor chlorochín nezabránil účinku ManIA na kotransportér. Ďalšou možnosťou je, že niektoré nesprávne zložené proteíny vstupujúce do Golgiho aparátu môžu byť po dodaní späť do ER cielené na proteazomálnu degradáciu. Presnejšie povedané, GQC zachytáva uniknuté substráty s najväčšou pravdepodobnosťou v cis-Golgi a cykluje ich späť do ER pre ERAD pomocou proteazómu. Toto je veľmi zaujímavé, pretože sme preukázali, že ManIA sa kolokalizuje s NKCC2 hlavne v sieti cis-Golgi. Okrem toho, na rozdiel od chlorochínu, inhibítor proteazómu MG132 zrušil účinok ManIA na NKCC2, čo teda silne naznačuje, že GQC zacielený na proteazóm je veľmi pravdepodobne hlavnou cestou regulácie NKCC2 pomocou ManIA. Je potrebné poznamenať, že veľmi nedávna štúdia na kvasinkách navrhla, že niektoré nesprávne poskladané proteíny vstupujúce do Golgiho aparátu môžu byť zamerané priamo na proteazomálnu degradáciu bez toho, aby boli cyklované späť do ER, mechanizmus nazývaný EGAD [98]. Aj keď sa nedá vylúčiť tento ďalší mechanizmus, jasne sme ukázali, že pri koexpresii ManIA je NKCC2 do značnej miery zachovaný na ER. Naše údaje teda silne naznačujú, že ManIA podporuje zadržiavanie, recykláciu a ERAD závislý od proteazómu nesprávne zložených proteínov NKCC2, ktoré spočiatku unikajú kontrole kvality ER.

Cistanche tubulosa

Vyčerpávajúce skúmanie mechanizmov, ktoré sú základom mechanizmu ERAD, poskytlo niekoľko nových pohľadov na to, ako ERAD prispieva k ľudskému zdraviu počas normálnych aj chorobných stavov [48,92]. Dôležitosť kontroly kvality ER vo všeobecnosti a najmä fenomén ERAD bol spomenutý pri veľkom počte ľudských patológií, ktoré sa nazývajú konformačné choroby [48,92]. Pokiaľ ide o NKCC2, predtým sme zdokumentovali, že Bartterov syndróm typu 1 patrí medzi choroby spojené s dráhou ERAD [61]. Hoci za stratu funkcie NKCC2 pri chorobe BS1 môžu byť zodpovedné odlišné bunkové dráhy, naše údaje odhalili, že degradácia proteínov spojená s ER je najbežnejším mechanizmom, ktorý podporuje BS1 [61]. Preto je identifikácia proteínov, ktoré sa špecificky viažu na nezrelé formy WT NKCC2 a jeho skladacie mutanty, dôležitá na dešifrovanie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom regulácie ich ERAD. V tejto štúdii sme poskytli dôkaz, že okrem WT NKCC2, ManIA interaguje s nezrelou formou mutantov NKCC2 A508T a Y998X. Okrem toho sme demonštrovali, že koexpresia ManIA má hlbší účinok na NKCC2 skladací mutant A508T v porovnaní s WT NKCC2, čo silne naznačuje, že ManIA môže mať dôležitú úlohu v ERAD mutantov NKCC2 počas BS1. Toto je obzvlášť zaujímavé, pretože sme predtým uviedli, že A508T a Y998X sú zachované na ER [45,61]. Vzhľadom na to, že naše imunolokalizačné experimenty odhalili, že nezávisle od expresného systému je ManIA exprimovaná v cis-Golgiho sieti, interakcia enzýmu s týmito dvoma mutantmi NKCC2 silne naznačuje, že aj keď väčšina A508T a Y998X je do značnej miery zachytená v ER, existuje významný prenos týchto dvoch mutantov z ER do cis-Golgiho, kde môžu byť zachytené ManIA, aby boli dodané späť do ER. V tejto súvislosti Hosokawa a kol. tiež ukázali, že hoci väčšina transfekovaných proteínov NHK je zadržaná v ER, niektoré z nich sa vyhli kontrole kvality ER a dostali sa do cis-Golgiho, kde sú orezané Golgi a 1,2-manozidázami, aby sa zamerali na ERAD [ 57]. Okrem toho niekoľko nedávnych štúdií preukázalo, že ERManI, o ktorom sa pôvodne predpokladalo, že bude fungovať v ER, bol tiež lokalizovaný do Golgiho komplexu v cicavčích bunkách, kde prispieva ku kontrolnému bodu kontroly kvality založenom na Golgi, ktorý uľahčuje spätné získavanie zachytených substrátov ERAD. na ER [59,60,99]. Je potrebné poznamenať, že vzhľadom na to, že podobne ako NKCC2, ManIA je transmembránový proteín, môže tiež prechodne interagovať s kotransportérom na ER, čo umožňuje enzýmu podieľať sa na vytváraní signálu, ktorý sa zameriava na nesprávne poskladané proteíny NKCC2 pre ERAD, buď keď prechádzajú cez ER. alebo na ceste na Golgi.

