Opätovné zapojenie metabolizmu glukózy a lipidov indukované G-proteínovým receptorom 17 Umlčanie umožňuje prechod progenitorov oligodendrocytov na myelinizačné bunky Ⅱ

3. Výsledky

3.1. Utlmenie GPR17 v diferenciácii OPC významne zmenilo expresiu génov zapojených do metabolizmu lipidov a glukózy

Aby sme zdôraznili biologické procesy významne ovplyvnené expresiou GPR17 počas diferenciácie OL, interferovali sme s jeho expresiou transfekciou potkaních OPC s SMART-pool siRNA špecifickými pre potkaní GPR17. Po potvrdení úspešného knockdownu GPR17 pomocou qRT-PCR (obrázok S1) sme vykonali mikročipovú analýzu 30 584 potkaních transkriptov v GPR17- umlčaných oproti kontrolným OPC a analyzovali sme rozdielne exprimované gény (DEG) pomocou rôznych bioinformatických nástrojov. Po prvé, 640 stupňov bolo študovaných Meta-Core, aby sa vykonala analýza obohatenia dráhy a identifikovali sa procesy, u ktorých sa predpokladá, že budú významne ovplyvnené. Táto analýza naznačila zmenu signalizácie mTOR, o ktorej sa už ukázalo, že je spojená s funkciou GPR17 [37], a ďalších procesov, o ktorých je známe, že sú relevantné pre dozrievanie OPC, ako napríklad „prestavba cytoskeletu"a„regulácia metabolizmu lipidov" (Stôl 1).

plus

Kliknite sem, aby ste poznali Cistanche pre rast kostí

Tabuľka 1. Softvér MetaCore sa použil na uskutočnenie analýzy obohatenia dráhy na DEG po umlčaní GPR17. V tabuľke sú uvedené najvýznamnejšie cesty vyplývajúce z analýzy, počet asociovaných génov a bežných génov zahrnutých v súbore údajov

Potom sa nástroj na analýzu cesty Ingenuity (IPA) použil na vykonanie zhody analýzy, ktorá automaticky identifikuje upravené súbory údajov IPA s významnými podobnosťami a rozdielmi v porovnaní so súborom údajov dotazu. Táto analýza posilňuje predpokladané spojenie medzi expresiou GPR17 a metabolizmom lipidov, čo ukazuje, že zmeny expresie 38 génov v našom súbore údajov (tabuľka S1) sú spojené so zmenenou syntézou mastných kyselín (obrázok 1). Spomedzi nich umlčanie GPR17 vyvolalo zvýšenú reguláciu LXR (pečeňový receptor X alfa, NR1H3 na obrázku 2 a tabuľke S1, jadrový receptor reagujúci na oxysteroly) a SREBP1 (proteín viažuci regulačný element sterolov 1, SREBF1 na obrázku 1 a tabuľke S1), dvoch kľúčových hráčov v syntéze mastných kyselín a cholesterolu. V našom súbore údajov sme tiež pozorovali, že niekoľko zmenených génov, vrátane PDH (pyruvátdehydrogenáza), Ldha (laktátdehydrogenáza alfa) a Pdk1 (pyruvátdehydrogenáza kináza 1), súvisí s metabolizmom glukózy a Krebsovým cyklom, čo naznačuje potenciálne zapojenie receptor GPR17 pri regulácii týchto metabolických procesov. Podľa toho analýza obohatenia založená na génovej ontológii (ToppGene suite) na DEG odhalila zmenu „metabolického procesu monokarboxylových kyselín“ (GO:{{20}}}032787, p- hodnota: 0,02), nad rámec iných procesov súvisiacich s vývojom CNS a bunkovým metabolizmom, ako je „regulácia vývoja nervového systému“ (GO:0051960, p-hodnota: 0,033) a „sfingolipidové metabolické procesy“ (GO:0006665, p-hodnota : 0,043) (obrázok 2; úplný zoznam v tabuľke S2).

Globálne tieto zmeny naznačujú, že umlčanie GPR17 môže pôsobiť ako spúšťač na adresovanie buniek myelinizácii vyladením niekoľkých génov zapojených do transkripčnej regulácie homeostázy lipidov a glukózy, ako aj do využívania cholesterolu a lipidov na produkciu myelínu.

