Priaznivé účinky frakcie celkového fenyletanoidového glykozidu izolovaného z Cistanche Deserticola na mikroštruktúru kostí u potkanov po ovariektómii

1. Úvod

Postmenopauzálna osteoporóza, ktorou bude trpieť 1 z 3 žien starších ako 50 rokov, sa stáva hlavným zdravotným rizikom, ktoré postihuje viac ako 200 miliónov žien na celom svete [1]. V menopauze prudký pokles hladiny estrogénu zvyčajne vedie k nadmernej kostnej resorpcii spôsobenej zvýšenou osteoklastogenézou; potom sa naruší rovnováha medzi tvorbou kostí vyvolanou osteoblastmi a kostnou resorpciou vyvolanou osteoklastmi a zrýchleniekostnej resorpcienakoniec spôsobila osteoporózu a dokonca zlomeninu bedra alebo chrbtice [2]. Verilo sa, že diferenciácia osteoklastov sa spustí, keď sa aktivátor receptora jadrového faktora kapa B (RANK) naviaže na RANKL, ligand RANK. Kombináciu RANK a RANKL však nie je možné aktivovať, pokiaľ sa k nej nepripojí faktor 6 spojený s receptorom proteínu tumor nekrotizujúceho faktora (TRAF6) [3], po ktorom nasleduje stimulácia downstream signálnych dráh vrátane PI3K/AKT a NF-κB. Nakoniec boli regulované expresie jadrového faktora aktivovaných T buniek c2 (NFAT2) a c-Fos [4], aby sa modulovala diferenciácia osteoklastov, ako aj kostná resorpcia. Faktory a regulátory, ktoré priamo alebo nepriamo súvisia s aktiváciou a diferenciáciou osteoklastov, sa teda považovali za kľúčové ciele na prevenciu straty kostnej hmoty. Skutočne existujú niektoré klinické a syntetické lieky na hormonálnu substitučnú terapiu, ako je estradiolvalerát, ktoré sú účinné pri liečbe postmenopauzálnej osteoporózy. Bohužiaľ, niektoré z nich zvýšili riziko závažných rakovín vrátane rakoviny prsníka a endometria [5], čo obmedzovalo ich klinické použitie. Preto je potrebné zvoliť iné alternatívy s účinnosťou a minimálnymi vedľajšími účinkami. Tradičné čínske lieky (TCM), ako aj izolované bioaktívne zlúčeniny a frakcie [6–9] sa ukázali ako účinné pri rôznych ochoreniach vrátane postmenopauzálnej osteoporózy. Spomedzi týchto bioaktívnych zložiek a frakcií boli zlúčeniny fenyletanoidných glykozidov (PhG) s potenciálnou účinnosťou považované za sľubné látky na liečbu osteoporózy [10–12]. Štruktúry PhGs pozostávajú z aglykónu kyseliny škoricovej, hydroxylfenyletylovej skupiny, ktorá je kombinovaná s -glukopyranózou, apózou, galaktózou, ramnózou alebo xylózou prostredníctvom glykozidickej väzby. Vo veľkej miere sa vyskytujú u liečivých druhov rodu Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma je ​​oficiálna TČM, ktorá je zaznamenaná v čínskom liekopise, a okrem toho, že je dôležitou TČM [14], C .deserticola je tiež tonizujúca bylina proti starnutiu s niekoľkými vedľajšími účinkami, z ktorej sa vyvinul liečivý likér a výživná tekutina schválená Štátna správa potravín a liečiv. Na základe záznamu čínskeho liekopisu bola C. deserticola tradične používaná domorodcami na riešenie problémov s nedostatkom obličkových esencií, ako je svalová slabosť a slabosť bedrového kĺbu, a zlúčeniny fenyletanoidných glykozidov vrátaneechinakozida akteozid sú hlavnými bioaktívnymi zložkami tejto byliny. Podľa teórie TCM „obličky riadia kosť“ je kostný systém riadený obličkovou esenciou [15] a problémy súvisiace s kosťami, ako je osteoporóza, môžu byť odstránené bylinami alebo zlúčeninami, ktoré majú aktivitu vyživovať obličkovú esenciu. Preto sme predpokladali, že celková frakcia fenyletanoidových glykozidov izolovaná z C. deserticola, aspoň čiastočne, bola prospešná pri liečbe osteoporózy. Súčasný experiment bol preto navrhnutý tak, aby potvrdil našu hypotézu použitím modelu potkanov s odstránením vaječníkov (OVX); okrem markerov kostnej resorpcie a tvorby kostí, ktoré je potrebné odhadnúť, bol na skúmanie hlavných mechanizmov antiosteoporotickej bioaktivity použitý aj antioxidačný index, ako aj RANKL/RANK/TRAF6- indukované PI3K/AKT a NF-KB signálne dráhy .