V súhrne sme zistili, že Golgi ManIA interaguje s nezrelou formou NKCC2 na cis-Golgi, aby podporila jeho ER retenciu a urýchlila jeho ERAD proteazómovou dráhou. Podľa našich najlepších vedomostí ide o prvú štúdiu popisujúcu významnú úlohu Golgiho mechanizmu kontroly kvality v biogenéze NKCC2. Okrem toho je to tiež prvá správa poskytujúca dôkaz, že okrem luminálnych proteínov sa ManIA môže podieľať aj na ERAD transmembránových proteínov. Naše údaje silne naznačujú, že ManIA manévruje v rámci cis-Golgi-lokalizovaného kontrolného bodu kontroly kvality, aby slúžil ako záložný systém pre dohľad ERAD v ER, čím poskytuje výkonnú dodatočnú sieť na adekvátne odstránenie nežiaducich chybne poskladaných proteínov NKCC2, ktoré preto chránia, bunky pred proteotoxicitou spôsobenou tvorbou proteínových agregátov, najmä počas Bartterovho syndrómu. Nepopierateľne, ManIA nemôže fungovať izolovane, aby sprostredkovala ERAD spoluprepravcu. Vhodne možno predpokladať, že ManIA funguje v zhode, postupne alebo súčasne, s inými proteínmi viažucimi NKCC2 a zložkami ERAD, ako sú OS9 [46] a STCH [53] na sprostredkovanie kontroly kvality ER kotransportéra. V tomto ohľade navrhujeme model, v ktorom pri stresových podmienkach ER: (1) OS9 sa podieľa na zadržiavaní nesprávne zložených proteínov NKCC2 na ER a jeho ERAD proteazómom. (2) STCH hrá kľúčovú úlohu v ERAD NKCC2 prostredníctvom proteazómových a lyzozómových dráh. (3) Golgi ManIA prispieva k ERAD NKCC2 tým, že zachytáva nesprávne zložené NKCC2 proteíny, ktoré unikli kontrole kvality ER, a dodáva ich späť do ER. Na odhalenie presného mechanizmu tohto modelu sú potrebné ďalšie experimenty. Dôkladná charakterizácia a identifikácia špecifického molekulárneho zloženia kontrol kvality ER a Golgiho NKCC2 a jeho mutantov spôsobujúcich ochorenie môže poskytnúť základ na definovanie nových terapeutických stratégií zameraných na transport kotransportéra z ER a Golgiho sietí na bunkový povrch.

Referencie

1. Guyton, AC Kontrola krvného tlaku – špeciálna úloha obličiek a telesných tekutín. Veda 1991, 252, 1813–1816. [CrossRef] [PubMed]

2. Lifton, RP; Gharavi, AG; Geller, DS Molekulárne mechanizmy ľudskej hypertenzie. Cell 2001, 104, 545-556. [CrossRef]

3. Castrop, H.; Schiessl, IM Fyziológia a patofyziológia obličkového Na-K-2Cl kotransportéra (NKCC2). Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F991 – F1002. [CrossRef]

4. Greger, R.; Velazquez, H. Kortikálna hrubá vzostupná končatina a skorý distálny stočený tubulus v mechanizme koncentrácie moču. Kidney Int. 1987, 31, 590-596. [CrossRef] [PubMed]

5. Gamba, G. Molekulárna fyziológia a patofyziológia elektroneutrálnych katión-chloridových kotransportérov. Physiol. Rev. 2005, 85, 423–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Ares, GR; Caceres, PS; Ortiz, PA Molekulárna regulácia NKCC2 v hrubej vzostupnej končatine. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2011, 301, F1143 – F1159. [CrossRef] [PubMed]

7. Komhoff, M.; Laghmani, K. Patofyziológia prenatálneho Bartterovho syndrómu. Curr. Opin. Nephrol. Hypertenzia. 2017, 26, 419–425. [CrossRef] [PubMed]

8. Laghmani, K.; Beck, BB; Yang, SS; Seaayfan, E.; Wenzel, A.; Reusch, B.; Vitzthum, H.; Priem, D.; Demarec, S.; Bergmann, K.; a kol. Polyhydramnios, prechodný antenatálny Bartterov syndróm a mutácie MAGED2. N. Engl. J. Med. 2016, 374, 1853–1863. [CrossRef]