Obrázok 1. Nástroj na analýzu cesty vynaliezavosti (IPA, Qiagen) sa použil na analýzu súboru údajov a preskúmanie chorôb a biologických procesov, o ktorých sa predpokladá, že budú stúpať alebo klesať na základe vzoru rozdielne exprimovaných génov v súbore údajov. Z tejto analýzy sme extrapolovali schému na obrázku, ktorá zahŕňa gény súvisiace so syntézou lipidov odlišne vyjadrené v našom súbore údajov (p-hodnota=9,67 × 10-4). Úplné názvy týchto génov spolu s relatívnou násobnou zmenou (pomer log2) sú uvedené v tabuľke S1. V červenej, upregulované gény; v zelených, downregulovaných génoch

Obrázok 2. Súprava Toppgene sa použila na analýzu obohatenia na DEG na báze GO. Obrázok ukazuje niektoré z významných biologických procesov súvisiacich s centrálnym nervovým systémom a bunkovým metabolizmom, ktoré sú potenciálne zmenené umlčaním GPR17. Modré stĺpce označujú celkový počet génov spojených s každým termínom; červené pruhy označujú gény spoločné s naším súborom údajov pre každý výraz. Úplný zoznam biologických procesov vyplývajúcich z tejto analýzy a relatívne p-hodnoty sú uvedené v tabuľke S2.

3.2. Metabolomická analýza počas diferenciácie OPC in vitro

Na posúdenie korelácie medzi expresiou GPR17 a aktiváciou špecifických metabolických dráh sme vykonali metabolomickú analýzu kultivovaných OPC počas ich fyziologického dozrievania. OPC sa udržiavali v diferenciačnom médiu a potom sa lýzovali v štyroch rôznych časových bodoch (po 0, 1, 3 a 5 dňoch v diferenciácii, DID), ktoré zodpovedajú rôznym štádiám dozrievania OL. Paralelne, aby sa vyhodnotilo, že vo všetkých experimentoch došlo k dozrievaniu s očakávaným načasovaním, OPC sa kultivovali a farbili na GPR17 a MBP. Výsledky ukázali, že počet buniek exprimujúcich GPR17- dosiahol svoje maximum pri 3 DID a potom sa vrátil k bazálnej hladine pri 5 DID, zatiaľ čo počet MBP-pozitívnych buniek sa počas dozrievania postupne zvyšoval (obrázok 3a), v súlade s predchádzajúce výsledky [37]. Metabolomické hodnotenie OPC sa uskutočnilo pomocou kvapalinovej chromatografie-tandemovej hmotnostnej spektrometrie (LC-MS/MS), ako už bolo opísané [38], so zameraním na energetické metabolity zapojené do glykolýzy, pentózofosfátovú dráhu, Krebsov cyklus, oxidáciu mastných kyselín, ich kofaktory NADH, NAD plus, NADPH, NADP plus, ATP, ADP, AMP, aminokyseliny a niektoré ich deriváty. Metabolomické profily analyzovaných štyroch časových bodov sú uvedené na obrázku 3b. V deň 0 boli hladiny niekoľkých metabolitov patriacich a/alebo spojených s Krebsovým cyklom (napr. sukcinát, malát, alfa-ketoglutarát, glutamát, aspartát, alanín a prolín) vyššie, ako sa očakávalo od buniek prichádzajúcich z vysoko proliferujúceho stavu (obrázok 3c). V medzistupňoch (od DID 1 do 3) vykazovali OPC výraznú upreguláciu molekúl zapojených do syntézy mastných kyselín a cholesterolu. V súlade s tým sme pozorovali zvýšené hladiny acetyl-CoA (obrázok 3c), ktorý predstavuje prekurzor cholesterolu a mastných kyselín a malonyl-CoA, špecifický medziprodukt syntézy mastných kyselín. Pri DID 5 sme pozorovali zvýšené hladiny niekoľkých acylkarnitínov a aminokyselín paralelne s významným zvýšením voľnej intracelulárnej glukózy (obrázok 3c). Pozorovali sme tiež znížené hladiny AMP a ADP odo dňa 0 do DID 5 a prechodný nárast ATP medzi DID 1 a DID 3. Tieto údaje naznačujú, že odo dňa 0 do DID 3, čo zodpovedá časové okno, počas ktorého GPR17 dosahuje svoju maximálnu expresiu, OPC používali hlavne glukózu a aminokyseliny na udržanie biosyntézy cholesterolu a mastných kyselín. Pri DID 5, ako je zdôraznené zvýšenými hladinami acyl-karnitínu, sa OPC pravdepodobne spoliehajú na využitie mastných kyselín. Tieto údaje spolu naznačujú, že počas fyziologickej diferenciácie OPC postupne prepájajú svoj energetický metabolizmus, aby sa stali zrelými myelinizačnými OL.