2. Materiály a metóda

2.1. Rastlinné materiály a príprava.

Celkovo 30 kg stoniek Cistanche deserticola YC Ma bolo zozbieraných z okresu Yongning v septembri 2015 so súradnicami 106.026597 a 38.262816, Provincia Ningxia, Čína. Bylinu identifikoval Dr Lin Dong (Department of Pharmacognosy, Ningxia Medical University) a zodpovedajúci exemplár (#20150901) sa zachoval na oddelení Farmaceutická analýza. Najprv sa extrahovalo 30},0 kg práškového C. deserticola použitím refluxnej metódy so 70 % etanolom ako rozpúšťadlom; pomer materiálu k rozpúšťadlu bol nastavený na 1:10 a doba varu pod spätným chladičom bola 2 hodiny počas 3-krát. Potom sa všetky filtráty spojili a kondenzovali za zníženého tlaku pri 60 °C. Po druhé, na predbežnú separáciu sa použili kolóny AB-8 makroporéznej živice a rôzne pomery etanolu vo vode (0 %, 20 %, Na elúciu sa použilo 30 %, 40 %, 50 % a 60 %, každý 60 1). Po tretie, 40% a 50% eluenty sa spojili a ďalej purifikovali použitím opakovaných kolón AB-8 makroporéznej živice s eluentmi 0%, 20%, 30%, 40% a 50% etanol vo vode a každý eluent bol 12 1. Nakoniec sa 40 % frakcia zhromaždila a kondenzovala za zníženého tlaku, čím sa získalo 150 g svetložltej sedimentovej fenyletanoidovej glykozidovej frakcie C. deserticola (CDP, výťažok bol 0,5 %). Pre in vivo experimenty sa na rozpustenie CDP použilo 0,5% CMC-Na rozpúšťadlo; orálne podávanie zvieratám bolo nastavené ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti; pre in vitro Western blot analýzu sa CDP rozpustil v DMSO a potom sa zriedil s DMEM, aby sa získali konečné koncentrácie 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml. 

PRÍRODNÝ CISTANCHE EXTRAKT PRE RAST KOSTÍFENYLETANOID GLYKOZIDY 75 % echinakozid 30 % AKTEOZID 12 %

2.2. Chemikálie a rozpúšťadlá.

Estradiol valerát (EV) bol od Delpharm Lille SAS, Francúzsko; alkalická fosfatáza (ALP), kostný gla-proteín (BGP), tartrát-rezistentná kyslá fosfatáza (TRAP) a deoxypyridinolín (DPD) crosslink ELISA súpravy od Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Čína, 201605; reagenčné súpravy malondialdehyd (MDA, 20181221), super oxid dismutáza (SOD, 20121218) a glutatión (GSH, 20181221) od Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, Čína; súpravy ELISA zosieťovaného parathormónu (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonínu (2L9ISN7AIU) a receptora alfa súvisiaceho s estrogénom (ERR, Y3AY8QEWB3) od Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Čína; katepsín K ELISA reagenčná súprava od BioVision, Amerika, 11300141; primárne protilátky RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kináza p8265 alpha AKT 1 (AF05173234), -aktín (17AV0411) a sekundárne protilátky kozieho anti králičieho IgG konjugovaného s chrenovou peroxidázou od ZSGB-BIO, Čína, 136080; súprava na stanovenie celkového proteínu BCA a komerčná súprava na detekciu tvorby oklastov a fetálneho hovädzieho séra a Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM) od HyClone, Logan, UT, USA; polyvinylidénfluoridová (PVDF) membrána od Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penicilín a streptomycín od Gibco, Rockville, MD, USA. Všetky ostatné použité chemické činidlá boli triedy AR.

2.3. HPLC kvantifikácia CDP.

Na identifikáciu a kvantifikáciu zloženia CDP sa použil prístroj Agilent 1220 HPLC. Chromatografické podmienky boli nasledujúce: kolóna C18 (TSK-GEL, 4,6.id x 250 mm, 5 um); gradientová elúcia obsahovala rozpúšťadlá A (acetonitril) a B (voda obsahujúca 0,5 % kyseliny octovej) (0-10 min: 17-20 % A; 10-30 min: 20-25 % A; a 30-40 min: 25-30% A); detekčná vlnová dĺžka bola 333 nm; teplota okolia; prietoková rýchlosť bola 1,0 ml/min; vstrekovaný objem vzorky bol 5 ul. Identifikovalo sa osem PhG zlúčenín, konkrétne cistanozid F, echinakozid, 6'-acetylakteozid, cistanozid C, cistanozid A, akteozid, 2'-acetylakteozid a izoakteozid; použitím zodpovedajúcich referenčných látok a metódy externého štandardu sa obsah vyššie uvedených 8 PhG kvantifikoval pomocou HPLC analýzy (obrázok 1).