9. Šimon, DB; Lifton, RP Molekulárny základ dedičnej hypokaliemickej alkalózy: Bartterov a Gitelmanov syndróm. Am. J. Physiol. 1996, 271, F961 – F966. [CrossRef]

10. Aviv, A.; Hollenberg, NK; Weder, A. Vylučovanie draslíka močom a citlivosť na sodík u černochov. Hypertenzia 2004, 43, 707-713. [CrossRef]

11. Hoorn, EJ; Walsh, SB; McCormick, JA; Furstenberg, A.; Yang, CL; Roeschel, T.; Paliege, A.; Howie, AJ; Conley, J.; Bachmann, S.; a kol. Inhibítor kalcineurínu takrolimus aktivuje renálny kotransportér chloridu sodného, ​​aby spôsobil hypertenziu. Nat. Med. 2011, 17, 1304–1309. [CrossRef] [PubMed]

12. Borschewski, A.; Himmerkus, N.; Boldt, C.; Blankenstein, KI; McCormick, JA; Lazelle, R.; Willnow, TE; Jankowski, V.; Plain, A.; Bleich, M.; a kol. Kalcineurín a receptor súvisiaci s triedením s opakovaniami typu A interagujú, aby regulovali obličkový kotransportér Na(plus)-K(plus)-2Cl(-). J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 107–119. [CrossRef]

13. Trudu, M.; Janas, S.; Lanzani, C.; Debaix, H.; Schaeffer, C.; Ikehata, M.; Citterio, L.; Demarec, S.; Trevisani, F.; Ristagno, G.; a kol. Bežné nekódujúce varianty génu UMOD indukujú hypertenziu citlivú na soľ a poškodenie obličiek zvýšením expresie uromodulínu. Nat. Med. 2013, 19, 1655–1660. [CrossRef]

14. Alvarez-Guerra, M.; Garay, RP Renálny Na-K-Cl kotransportér NKCC2 u Dahlových potkanov citlivých na soľ. J. Hypertens. 2002, 20, 721-727. [CrossRef]

15. Capasso, G.; Rizzo, M.; Evangelista, C.; Ferrari, P.; Geelen, G.; Lang, F.; Bianchi, G. Zmenená expresia renálnych apikálnych plazmatických membránových transportérov Na plus v skorej fáze genetickej hypertenzie. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2005, 288, F1173 – F1182. [CrossRef]

16. Fenton, RA; Modely Knepper, MA Mouse a mechanizmus koncentrácie moču v novom tisícročí. Physiol. Rev. 2007, 87, 1083–1112. [CrossRef] [PubMed]

17. Komhoff, M.; Laghmani, K. MAGED2: Nová forma prenatálneho Bartterovho syndrómu. Curr. Opin. Nephrol. Hypertenzia. 2018, 27, 323–328. [CrossRef]

18. Piesky, JM Koncentrácia a riedenie moču v starnúcej obličke. Semin. Nephrol. 2009, 29, 579–586. [CrossRef]

19. Tian, ​​Y.; Riazi, S.; Khan, O.; Klein, JD; Sugimura, Y.; Verbalis, JG; Ecelbarger, CA Renálna ENaC podjednotka, Na-K-2Cl a Na-Cl kotransportérové ​​množstvo u starých potkanov F344 x Brown Norway s obmedzeným prístupom k vode. Kidney Int. 2006, 69, 304-312. [CrossRef] [PubMed]

20. Schiessl, IM; Castrop, H. Regulácia zostrihu a fosforylácie NKCC2. Curr. Opin. Nephrol. Hypertenzia. 2015, 24, 457–462. [CrossRef] [PubMed]

21. Davies, M.; Fraser, SA; Galic, S.; Choy, SW; Katerelos, M.; Gleich, K.; Kemp, BE; Montáž, PF; Sila, DA Nové mechanizmy retencie Na plus pri obezite: Fosforylácia NKCC2 a regulácia SPAK/OSR1 pomocou AMPK. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F96–F106. [CrossRef]

22. Gamba, G. Regulácia aktivity NKCC2 skrátenými izoformami SPAK. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 306, F49–F50. [CrossRef] [PubMed]

23. Edwards, A.; Castrop, H.; Laghmani, K.; Vallon, V.; Layton, AT Účinky regulácie izoformy NKCC2 na transport NaCl v hrubej vzostupnej končatine a macula densa: Štúdia modelovania. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 307, F137–F146. [CrossRef]

24. Vitale, A.; Denecke, J. Brána endoplazmatického retikula sekrečnej dráhy. Rastlina. Cell 1999, 11, 615-628. [PubMed]

25. Caplan, MJ Polarita membrány v epitelových bunkách: Triedenie proteínov a vytvorenie polarizovaných domén. Am. J. Physiol. 1997, 272, F425 – F429. [CrossRef]