3.3. Metabolomická analýza po umlčaní GPR17 počas zrenia OPC in vitro

Aby sme odhalili príspevok receptora GPR17 pri riadení energetických metabolických zmien, ku ktorým dochádza počas diferenciácie buniek, vykonali sme metabolomiku na GPR17- umlčaných OPC v porovnaní s kontrolnými OPC prijímajúcimi zmiešanú RNA. Najprv sme skúmali vplyv umlčania GPR17 na dozrievanie OPC imunofluorescenčným farbením pre GPR17 a MBP. Ako sa očakávalo, po umlčaní receptora sme zistili zníženie farbenia GPR17, jasne viditeľné pri 3 DID. Pozorovali sme tiež výrazné zvýšenie počtu zrelých MBP-pozitívnych OL pri 3 DID (nezobrazené) a 5 DID (obrázok S2). Paralelne sa v piatich časových bodoch (0, 1, 2, 3 a 5 dní v diferenciácii, DID) uskutočnila podrobná analýza qPCR, ktorá odhalila v kontrolných OPC silné zvýšenie expresie GPR17 po 1 DID, ktorý dosahuje významné hladiny začínajúce po 2 DID, progresívne zvýšenie expresie MBP až do 5 DID a významné zníženie skorého markera NG2 (obrázok 4a). Naopak, po umlčaní GPR17 (obrázok 4b) mRNA GPR17 dosiahla nižšie hladiny pri DID1 a potom zostala stabilne nízka, expresia MBP sa ďalej zvýšila a NG2 sa ďalej znížila. Priame porovnanie expresie NG2 a MBP v GPR17-umlčaných versus kontrolných OPC v každom časovom bode je znázornené na obrázku 4c. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že za týchto experimentálnych podmienok umlčanie GPR17 v OPC urýchlilo proces ich diferenciácie. Potom sa uskutočnila metabolomika OPC pomocou LC-MS/MS v piatich vybraných časových bodoch. Porovnanie metabolomických údajov získaných z GPR17-umlčaných a kontrolných OPC v každom časovom bode nám umožnilo identifikovať metabolity, ktoré sú významne ovplyvnené umlčaním GPR17

Obrázok 3. (a) Graf ukazuje zmeny v percentách buniek GPR17 plus a MBP plus počas diferenciácie. n=3 na skupinu; jednosmerná ANOVA s Tukeyho testom. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) Teplotná mapa zobrazuje množstvo metabolitov v každej jednotlivej vzorke zastavené na 0, 1 , 3 alebo 5 DID. Množstvo analyzovaných metabolitov je reprezentované chromatickou stupnicou v rozsahu od tmavo modrej (veľmi nízke množstvo) po tmavo hnedú (veľmi vysoké množstvo). n=4–5 na skupinu. (c) Metabolity s množstvom výrazne odlišným medzi podmienkami (0, 1, 3 a 5 dní v diferenciácii, DID; jednosmerná ANOVA s Fisherovým testom LSD).