Obrázok 1: HPLC odtlačok CDP. V tejto frakcii sa našlo osem fenyletanoidových glykozidových zlúčenín a celkový obsah bol kvantifikovaný ako 50,7 %. Zlúčeniny a ich obsah boli nasledovné: (1) akteozid F (3,6 %), (2) echinakozid (8,8 %), (3) cistanozid A (5,0 %), (4) akteozid (13,3 %), (5) izoakteozid (3,3 %), (6) akteozid C (3,6 %), (7) 2'-acetylakteozid (9,9 %) a (8) 6'-acetylakteozid (3,2 %).

2.4. Experimentálny protokol na zvieratách.

Celkovo 60 dospelých samíc potkanov Sprague-Dawley vo veku 3 mesiacov bolo vybraných z centra testovania na zvieratách Ningxia Medical University s priemernou počiatočnou telesnou hmotnosťou približne 234 ± 25 g. Potkany boli umiestnené v štandardnom prostredí bez špecifických patogénov, aby sa aklimatizovali počas 1 týždňa. Potom boli všetky potkany anestetizované (chloralhydrát, 100 mg/kg, ip) alebo len simulovaná ovariektómia (SHAM), alebo boli obidva vaječníky odstránené a potom náhodne rozdelené do 5 podskupín: orálne liečené vehikulom (0,5 % CMC- Na) bola stanovená ako modelová skupina (OVX), estradiolvalerát (1 mg/kg/deň) ako pozitívna skupina (EV) a 60, 120 a 240 mg/kg/deň CDP ako nízka (CDPL), stredne (CDPM) a vysoko (CDPH) dávkové skupiny. Všetkým potkanom sa perorálne podávalo denne a trvalo 3 mesiace s dávkovaním upravovaným každé 2 týždne, čo záviselo od zmeny celkovej telesnej hmotnosti. V posledný deň pokusu na zvieratách sa 24-hodinový moč získal pomocou metabolických klietok; sérum bolo odobraté z femorálnej artérie anestetizovaných potkanov; pravá stehenná kosť, holenná kosť a všetky orgány boli vypreparované a uložené pri -80 stupni C na ďalšiu analýzu. Pokusy na zvieratách, ktoré sme vykonali, boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Ningxia Medical University.

2.5. Stanovenie kostnej minerálnej hustoty a mikro-CT analýza.

Najprv sa použil rôntgenový absorpčný prístroj s dvojitou energiou (Lunar, USA) na odhadnutie celkovej kostnej minerálnej hustoty pravej stehennej kosti každého potkana; po druhé, rovnaká stehenná kosť sa použila na odhad 3D obrazu mikroarchitektúry trabekulárnej kosti pomocou mikro-CT skenera (GE, Amerika). Izotropné rozlíšenie bolo nastavené na 14 μm, aby sa získal ideálny 3D obraz; oblasť záujmu (ROI) bola zvolená nastavením rovnakých súradníc na rastovej platni stehennej kosti každej vzorky; a morfometrické parametre kostí vrátane trabekulárnej separácie (Tb.Sp), trabekulárneho počtu (Tb.N), hrúbky trabekulárnej kosti (Tb.Th), obsahu minerálov v kosti (BMC), hustoty minerálov v tkanivách (TMD) a obsahu minerálov v tkanivách (TMC ) sa získali analýzou ROI.

Obrázok 2: Účinky OVX a 12 týždňov liečby CDP alebo EV na celkovú minerálnu hustotu kostí v pravej stehennej kosti potkanov, ktoré sú hodnotené pomocou rôntgenovej absorpciometrie s dvojitou energiou (n=10/skupina). Údaje boli prezentované ako priemer ± SD; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 a ∗∗∗p < 0 001 oproti skupine OVX; ###p < 0 001 oproti skupine SHAM.

Obrázok 3: Mikro-CT snímky mikroarchitektúry pravej stehennej kosti potkanov liečených CDP; zobrazené fotografie boli reprezentatívne pre 4 rôzne potkany v každej skupine: (A) skupina OVX; (B) skupina SHAM; (C) skupina EV; (D) skupina CDPH; (E) skupina CDPM; (F) skupina CDPL. Medzi merané parametre patríobsah minerálov v kostiach(BMC), tkanivový minerálny obsah (TMC), tkanivová minerálna hustota (TMD), trabekulárna separácia (Tb.Sp), trabekulárne číslo (Tb.N) a trabekulárna hrúbka (Tb.Th). Potkany OVX vykazovali významné zníženie plochy mikroarchitektúry a trabekulárneho počtu. Potkany liečené CDP a potkany liečené EV čiastočne zvrátili vyššie uvedené zistenia v rovnakom stupni po 12 týždňoch liečby. Všetky hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 a ∗∗∗p < 0 001 oproti skupine OVX; ###p < 0 001 oproti skupine SHAM.