26. Sun, Z.; Brodsky, JL Kontrola kvality proteínov v sekrečnej dráhe. J. Cell Biol 2019, 218, 3171-3187. [CrossRef] [PubMed]

27. Ruggiano, A.; Foresti, O.; Carvalho, P. Kontrola kvality: Degradácia spojená s ER: Kontrola kvality bielkovín a mimo nej. J. Cell Biol. 2014, 204, 869–879. [CrossRef] [PubMed]

28. Ruddock, LW; Molinari, M. Spracovanie N-glykánu pri kontrole kvality ER. J. Cell Sci. 2006, 119, 4373–4380. [CrossRef]

29. Molinari, M. Štruktúra N-glykánu diktuje rozšírenie skladania proteínov alebo začiatok likvidácie. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 313–320. [CrossRef]

30. Hebert, DN; Garman, SC; Molinari, M. Glykánový kód endoplazmatického retikula: sacharidy spojené s asparagínom ako značky dozrievania proteínov a kontroly kvality. Trends Cell Biol. 2005, 15, 364-370. [CrossRef]

31. Igdoura, SA; Herscovics, A.; Lal, A.; Moremen, KW; Morales, ČR; Hermo, L. Alfa-manozidázy zapojené do spracovania N-glykánu vykazujú bunkovú špecifickosť a zreteľnú subkompartmentalizáciu v rámci Golgiho aparátu buniek v semenníkoch a nadsemenníkoch. Eur. J. Cell Biol. 1999, 78, 441-452. [CrossRef]

32. Lederkremer, GZ; Glickman, MH Okno príležitosti: Načasovanie degradácie proteínov orezaním cukrov a ubikvitínov. Trends Biochem. Sci. 2005, 30, 297-303. [CrossRef] [PubMed]

33. Stanley, P.; Taniguchi, N.; Aebi, M. N-glykány. In Essentials of Glycobiology, 3rd.; Varki, A., Cummings, RD, Esko, JD, Stanley, P., Hart, GW, Aebi, M., Darvill, AG, a kol., Eds.; Cold Spring Harbor: New York, NY, USA, 2015; s. 99–111.

34. Barlowe, CK; Miller, EA Biogenéza sekrečných proteínov a prenos v skorej sekrečnej dráhe. Genetika 2013, 193, 383–410. [CrossRef]

35. Wu, X.; Rapoport, TA Mechanistický pohľad na degradáciu proteínov spojenú s ER. Curr. Opin. Cell Biol. 2018, 53, 22–28. [CrossRef]

36. Sun, Z.; Brodsky, JL Degradačná dráha modelového nesprávne poskladaného proteínu je určená sklonom k ​​agregácii. Mol. Biol Cell. 2018, 29, 1422–1434. [CrossRef]

37. Frešno, I.; Molinari, M. Proteazomálny a lyzozomálny klírens chybných sekrečných proteínov: ER-asociovaná degradácia (ERAD) a ER-to-lyzozomálne asociovaná degradácia (ERLAD). Crit. Biochem. Mol. Biol. 2019, 54, 153–163. [CrossRef] [PubMed]

38. Briant, K.; Johnson, N.; Swanton, E. Systémy kontroly kvality transmembránovej domény fungujú v endoplazmatickom retikule a Golgiho aparáte. PLoS ONE 2017, 12, e0173924. [CrossRef] [PubMed]

39. Jensen, TJ; Loo, MA; Pind, S.; Williams, DB; Goldberg, AL; Riordan, JR Viacnásobné proteolytické systémy, vrátane proteazómu, prispievajú k spracovaniu CFTR. Cell 1995, 83, 129-135. [CrossRef]

40. Ward, CL; Omura, S.; Kopito, RR Degradácia CFTR cestou ubikvitín-proteazóm. Cell 1995, 83, 121-127. [CrossRef]

41. Gong, Q.; Keeney, DR; Molinari, M.; Zhou, Z. Degradácia mutantných kanálov syndrómu dlhého QT typu II s defektným obchodovaním cestou ubikvitín-proteazóm. J. Biol. Chem. 2005, 280, 19419–19425. [CrossRef]

42. O'Donnell, BM; Mackie, TD; Subramanya, AR; Brodsky, JL Degradácia obličkového draslíkového kanála, ROMK spojená s endoplazmatickým retikulom, vedie k Bartterovmu syndrómu typu II. J. Biol. Chem. 2017, 292, 12813–12827. [CrossRef] [PubMed]

43. Needham, PG; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, AC; Subramanya, AR; Brodsky, JL Kotransportér NaCl citlivý na tiazidy je zameraný na degradáciu spojenú s endoplazmatickým retikulom závislou od chaperónu. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43611–43621. [CrossRef] [PubMed]