Na DID 1 (obrázok 5a) sme nenašli významné zmeny. Na DID 2 (obrázok 5b) sme zistili významné zvýšenie niektorých metabolitov Krebsovho cyklu (malát, fumarát citrát), mierne zvýšenie voľného karnitínu (CO), acetyl-karnitínu (C2), propionyl-karnitínu (C3: 0), butyryl-karnitín (C4:0), valerylkarnitín (C5:0), hexadekanoylkarnitín (C16:0a výrazné zníženie glukózy , laktát, kreatín a ornitín. Zníženie obsahu olejaktátu a kreatínu a zvýšenie propionyl-karnitínu (C3) bolo tiež pozorované pri DID3 (obrázok 5c). Pri DID 5 (obrázok 5d) sme stále zistili zvýšenie voľného karnitínu ( CO), acetylkarnitín (C2), propionyl-karnitín (C3:0), butyrylkarnitín (C4:{{30}}), valerylkarnitín (C5:0 )tetradekanoyl-karnitín (C14:0), hexadekanoyl-karnitín (C16:0), oktadekanoyl-karnitín C18:0), oktadecenoyl-karnitín (C18:1), podobne ako pôvodne pozorované vo viacerých diferencovaných buniek (pozri obrázok 3), zvýšenie dihydroxyacetón-3-fosfátu/glyceraldehyd3-fosfátu (DHAP/GAP), fumarátu a citrátu a zníženie acetyl-CoA, Met-SOkreatínu, taurínu a karnozín.

Obrázok 4. Účinok umlčania GPR17 na dozrievanie OPC. Hladiny expresie GPR17 (zelená), NG2modrá a MBP (červená) sa hodnotili pomocou PCR v reálnom čase počas diferenciácie v kontrolných podmienkach (bunky transfekované scramble RNA a po umlčaní GPR17 (b) a normalizované oproti expresii pri T{{ 6}} (nastavené na 0). n=6 za každý časový bod. Jednosmerná ANOVA s Tukeyho viacnásobnými porovnávacími testami (a): ** p < {{10} }.001 V. DID 0-2-3-5, @ p < 0.05 V. DID 3-5; ## p < 0.01 vs. deň 0; SSS p < {{30}}.001 verzus deň{28}} {21}}; (b): *** p < 0.001 vs. DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 vs. deň 0, # p < 0,05, ### p < 0,001 vs. deň 0. S p < 0,05, SS p < 0,01, SSS p < 0,001 V. DID 5. (C) Expresia NG2 a MBP v GPR17-umlčala OPC vs. kontrolné OPC (nastavené na 0) v každom časovom bode. Zmena záhybu (FC) bola hlásená ako LOG,(FC). Jedna vzorka t-testu, * p < 0,05, * p < 0,01;*** p < 0,001 vs. relatívna DID v kontrolných OPC.

Obrázok 5. Metabolomické zmeny indukované umlčaním GPR17 v OPC. (a – d) Množstvo každého metabolitu po umlčaní GPR17 bolo normalizované na množstvo v relatívnej kontrolnej vzorke. Výsledné násobné zmeny sa použili na vytvorenie grafu sopky pre každý časový bod (1, 2, 3, 5 dní v diferenciácii). Body nad bodkovanou horizontálnou čiarou predstavujú metabolity, ktoré vykazovali štatisticky významnú zmenu (Fisherova LSD korigovaná pomocou FDR; p.adj < 0.1). Zelenou metabolity s nižšou expresiou, červenou farbou metabolity s vyššou expresiou po umlčaní GPR17. n=7–9 na každú skupinu. DID: dni v diferenciácii.

3.4. GPR17 moduluje uvoľňovanie laktátu počas dozrievania OPC

Na základe výsledkov metabolomiky opísaných vyššie sa zistilo, že umlčanie GPR17 znižuje intracelulárne hladiny laktátu. Aby sme zhodnotili, či toto zníženie odráža všeobecný pokles metabolizmu laktátu alebo zvýšené uvoľňovanie tohto metabolitu, merali sme jeho hladiny v bunkových lyzátoch a v zodpovedajúcich médiách v rôznych časových bodoch. Ako je znázornené na obrázku 6, v kontrolných podmienkach dosiahol intracelulárny laktát najvyššie množstvo pri DID 2 (obrázok 6a) (keď je expresia receptora GPR17 tiež maximálna) a potom sa znížil, keď bunky dozreli. Namiesto toho sa po umlčaní GPR17 zrušil vzostup intracelulárneho laktátu a jeho hladiny sa ďalej znižovali smerom k diferenciácii. Porovnanie hladín laktátu v GPR17-utlmených OPC oproti kontrolným OPC v každom časovom bode zvýraznilo zníženie jeho hladín pri DID 2 a 3 (obrázok 6b). Extracelulárny laktát mal odlišnú kinetiku, pričom vykazoval významné zníženie v porovnaní s DID 1 pri DID 2-3-5 v kontrolných podmienkach, zatiaľ čo v GPR17-utlmených OPC zostal stabilne vyšší a potom sa výrazne znížil pri DID 5 (obrázok 6c ). Pri porovnaní hladín laktátu v rôznych časových bodoch medzi dvoma experimentálnymi podmienkami však umlčanie GPR17 bránilo fyziologickému zníženiu,zvýšenie prítomnosti laktátuv médiu pri DID 2 a 3 (obrázok 6d),čo naznačuje zvýšené uvoľňovanie.