Obrázok 4: Účinky OVX a 12 týždňov liečby CDP alebo EV na moč a sérový Ca a P, ako aj PTH a kalcitonín u potkanov (n=10/skupina). Všetky údaje boli vyjadrené ako priemer ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 a ∗∗∗p < 0 001 oproti skupine OVX; # p < 0 05, ##p < 0 01 a ###p < 0 001 oproti skupine SHAM.

2.6. Biochemický test séra a moču.

Aktivity sérového katepsínu K, TRAP, SOD a GSH, ako aj obsah sérového PTH, kalcitonínu, ERR, MDA, BGP a DPD v moči, boli stanovené použitím zodpovedajúcich reagenčných súprav podľa pokynov výrobcu a hladina alkalickej fosfatázy (ALP) a obsah vápnika (Ca) a fosforu (P) v sére a moči sa odhadli pomocou automatického stroja (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Western Blot analýza.

Osteoklasty boli indukované použitím buniek RAW 264.7 pridaných s faktorom stimulujúcim kolónie makrofágov (MCSF) a RANKL. Stručne, 1 x 107 buniek RAW 264.7 sa kultivovalo na 6-jamkovej doštičke v prítomnosti 30 ng/ml MCSF a 25 ng/ml RANKL. Po 6 dňoch indukcie sa zrelé bunky osteoklastov identifikovali použitím metódy farbenia TRAP s príslušnou súpravou, potom sa ošetrili CDP (0.1, 0.01 a 0,001 mg/ml v uvedenom poradí) počas 24 hodín; potom boli bunky lyzované lyzačným pufrom obsahujúcim 0,5 mmol fenylmetylsulfonylfluoridu, proteázy a inhibítorov fosfatázy. Lyzát sa potom oddelil pomocou 10% SDS-PAGE a preniesol sa na PVDF membránu, ktorá sa sondovala s AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos a -aktín ( 1 : 400) po blokovaní 5 % odtučneným mliekom počas 2 hodín. Rovnaké membrány boli stripované a znovu testované s vyššie uvedenými 9 zodpovedajúcimi protilátkami a potom boli na konci detegované softvérom Image Lab. Experimenty sa opakovali trikrát.

2.8. Štatistická analýza.

Všetky údaje získané z in vivo a in vitro experimentov, opísané ako priemer ± SD, boli analyzované pomocou jednocestnej ANOVA nasledovanej Dunnettovým testom (SPSS 22.0 softvér, SPSS, USA); p < 0 05 bolo štatisticky významné.

3. Výsledky

3.1. Chemické zloženie CDP.

Použitím metódy HPLC bolo osemfenyletanoidové glykozidové zlúčeninysa našli v tejto frakcii, ako ukazuje obrázok 1. Použitím štandardných referencií a externej štandardnej metódy boli zlúčeniny a ich obsahy identifikované a kvantifikované nasledovne: (1) akteozid F (3,6 %), (2) echinakozid (8,8 %), (3)cistanozidA (5.0 %), (4) akteozid (13,3 %), (5) izoakteozid (3,3 %), (6) akteozid C (3,6 %), (7) 2'-acetylakteozid (9,9 % a (8) 6'-acetylakteozid (3,2 %). Celkový obsah týchto ôsmich zložiek bol kvantifikovaný ako 50,7 %.

PRÍRODNÝ VÝTAŽOK CISTANCHE TRUBKYPRE RAST KOSTÍFENYLETANOID GLYKOZIDY 75 % echinakozid 30 % AKTEOZID 12 %

3.2. Účinky CDP na hustotu kostných minerálov a mikroarchitektúru trabekuly.

Celková hustota kostných minerálov potkanov v rôznych podskupinách je znázornená na obrázku 2. Klesajúci trend v obsahu kostnej minerálnej hustoty bol pozorovaný u potkanov v OVX modelovej operácii v porovnaní s potkanmi zo skupiny SHAM (p < {{ 1}}). Všetky potkany liečené CDP vykazovali významne zvýšenú hustotu kostných minerálov o 11,2 %, 12.0 %, respektíve 10,7 % (p < 0 01), v porovnaní s potkanmi z modelovej skupiny OVX. Okrem toho, v súlade s údajmi o celkovej minerálnej hustote kostí, rekonštrukcia mikro-CT, ako aj histomorfometrické stanovenie stehennej kosti, ukázali, že potkany v skupine OVX vykazovali zjavné zhoršenie trabekulárnej architektúry, čo dokazuje výrazne znížený počet a oblasť trabekuly. ako aj výrazne zvýšený Tb.Sp v porovnaní s potkanmi zo skupiny SHAM. Liečba CDP zabránila OVX-indukovanému zhoršeniu trabekulárnej architektúry; ako ukazuje obrázok 3, hodnoty BMC, TMC a Tb.N sa výrazne zvýšili a oblasť Tb.Sp sa výrazne znížila, zatiaľ čo hodnoty TMD a Tb.Th sa zdali byť významne ovplyvnené operáciou OVX a naším CDP intervencia.