44. Zaarour, N.; Demarec, S.; Defontaine, N.; Zhu, Y.; Laghmani, K. Viacnásobné evolučne konzervované motívy podobné di-leucínu na karboxylovom konci riadia anterográdne obchodovanie s NKCC2. J. Biol. Chem. 2012, 287, 42642–42653. [CrossRef]

45. Zaarour, N.; Demarec, S.; Defontaine, N.; Mordasini, D.; Laghmani, K. Vysoko konzervovaný motív na COOH konci diktuje výstup z endoplazmatického retikula a expresiu NKCC2 na bunkovom povrchu. J. Biol. Chem. 2009, 284, 21752–21764. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Seaayfan, E.; Defontaine, N.; Demarec, S.; Zaarour, N.; Laghmani, K. Proteín OS9 interaguje s kotransportérom Na-K-2Cl (NKCC2) a zameriava sa na jeho nezrelú formu pre dráhu degradácie spojenú s endoplazmatickým retikulom. J. Biol. Chem. 2016, 291, 4487–4502. [CrossRef]

47. Brodsky, JL Ochranné a deštruktívne úlohy, ktoré zohrávajú molekulárne chaperóny počas ERAD (degradácia spojená s endoplazmatickým retikulom). Biochem. J. 2007, 404, 353-363. [CrossRef]

48. Guerriero, CJ; Brodsky, JL Jemná rovnováha medzi skladaním vylučovaných proteínov a degradáciou spojenou s endoplazmatickým retikulom v ľudskej fyziológii. Physiol. Rev. 2012, 92, 537–576. [CrossRef]

49. Ahner, A.; Gong, X.; Frizzell, RA Degradácia regulátora transmembránovej vodivosti cystickej fibrózy: Cross-talk medzi ubikvitylačnými a SUMOylačnými cestami. FEBS J. 2013, 280, 4430–4438. [CrossRef]

50. Donnelly, BF; Needham, PG; Snyder, AC; Roy, A.; Khadem, S.; Brodsky, JL; Multichaperónové komplexy Subramanya, AR Hsp70 a Hsp90 sekvenčne regulujú degradáciu a biogenézu spojenú s endoplazmatickým retikulom kotransportéra citlivého na tiazidy. J. Biol. Chem. 2013, 288, 13124–13135. [CrossRef]

51. Benziane, B.; Demarec, S.; Defontaine, N.; Zaarour, N.; Cheval, L.; Bourgeois, S.; Klein, C.; Froissart, M.; Blanchard, A.; Paillard, M.; a kol. Povrchová expresia NKCC2 v cicavčích bunkách: Down-regulácia novou interakciou s aldolázou BJ Biol. Chem. 2007, 282, 33817–33830. [CrossRef]

52. Zaarour, N.; Defontaine, N.; Demarec, S.; Azroyan, A.; Cheval, L.; Laghmani, K. Sekrečný nosný membránový proteín 2 reguluje exocytickú inzerciu NKCC2 do bunkovej membrány. J. Biol. Chem. 2011, 286, 9489–9502. [CrossRef]

53. Bakhos-Douaihy, D.; Seaayfan, E.; Demarec, S.; Komhoff, M.; Laghmani, K. Diferenciálne účinky STCH a stresom indukovateľného Hsp70 na stabilitu a dozrievanie NKCC2. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2207. [CrossRef]

54. Herscovics, A.; Schneikert, J.; Athanassiadis, A.; Moremen, KW Izolácia myšej Golgi manozidázovej cDNA, člena génovej rodiny konzervovanej od kvasiniek po cicavce. J. Biol. Chem. 1994, 269, 9864-9871. [CrossRef]

55. Tempel, W.; Karaveg, K.; Liu, ZJ; Rose, J.; Wang, BC; Moremen, KW Štruktúra myšacej Golgiho alfa-manozidázy IA odhaľuje molekulárny základ substrátovej špecifickosti medzi alfa1,2-manozidázami triedy 1 (glykozylhydrolázy z rodiny 47). J. Biol. Chem. 2004, 279, 29774–29786. [CrossRef]

56. Tulsiani, DR; Touster, O. Purifikácia a charakterizácia manozidázy IA z Golgiho membrán pečene potkana. J. Biol. Chem. 1988, 263, 5408-5417. [CrossRef]

57. Hosokawa, N.; Ty, Z.; Tremblay, LO; Nagata, K.; Herscovics, A. Stimulácia ERAD nesprávne poskladaného nulového hongkonského alfa1- antitrypsínu Golgiho alfa1,2-manozidázami. Biochem. Biophys. Res. komun. 2007, 362, 626–632. [CrossRef] [PubMed]

58. Ogen-Shtern, N.; Avezov, E.; Shenkman, M.; Benyair, R.; Lederkremer, GZ Manozidáza IA je vo vezikulách kontroly kvality a podieľa sa na glykoproteínovom zacielení na ERAD. J. Mol. Biol. 2016, 428, 3194–3205. [CrossRef]

59. Iannotti, MJ; Figard, L.; Sokáč, AM; Sifers, RN Golgiho lokalizovaná manozidáza (MAN1B1) hrá neenzymatickú úlohu strážcu pri kontrole kvality biosyntézy proteínov. J. Biol. Chem. 2014, 289, 11844–11858. [CrossRef] [PubMed]

60. Pan, S.; Cheng, X.; Sifers, RN Golgiho endoplazmatické retikulum alfa-1, 2-manozidáza prispieva k získavaniu substrátov ERAD prostredníctvom priamej interakcie s gama-COP. Mol. Biol. Cela 2013, 24, 1111–1121. [CrossRef] [PubMed]

61. Shaukat, I.; Bakhos-Douaihy, D.; Zhu, Y.; Seaayfan, E.; Demarec, S.; Frachon, N.; Weber, S.; Komhoff, M.; Vargas-Poussou, R.; Laghmani, K. Nové poznatky o úlohe degradácie súvisiacej s endoplazmatickým retikulom pri Bartterovom syndróme typu 1. Hum. Mutat. 2021, 42, 947–968. [CrossRef]

62. Fujita, E.; Kouroku, Y.; Isoai, A.; Kumagai, H.; Misutani, A.; Matsuda, C.; Hayashi, YK; Momoi, T. Dva systémy degradácie súvisiacej s endoplazmatickým retikulom (ERAD) pre nový variant mutantného dysferlínu: Ubikvitín/proteazóm ERAD(I) a autofágia/lyzozóm ERAD(II). Hum. Mol. Genet. 2007, 16, 618–629. [CrossRef]

63. Bernasconi, R.; Molinari, M. ERAD a ERAD tuning: Likvidácia nákladu a ERAD regulátorov z cicavčieho ER. Curr. Opin. Bunka. Biol. 2011, 23, 176–183. [CrossRef]

64. Arvan, P.; Zhao, X.; Ramos-Castaneda, J.; Chang, A. Kontrola kvality sekrečnej dráhy pôsobiaca v Golgiho, plazmalema a endozomálnych systémoch. Doprava 2002, 3, 771–780. [CrossRef]

65. Stolz, A.; Wolf, DH Degradácia proteínov spojená s endoplazmatickým retikulom: Cesta do pekla za asistencie sprievodcu. Biochim. Biophys. Acta 2010, 1803, 694–705. [CrossRef] [PubMed]

66. Wang, F.; Song, W.; Brancati, G.; Segatori, L. Inhibícia degradácie spojenej s endoplazmatickým retikulom zachraňuje prirodzené skladanie pri chorobách so stratou funkcie nesprávneho poskladania proteínov. J. Biol. Chem. 2011, 286, 43454–43464. [CrossRef] [PubMed]

67. Tokunaga, F.; Brostrom, C.; Koide, T.; Arvan, P. Degradácia chybne zložených N-naviazaných glykoproteínov spojená s endoplazmatickým retikulom (ER) je potlačená po inhibícii ER manozidázy IJ Biol. Chem. 2000, 275, 40757-40764. [CrossRef] [PubMed]

68. Groisman, B.; Shenkman, M.; Ron, E.; Na dodanie glykoproteínu z EDEM1 do XTP3-B a na degradačné kroky súvisiace s neskorým endoplazmatickým retikulom sa vyžaduje úprava Lederkremer, GZ manózy. J. Biol. Chem. 2011, 286, 1292–1300. [CrossRef] [PubMed]

69. Vargas-Poussou, R.; Feldmann, D.; Vollmer, M.; Konrád, M.; Kelly, L.; van den Heuvel, LP; Tebourbi, L.; Brandis, M.; Karolyi, L.; Hebert, SC; a kol. Nové molekulárne varianty génu kotransportéra Na-K-2Cl sú zodpovedné za prenatálny Bartterov syndróm. Am. J. Hum. Genet. 1998, 62, 1332–1340. [CrossRef] [PubMed]

70. Helenius, A.; Aebi, M. Úlohy N-viazaných glykánov v endoplazmatickom retikule. Annu. Biochem. 2004, 73, 1019-1049. [CrossRef]

71. Spiro, RG Úloha N-viazaných polymanózových oligosacharidov pri zacielení glykoproteínov na degradáciu spojenú s endoplazmatickým retikulom. Cell Mol. Life Sci. 2004, 61, 1025-1041. [CrossRef]

72. Marcus, NY; Perlmutter, inhibítory DH glukozidázy a manozidázy sprostredkovávajú zvýšenú sekréciu mutantného alfa1 antitrypsínu ZJ Biol. Chem. 2000, 275, 1987–1992. [CrossRef]

73. Liu, Y.; Choudhury, P.; Cabral, CM; Sifers, RN Intracelulárna likvidácia neúplne poskladaného ľudského alfa1-antitrypsínu zahŕňa uvoľnenie z kalnexínu a posttranslačné orezanie asparagínom spojených oligosacharidov. J. Biol. Chem. 1997, 272, 7946-7951. [CrossRef] [PubMed]

74. Cabral, CM; Liu, Y.; Sifers, RN Disekcia kontroly kvality glykoproteínu v sekrečnej dráhe. Trends Biochem. Sci. 2001, 26, 619-624. [CrossRef]

75. Ermonval, M.; Kitzmuller, C.; Mir, AM; Cacan, R.; Ivessa, NE N-glykánová štruktúra krátkodobého variantu riboforínu I exprimovaného v bunkovej línii s defektnou glykozyláciou MadIA214 odhaľuje úlohu manozidázy, ktorá nie je ER manozidázou I, v procese degradácie glykoproteínu. Glycobiology 2001, 11, 565-576. [CrossRef] [PubMed]

76. Foulquier, F.; Perina, S.; Klein, A.; Mir, AM; Chirat, F.; Cacan, R. Degradácia glykoproteínov nesúcich druhy Man5GlcNAc2 a Man9GlcNAc2 v bunkovej línii MI8-5 CHO spojená s endoplazmatickým retikulom. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 398-404. [CrossRef]

77. Avezov, E.; Frenkel, Z.; Ehrlich, M.; Herscovics, A.; Lederkremer, GZ manozidáza I endoplazmatického retikula (ER) je kompartmentalizovaná a potrebná na úpravu N-glykánu na Man5-6GlcNAc2 pri degradácii spojenej s glykoproteínom ER. Mol. Biol. Cela 2008, 19, 216–225. [CrossRef]

78. Hosokawa, N.; Tremblay, LO; Ty, Z.; Herscovics, A.; Wada, I.; Nagata, K. Zlepšenie degradácie endoplazmatického retikula (ER) nesprávne poskladaného Null Hong Kong alfa1-antitrypsínu ľudskou ER manozidázou IJ Biol. Chem. 2003, 278, 26287-26294. [CrossRef]

79. Sifers, RN Bunková biológia. Degradácia bielkovín odblokovaná. Science 2003, 299, 1330–1331. [CrossRef]

80. Wu, Y.; Swulius, MT; Moremen, KW; Sifers, RN Objasnenie molekulárnej logiky, podľa ktorej sa nesprávne poskladaný alfa 1-antitrypsín prednostne vyberá na degradáciu. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2003, 100, 8229–8234. [CrossRef] [PubMed]

81. Hirao, K.; Natsuka, Y.; Tamura, T.; Wada, I.; Morito, D.; Natsuka, S.; Romero, P.; Sleno, B.; Tremblay, LO; Herscovics, A.; a kol. EDEM3, rozpustný homológ EDEM, zvyšuje degradáciu spojenú s glykoproteínovým endoplazmatickým retikulom a orezávanie manózy. J. Biol. Chem. 2006, 281, 9650–9658. [CrossRef]

82. Olivari, S.; Cali, T.; Salo, KE; Paganetti, P.; Ruddock, LW; Molinari, M. EDEM1 reguluje degradáciu spojenú s ER urýchľovaním demanozylácie polypeptidov s defektným skladaním a inhibíciou ich kovalentnej agregácie. Biochem. Biophys. Res. komun. 2006, 349, 1278–1284. [CrossRef] [PubMed]

83. Bieberich, E.; Bause, E. Man9-manozidáza z ľudskej obličky je exprimovaná v COS bunkách ako Golgiho rezidentný transmembránový N-glykoproteín typu II. Eur. J. Biochem. 1995, 233, 644-649. [CrossRef] [PubMed]

84. Velasco, A.; Hendricks, L.; Moremen, KW; Tulsiani, DR; Touster, O.; Farquhar, MG Od typu bunky závislé variácie v subcelulárnej distribúcii alfa-manozidázy I a II. J. Cell Biol. 1993, 122, 39-51. [CrossRef] [PubMed]

85. Bieberich, E.; Treml, K.; Volker, C.; Rolfs, A.; Kalz-Fuller, B.; Bause, E. Man9-manozidáza z prasacej pečene je membránový proteín typu II, ktorý sa nachádza v endoplazmatickom retikule. cDNA klonovanie a expresia enzýmu v COS 1 bunkách. Eur. J. Biochem. 1997, 246, 681-689. [CrossRef]

86. Ron, E.; Shenkman, M.; Groisman, B.; Izenshtein, Y.; Leitman, J.; Lederkremer, GZ Bypass dodania glykoproteínu závislého od glykánu do ERAD pomocou up-regulovaného EDEM1. Mol. Biol. Cela 2011, 22, 3945–3954. [CrossRef]

87. Casagrande, R.; Stern, P.; Diehn, M.; Shamu, C.; Osario, M.; Zuniga, M.; hnedá, PO; Ploegh, H. Degradácia proteínov z ER S. cerevisiae vyžaduje neporušenú cestu odozvy na proteín. Mol. Cell 2000, 5, 729-735. [CrossRef]

88. Schroder, M.; Kaufman, stres RJ ER a rozložená proteínová odpoveď. Mutat. Res. 2005, 569, 29-63. [CrossRef]

89. Liang, CJ; Chang, YC; Chang, HC; Wang, CK; Hung, YC; Lin, YE; Chan, CC; Chen, CH; Chang, HY; Sang, TK Derlin-1 reguluje mutantnú patogenézu spojenú s VCP a apoptózu indukovanú stresom endoplazmatického retikula. PLoS Genet. 2014, 10, e1004675. [CrossRef] [PubMed]

90. Houck, SA; Singh, S.; Cyr, DM Bunkové reakcie na nesprávne poskladané proteíny a proteínové agregáty. Metódy Mol. Biol. 2012, 832, 455–461. [CrossRef] [PubMed]

91. Chaudhuri, TK; Paul, S. Choroby spojené s nesprávnym poskladaním bielkovín a terapeutické prístupy založené na chaperónoch. FEBS J. 2006, 273, 1331–1349. [CrossRef]

92. Yadav, K.; Yadav, A.; Vashistha, P.; Pandey, viceprezident; Dwivedi, UN Protein misfolding Diseases and therapeutic approachs. Curr. Proteín. Pept. Sci. 2019, 20, 1226–1245. [CrossRef]

93. Frešno, I.; Molinari, M. Obrat endoplazmatického retikula: ER-stránka a iné príchute v selektívnom a neselektívnom ER klírens. F1000Res 2018, 7, 454. [CrossRef]

94. Okiyoneda, T.; Apaja, PM; Lukacs, GL Kontrola kvality proteínov na plazmatickej membráne. Curr. Opin. Cell Biol. 2011, 23, 483–491. [CrossRef]

95. Caldwell, SR; Hill, KJ; Cooper, AA Degradácia substrátov kontroly kvality endoplazmatického retikula (ER) vyžaduje transport medzi ER a Golgi. J. Biol. Chem. 2001, 276, 23296-23303. [CrossRef] [PubMed]

96. Taxis, C.; Vogel, F.; Wolf, DH ER-Golgiho prevádzka je predpokladom efektívnej degradácie ER. Mol. Biol. Cela 2002, 13, 1806–1818. [CrossRef] [PubMed]

97. Vashist, S.; Chybne poskladané proteíny Ng, DT sú triedené sekvenčným kontrolným mechanizmom kontroly kvality ER. J. Cell Biol. 2004, 165, 41–52. [CrossRef] [PubMed]

98. Schmidt, O.; Weyer, Y.; Baumann, V.; Widerin, MA; Eising, S.; Angelová, M.; Schleiffer, A.; Kremser, L.; Lindner, H.; Peter, M.; a kol. Endozómová a Golgiho asociovaná degradácia (EGAD) membránových proteínov reguluje metabolizmus sfingolipidov. EMBO J. 2019, 38, e101433. [CrossRef]

99. Pan, S.; Wang, S.; Utama, B.; Huang, L.; Blok, N.; Estes, MK; Moremen, KW; Sifers, RN Golgi lokalizácia ERManI definuje priestorové oddelenie systému kontroly kvality cicavčích glykoproteínov. Mol. Biol. Cela 2011, 22, 2810–2822. [CrossRef]

Sylvie Demaretz 1,2, Elie Seaayfan 1,2,† , Dalal Bakhos-Douaihy 1,2, Nadia Frachon 1,2, Martin Kömhoff 3 a Kamel Laghmani 1,2,

1 Centre de Recherche des Cordeliers, Sorbonne Université, Inserm, Université de Paris, F-75006 Paríž, Francúzsko; sylvie.demaretz@sorbonne-universite.fr (SD); elie.seaayfan@uni-marburg.de (ES); dalal.bakhos_aldouaihy@sorbonne-universite.fr (DB-D.); nadia.frachon@sorbonne-universite.fr (NF)

2 CNRS, ERL8228, F-75006 Paríž, Francúzsko

3 Divízia detskej nefrológie a transplantácie, Univerzitná detská nemocnica, Philipps-University, 35043 Marburg, Nemecko; Martin.Koemhoff@uk-gm.de