Obrázok 6. Umlčanie GPR17 v OPC mení metabolizmus laktátu. (a) Množstvo laktátu počas dozrievania OPC v kontrolných podmienkach (zelená čiara) a po umlčaní GPR17 (oranžová čiara). n=7 – 9 na skupinu. Jednosmerná ANOVA s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 vs. DID1 siGPR17 (b ) Hladiny laktátu po umlčaní GPR17 boli normalizované oproti kontrolným vzorkám (nastaveným na 1) v každom časovom bode (n=7–9). ** p < 0,01; jeden vzorový t-test. Upravené médiá z GPR17-utlmených a kontrolných OPC sa odobrali z rovnakej kultúry, ktorá sa použila na metabolomickú analýzu. Hladiny laktátu v médiu boli hodnotené pomocou LC-MS/MS. (c) Množstvo laktátu v extracelulárnom priestore počas dozrievania OPC v kontrolných podmienkach (zelená čiara) a po umlčaní GPR17 (oranžová čiara). Jednosmerná ANOVA s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. DID1 CTL; § p < 0,05 oproti DID5 siGPR17. ( d ) Extracelulárne hladiny laktátu po umlčaní GPR17 boli normalizované oproti kontrolným vzorkám (nastaveným na 1) v každom časovom bode. * p < 0,05; ** p < 0,01; jeden vzorový t-test. Účinok inhibície MCT1 v kontrolných (napr. g) a GPR17-utlmených (f,h) OPC sa hodnotil analýzou expresie MBP vo vzorkách ošetrených inhibítorom oproti relatívnym kontrolám (ošetreným nosičom) v 3. a 5. dni diferenciácie. n=6 na skupinu.

Jedným z mechanizmov, ktorýmOPC môžu uvoľňovať laktátje cez monokarboxylátový transportér MCT1. Nedávne štúdie navyše uvádzajú, že samotné OPC môžu získať extracelulárny laktát prostredníctvom MCT receptorov, ktoré podporujú ich bunkový cyklus a diferenciáciu [39]. Zaujímalo nás teda, či by zvýšené uvoľňovanie laktátu indukované umlčaním GPR17 mohlo byť sprostredkované MCT1 a či to môže byť čiastočne zodpovedné za účinok pozorovaný na dozrievanie OPC v rovnakých podmienkach (obrázok 4). Na tento účel sme OPC liečili AR-C155858, selektívnym inhibítorom MCT1, počas normálnej diferenciácie a po umlčaní GPR17. Ako sa očakávalo, uvoľňovanie laktátu bolo úspešne inhibované v oboch podmienkach (obrázok S3). Účinok inhibície MCT1 na dozrievanie OPC v rôznych experimentálnych podmienkach sa hodnotil analýzou hladín expresie MBP. Mierne zníženie génovej expresie MBP, ktoré je blízke štatistickej významnosti (p=0.07), sa zistilo iba vo vzorkách transfekovaných špecifickou siRNA pre GPR17 (obrázok 6e–h); vo vzorkách transfekovaných kontrolnou RNA (siNEG) sa však neobjavili žiadne významné variácie. Tieto výsledky naznačujú, že zvýšenie extracelulárneho laktátu sprostredkované downreguláciou GPR17 podporuje dozrievanie OPC; avšak malý rozsah zníženia MBP naznačuje, že tento metabolit nie je jediným faktorom zapojeným do procesu.