Obrázok 5: Účinky OVX a 12-týždňovej liečby CDP alebo EV na aktivitu TRAP v sére, katepsínu K, DPD, ALP a BGP potkanov OVX (n=10/skupina). Všetky hodnoty boli prezentované ako priemer ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 a ∗∗∗p < 0 001 oproti skupine OVX; # p < 0 05, ##p < 0 01 a ###p < 0 001 oproti skupine SHAM.

3.3. Účinky CDP na biochemické parametre moču a séra.

Ako ukazuje obrázok 4, boli detegované významné trendy poklesu hladiny P v moči a obsahu kalcitonínu v sére u potkanov modelovej skupiny OVX, čo bolo takmer o 30 % a 60 % menej ako u potkanov SHAM (p < 0 001 ), zatiaľ čo medzi skupinami OVX a SHAM neboli pozorované žiadne zjavné stúpajúce alebo klesajúce trendy hladín Ca a Ca v sére, ako aj PTH v sére a sérového PTH. Liečba CDP významne zabránila strate P a Ca v sére u OVX potkanov, čo dokazujú hladiny P a Ca v sére výrazne upregulované (p < 0 05) v porovnaní s potkanmi z modelovej skupiny OVX. Okrem toho boli pozorované zvýšené, ale štatisticky nevýznamné trendy kalcitonínu v skupinách s nízkou aj vysokou dávkou CDP v porovnaní s modelovou skupinou OVX.

Obrázok 6: Účinky OVX a 12-týždňovej liečby CDP alebo EV na expresiu ERR, telesnú hmotnosť a hmotnosť maternice a vagíny potkanov (n=10/skupina). Údaje sú prezentované ako priemer ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 a ∗∗∗p < 0 001 oproti skupine OVX; ###p < 0 001 oproti skupine SHAM.

3.4. Účinky CDP na tvorbu kostí a markery kostnej resorpcie.

Priaznivé účinky CDP na index tvorby kostí, ako aj inhibičné vplyvy nakostnej resorpciemarkery sú popísané na obrázku 5. Pokiaľ ide o markery tvorby kostí, hladiny sérového BGP neboli takmer ovplyvnené operáciou po odstránení vaječníkov, čo dokazujú nesignifikantné zmeny pozorované vo všetkých liečených skupinách, zatiaľ čo štatisticky významné zlepšenia sérovej ALP sa dosiahli pri nízkej (6 0 mg/kg) a mierne (120 mg/kg) dávky intervenčných skupín CDP v porovnaní s potkanmi v skupine SHAM (p < 0 01). Pokiaľ ide o index kostnej resorpcie, hladiny sérového katepsínu K a DPD, ako aj TRAP u potkanov modelovej skupiny OVX, boli významne zvýšené o približne 75,0 %, 41,4 % a 21,0 %, v tomto poradí v porovnaní s potkanmi SHAM a pri liečbe CDP, najmä nízkou dávkou 60 mg/kg, boli vlastnosti katepsínu K a DPD, ako aj TRAP v modelovej skupine OVX výrazne inhibované o 67,3 %, 41,4 % a 25,9 %, v uvedenom poradí. v porovnaní s potkanmi v modelovej skupine OVX.

PRÍRODNÁ RÚROVÁ CISTANCHE PRE RAST KOSTÍFENYLETANOID GLYKOZIDY 75 % echinakozid 30 % AKTEOZID 12 %

3.5. Účinky CDP na vagínu a maternicu, ako aj na hmotnosť celého tela.

Nevýznamné rozdiely v počiatočnej celkovej telesnej hmotnosti potkanov boli pozorované pred liečbou v šiestich skupinách (obrázok 6). Operácia s odstránením vaječníkov však viedla k významnému zvýšeniu konečnej telesnej hmotnosti potkanov v modelovej skupine OVX, čo je takmer 36.0 %, zatiaľ čo vlhká hmotnosť maternice a vagíny drasticky klesla takmer o 9{{4} }.0% a 60,0% v porovnaní s potkanmi SHAM (p < 0 001). Hoci obsah ERR nevykazoval žiadny významný rozdiel medzi skupinami OVX a SHAM, všetky liečebné skupiny vrátane CDP a EV významne zvýšili hladinu ERR . Okrem toho, keď sa liečili EV, vyššie uvedené prírastky hmotnosti celého tela, ako aj strata hmotnosti vagíny a maternice u potkanov OVX boli čiastočne zvrátené (p < 0 001), ale neboli ovplyvnené intervenciou CDP.

3.6. Účinky CDP na hladiny sérového MDA, SOD a GSH.

Medzi modelovými skupinami SHAM a OVX nebol štatisticky významný rozdiel vo vlastnostiach sérových SOD a GSH; ako je znázornené na obrázku 7, medzi vyššie uvedenými skupinami možno pozorovať rastúci trend v GSH. Okrem toho hladina sérového MDA bola prudko zvýšená o takmer 50 % u potkanov modelovej skupiny OVX v porovnaní s potkanmi SHAM. Aktivita SOD nebola ovplyvnená liečbou CDP, zatiaľ čo vlastnosť GSH bola významne zlepšená intervenciou CDP a CDP výrazne znížila hladinu MDA o 33,9% a 42,4% pri dávkach 60 a 240 mg/kg, v danom poradí ( p < 0 001).

3.7. Účinky CDP na hladiny expresie proteínov.

Naše údaje uvedené na obrázku 8 naznačujú, že liečba CDP významne znížila hladiny proteínov TRAF6, RANK a RANKL v porovnaní s kontrolou. Dolné signálne dráhy vrátane NF-KB boli potlačené a PI3K/AKT bol stimulovaný CDP intervenciou, čo dokazuje expresia downregulácie NF-KB-p65, zatiaľ čo PI3K p85 a AKT1 boli upregulované. V dôsledku toho sa expresia NFAT2 významne znížila a c Fos sa zvýšilo po liečbe CDP v koncentrácii 0.001-0,1 mg/ml. Navrhovaný mechanizmus je opísaný na obrázku 9, kde CDP znížila hladiny RANKL a RANK, čím sa znížili väzbové množstvá tohto ligandu s jeho receptorom. Spojenie RANKL s RANK sa ďalej znížilo downreguláciou TRAF6, po ktorej nasledovalo potlačenie downstream dráh vrátane NF-κB dráhy. Na rozdiel od toho bola stimulovaná signálna dráha PI3K/AKT, čo nakoniec viedlo k zníženiu expresie NFAT2 a zvýšeniu hladiny c-Fos.

4. Diskusia

Fenyletanoidové glykozidysú prirodzene sa vyskytujúce vo vode rozpustné zložky, ktoré sa bežne vyskytujú v ríši liečivých rastlín [11]. Doteraz zlúčeniny fenyletanoidových glykozidov priťahovali stále viac výskumníkov pre ich evidentnú úlohu pri liečbe rôznych ľudských ochorení a abnormalít [13]. Množstvo antiosteoporotických bioaktívnych frakcií a zlúčenín, vrátane polyfenolových a fenyletanoidných glykozidov, bolo identifikovaných a izolovaných z desiatok prírodných liečivých bylín [5, 10, 12, 16, 17].

Obrázok 8: Účinky rôznych koncentrácií CDP na proteínové expresie TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF-KBIA (f), NFAT2 (g), a c-Fos (h) (n=3/skupina); expresia proteínu sa normalizovala na -aktín a kvantitatívne údaje každého signálneho proteínu sa ukázali ako percentá hodnoty kontroly. Údaje boli opísané ako priemer ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 a ∗∗∗p < 0 001 oproti kontrolnej skupine.

C. deserticola je dobre známa ako "ženšen púšte", čo naznačuje bezpečnostný profil tejto jedlej TCM [18, 19]. Ako všeobecná tonizujúca bylina a prírodná zdravá potravina, ktorá sa dlho používa v ázijských krajinách, C. deserticola vykazovala priaznivú funkciu na zvýšenie sily obličiek. Zistilo sa, že TČM, tradične používaná na povzbudenie a udržanie obličkovej esencie, sa zvyčajne používala na liečbu osteoporózy, in vitro aj in vivo publikované údaje preukázali antiosteoporotickú aktivitu C. deserticola [2{13}}–23], a fenyletanoidové glykozidové zložky vrátane echinakozidu a akteozidu sú hlavné bioaktívne zložky, ktoré existujú v tejto jedlej liečivej rastline; všetko naznačuje, že nielen samotný echinakozid a akteozid, ale aj iné fenyletanoidové glykozidové zložky obsiahnuté v C. deserticola sa považovali za zodpovedné za antiosteoporotické vlastnosti tejto byliny. V našej súčasnej štúdii sa na izoláciu a obohatenie frakcie fenyletanoidových glykozidov z C. deserticola použila priaznivá bezpečnostná makroporézna živica a pomocou metódy HPLC sa osem hlavných zložiek fenyletanoidových glykozidov, konkrétne akteozid F, echinakozid, cistanozid A, akteozid, izoakteozid, akteozid C, 2'-acetylakteozid a 6'-acetylakteozid sa našli v izolovanej frakcii fenylletanoidových glykozidov a obsahy boli 3,6 %, 8,8 %, 5,0 %, 13,3 %, 3,6 %, 3 9,9 % a 3,2 %. Bolo dokázané, že echinakozid, jedna z hlavných aktívnych zlúčenín zaznamenaných v C. deserticola [14], má antiosteoporotickú aktivitu; avšak dávka 270 mg/kg bola taká vysoká, že obmedzila jej ďalšiu klinickú aplikáciu [24]. V súčasných experimentoch sa celková frakcia fenyletanoidových glykozidov s nižšou dávkou 60-240 mg/kg telesnej hmotnosti/deň použila na OVX potkanoch a obsah identifikovaných zložiek bol v tejto frakcii takmer 50 % čistý pri použití metódou HPLC.

Bolo dobre známe, že OVX môže spôsobiť osteoporózu, a OVX potkan bol považovaný za klasický a vhodný model na simuláciu ľudskej postmenopauzálnej osteoporózy. Súčasne sa po operácii ovariektómie pozoroval významný pokles minerálnej hustoty kostí, mikroarchitektúry trabekulárnej kosti, vlhkých hmotností maternice a vagíny a hladiny estrogénu, ako aj zjavné zvýšenie kostnej resorpcie a telesnej hmotnosti, z toho časť v dôsledku straty estrogénu [25]. Naše údaje doteraz jasne preukázali, že OVX skutočne vyvolal postmenopauzálnu osteoporózu a je vždy sprevádzaný prudkým poklesom kvality kostí, mikroarchitektúry kostí a vlhkých hmotností maternice a vagíny. Keďže EV je všeobecná hormonálna substitučná látka, ktorá sa používa v klinickej praxi, použila sa ako pozitívna kontrola v našom in vivo experimente, pričom sa zistila zvýšená telesná hmotnosť a hmotnosť atrofovanej maternice, ako aj zhoršená minerálna hustota kostí a mikroarchitektúra trabekulárnej kosti. očakávané zvrátenie doplnením EV. Na rozdiel od pozitívnej kontroly, znížená hmotnosť vagíny a maternice, ako aj celková telesná hmotnosť potkanov v modelovej skupine OVX neboli ovplyvnené liečbou CDP, čo znamená, že CDP môže zvýšiť tvorbu kostí bez vyvolania vedľajších účinkov. na organické tkanivá tela a maternice. Aj keď hladiny ERR boli významne upregulované liečbou CDP, nepozorovali sa žiadne vedľajšie účinky na organické tkanivá maternice a vagíny, ako pri fytoestrogénovom účinku. Okrem toho liečba CDP významne posilnila kvalitu kostí u potkanov OVX, ktorá bola zhoršená chirurgickým zákrokom na ovariektómiu.

Okrem toho sa na vyjadrenie antiosteoporotického účinku použili aj hladiny P a Ca v moči a sére potkanov OVX a koncentrácie Ca a anorganického P boli zvyčajne závislé od hladín kalcitonínu a PTH [26]. V tejto štúdii, aj keď nedošlo k žiadnemu významnému poklesu alebo zvýšeniu trendov v hladine vylučovania Ca v moči,

Obrázok 9: Predpokladaný molekulárny mechanizmus: CDP by mohla zabrániť strate kostnej hmoty u potkanov OVX prostredníctvom RANKL/RANK/TRAF6-indukovanej inaktivácie NF-KB a aktivácie dráh PI3K/AKT, ako aj stimulácie c-Fos a supresie NFAT2 , ktoré sú dokázané znížením hladín expresie TRAF6, RANKL, RANK, NF-KBIA a NFAT2, zatiaľ čo c-Fos, AKT a PI3K boli významne upregulované liečbou CDP v porovnaní s kontrolnou skupinou

sa získal sérový P, sérový Ca a PTH u potkanov modelovej skupiny OVX a pozorovali sa významné hladiny P a kalcitonínu v moči (p < 0 001). V súlade s publikovanými údajmi, že nedostatok estrogénu spôsobený operáciou ovariektómie vždy viedol k zníženiu hladiny kalcitonínu v krvi, tento znížený sérový kalcitonín nakoniec viedol k zvýšeniu hladiny PTH, kde sa Ca2 považovalo za hlavný regulátor sekrécie PTH. Pretože koncentrácia PTH v tejto štúdii nevykazovala žiadny významný rozdiel medzi skupinami OVX a SHAM, hladina Ca v sére ani v moči tiež nevykazovala žiadne zjavné zmeny medzi vyššie uvedenými skupinami. Bola však dosiahnutá signifikantne klesajúca tendencia hladiny kalcitonínu medzi skupinami OVX a SHAM a následne sa obsah P v moči OVX výrazne znížil. Domnievame sa, že vyššie uvedené údaje môžu vysvetliť protichodný jav, prečo vylučovanie hladiny Ca v moči u potkanov OVX nevykazovalo žiadnu zjavnú zmenu v porovnaní s potkanmi SHAM, a tento jav môže súvisieť aj so zvýšenou rýchlosťou kostného obratu [27]. . Po liečbe CDP boli hladiny P a Ca v sére výrazne zvýšené a obsah P v moči bol znížený u potkanov OVX, čo odrážalo, že CDP mohol nielen zabrániť vylučovaniu minerálnych prvkov z kostí, ale aj zvýšiť obsah séra u týchto potkanov. prvkov, čím sa nepriamo potláča úbytok kostnej hmoty.

Okrem toho sa na vysvetlenie základných antiosteoporotických mechanizmov CDP použili markery tvorby a resorpcie kostí, ako aj antioxidačné enzýmy vrátane SOD a GSH. Podobne ako v publikovaných údajoch, hladina ALP u potkanov modelovej skupiny OVX vykazovala neštatisticky významný stúpajúci trend, čo naznačuje zrýchlenú rýchlosť kostného obratu pri postmenopauzálnej osteoporóze [10]. Avšak po liečbe CDP (60, 120 a 240 mg/kg/deň) sa vlastnosť ALP výrazne zvýšila. Bolo dobre známe, že OVX spôsobil prudký pokles hladín estrogénu, čo zvyčajne vedie k nadmernej kostnej resorpcii a oxidačnému stresu [28], čo dokazujú hladiny TRAP, katepsínu K a DPD, ako aj MDA, ktoré sú výrazne zvýšené u potkanov Modelová skupina OVX. Tieto zhoršenia sa však čiastočne zlepšili zásahom CDP. Okrem toho liečba potkanov OVX pomocou CDP (60 a 240 mg/kg) preukázala významné zvýšenie aktivity GSH (p < 0 05). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že CDP vykazovala terapeutický účinok na osteoporózu indukovanú OVX a tieto účinky sa týkali tak zvýšenia tvorby kosti, ako aj potlačenia kostnej resorpcie, ako aj zlepšenia kostného antioxidačného systému.

Aktivácia RANK jeho ligandom RANKL stimulovala expresiu NFAT2 a c-Fos prostredníctvom signalizácie PI3K/AKT a NF-κB [29]. Ukázalo sa, že NF-KB je nevyhnutný pre osteoklastogenézu, pretože narušenie NF-KB by mohlo viesť k zhoršenej diferenciácii osteoklastov s osteoporotickým fenotypom a NF-KB upreguloval c-Fos a znížil expresiu NFAT2 počas osteoklastogenézy indukovanej RANKL/RANK/TRAF. Aby sa odhadol priaznivý vplyv CDP na osteoklastogenézu sprostredkovanú NFAT2 a c-Fos, analyzovali sa hladiny expresie RANKL a RANK. Očakáva sa, že CDP významne inhiboval NFAT2 a stimuloval hladiny c-Fos znížením expresie RANKL a RANK. Medzitým samotnému RANK chýbala vlastná kinázová vlastnosť, pokiaľ sa nespojil s TRAF6, aby spustil downstream signalizáciu [3]. CDP tiež znížila expresiu TRAF6, čo viedlo k významnému zníženiu väzbových množstiev RANKL a RANK. Predpokladaný antiosteoporotický mechanizmus CDP na OVX potkanoch pokrýval vyššie uvedené signálne dráhy a regulátory boli opísané na obrázku 9. Stručne povedané, CDP znížila hladiny TRAF6, RANKL a RANK, čím potlačila následné signálne dráhy vrátane PI3K/AKT a NF-KB, ktoré sú spúšťané RANKL/RANK a nakoniec znížili expresiu a aktivity kľúčových osteoklastogénnych proteínov NFAT2 a c-Fos. Viaceré stopy údajov preto naznačujú priaznivý účinok CDP na kostný metabolizmus potkanov OVX najmä prostredníctvom dráh PI3K/AKT a NF-KB sprostredkovaných RANKL/RANK/TRAF{25}}.

5. Záver

Stručne povedané, celkové fenyletanoidové glykozidy, izolované z C. deserticola, vykazovali významné priaznivé účinky na postmenopauzálnu osteoporózu potkanov OVX a terapeutický potenciál pri potláčaní úbytku kostnej hmoty spočíval najmä v stimulácii tvorby kostí a inhibícii kostnej resorpcie, ako aj v zlepšení kostného antioxidantu systém; mechanizmy môžu súvisieť s RANKL/RANK/TRAF{0}}indukovanou aktiváciou NF-KB a inaktiváciou PI3K/AKT, ako aj so stimuláciou c-Fos a supresiou NFAT2, a nakoniec bola inhibovaná diferenciácia osteoklastov.

PRÍRODNÁ RÚROVÁ CISTANCHE PRE RAST KOSTÍFENYLETANOID GLYKOZIDY 75 % echinakozid 30 % AKTEOZID 12 %