3.5. Lipidomická analýza po umlčaní GPR17 počas zrenia OPC

Výsledky transkriptomickej analýzy po umlčaní GPR17 tiež zdôraznili potenciálne spojenie medzi jeho funkciou a syntetickými dráhami lipidov a cholesterolu, ktoré sú hlavnými zložkami myelínu. Aby sme ďalej preskúmali úlohu GPR17 v metabolizme lipidov, použili sme LC-MS/MS na lipidomickú analýzu GPR17-umlčaných OPC po 2, 3 a 5 dňoch v diferenciácii v porovnaní s dňom 0. Zoznam analyzovaných lipidov, relatívne násobné zmeny a p-hodnoty sú uvedené v tabuľke S4. Dve najhojnejšie lipidové triedy v experimentálnych skupinách boli mastné kyseliny a rodina diacyl-fosfatidylcholínu (PCaa). Počas diferenciácie kontrolných OPC sme nezistili žiadne významné zmeny v abundancii žiadnej lipidovej triedy. Namiesto toho GPR17-umlčané OPC vykazovali trend k zmenenému zastúpeniu voľných mastných kyselín, ceramidov, acyl-alkyl-fosfatidylcholínu (PCae) a fosfatidylinozitolu (PI) v porovnaní s kontrolnými OPC, najmä pri DID 3 a 5, ale len diacyl-fosfatidyletanolamín (PEaa) a sfingomyelín (SM) vykazovali štatisticky významnú zmenu (obrázok 7).

Obrázok 7. Zmeny v abundancii lipidových tried indukované umlčaním GPR17 počas diferenciácie OPC. Uvádza sa množstvo každej triedy lipidov v kontrolných podmienkach v rôznych časových bodoch (a) Analyzovala sa kinetika každej triedy lipidov po umlčaní GPR17: (b) mastné kyseliny, (C) ceramidy (d) LysoPC (lyzofosfatidyl-cholíny), (e) LysoPE (lyzofosfatidyletanolamíny), (f) PCaa (diacyl-fosfatidyl-cholíny), (g) PCae (acyl-alkyl-fosfatidyl-cholíny), (h) PEaa (di-acylfosfatidyl-etanolamíny), (i) PEae (acyl-alkyl-fosfatidyl-etanolamíny), (i) PI (fosfatidylinozitoly), (k) PS (fosfatidyl-seríny), (D SM (sfingomyelíny). n=5 pre každú skupinu. Kinetika: Obojsmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho testom viacnásobného porovnania. siGPR17: Dvojcestná ANOVA nasledovaná Sidakovým testom viacnásobného porovnania. * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0,01.

Porovnanie lipidomických údajov získaných z GPR17-umlčaných a kontrol v každom časovom bode nám umožnilo identifikovať lipidy, ktoré boli významne ovplyvnené umlčaním GPR17. Po 2 DID sa nezistili žiadne významné zmeny (údaje nie sú uvedené). Po 3 DID bol diacylfosfatidylcholín (PCaa) C40:4 menej hojný a diacyl-fosfatidyletanolamínPEaa) C34:3 bol hojnejší v GPR17- umlčaných OPC (obrázok 8a). Po 5 dňoch diferenciácie viedlo umlčanie GPR17 k niekoľkým zmenám v množstve lipidov: zníženie niekoľkých diacyl-PC a diacyl-PE a súčasné zvýšenie niekoľkých plazmogénov (acyl alkyl-PC) spolu so sfingomyelínom (SM) C18:1 a SM (OH) C16:1 (obrázok 8b). Tieto údaje naznačujú, že downregulácia GPR17 mení lipidový profil hlavnej zložky myelínu ako PC a PE.

Obrázok 8.Lipidomické zmeny indukované umlčaním GPR17 v OPC. ( a, b ) Množstvo každého lipidu po umlčaní GPR17 bolo normalizované na množstvo v relatívnej kontrolnej vzorke. Výsledné násobné zmeny sa použili na vytvorenie grafu sopky pre každý časový bod (3, 5 dní v diferenciácii). Body nad bodkovanou horizontálnou čiarou predstavujú metabolity, ktoré vykazovali štatisticky významnú zmenu (Fisherova LSD korigovaná pomocou FDR; p.adj < 0.1). Zelenou lipidy s nižšou expresiou, červenou farbou lipidy s vyššou expresiou po umlčaní GPR17. n=5 na skupinu.

Požiadajte o viac:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

OBCHOD:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop