Esenciálny olej Camellia Japonica inhibuje produkciu melanínu indukovanú MSH a aktivitu tyrozinázy v bunkách melanómu B16F10

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Si Young Ha, Ji Young Jung a Jae-Kyung Yang

Esenciálne oleje sú aromatické oleje extrahované z listov, stoniek, šupiek, okvetných lístkov a koreňov aromatických rastlín pestovaných v prírode alebo pestovaných ekologickými metódami a ako prírodné látky majú rôzne medicínske účinky. Esenciálny olej extrahovaný zo semien Camelliajaponica vykazuje rôzne funkčné vlastnosti; však jehotyrozinázainhibičná aktivita nebola extenzívne skúmaná. Táto štúdia sa vykonáva na skúmanie chemického zloženia a inhibičnej aktivity tyrozinázyEsenciálny olej z kamélie japonskej(CJS-EO). Hexametylcyklotrisiloxán (42,36 percent) a oktametylcyklotetrasiloxán (23,28 percent) sú dve primárne zložky CJS-EO, ako boli identifikované pomocou plynovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie.The inhibičné aktivityCJS-EOa pozitívna kontrola arbutín sa ďalej hodnotia proti hubovej tyrozináze.ThVýsledky ukazujú, že CJS-EO a arbutín inhibujútyrozinázačinnosť. Okrem toho CJS-EO významne inhibuje melanogenézu v skupine liečenej hormónom stimulujúcim melanocyty a potláča sa významné množstvo melanínu. Na zistenie príčiny CJS-EOtyrozinázainhibičný účinok a melaninredukčný účinok, vykonávajú sa genetické a proteínové analýzy. Na základe našich výsledkov sme dospeli k predbežnému záveruCJS-EOmôže inhibovať melanocyty pred škodlivými faktormi, ako je proteín súvisiaci s tyrozinázou. Tieto výsledky demonštrujú, že CJS-EO má potencantityrozinázovú aktivitu a môže byť dobrým kožnýmbielenieagent.

Kliknite naCistanche UK pre inhibítory tyrozinázy.

Úvod

Farbu kože ovplyvňujú pigmenty, ako je melanín v epiderme, hemoglobín v krvných cievach dermy a karotén v podkožnom tkanive. Medzi nimi je vonkajšia farba kože určená množstvom a distribúciou melanínového pigmentu [1]. Enzýmy zapojené do syntézy inmelanínu sú dobre známe akotyrozináza, proteín súvisiaci s tyrozinázou-1 (TRP-1) a dopachrómová tautomeráza (DCT, TRP-2) [2]. Medzi nimi je tyrozináza enzým pôsobiaci v počiatočnej reakcii, ktorá je krokom určujúcim rýchlosť syntézy melanínu, a oxiduje tyrozinázu na DOPA chinón [3]. Preto látky, ktoré inhibujútyrozináza,TRP-1 a TRP-2 môžu inhibovať syntézu melanínu, a tak mať pleťbieleniefunkcia [4]. Melanín hrá dôležitú úlohu pri ochrane pokožky pred UV žiarením a vonkajšími škodlivými faktormi ľudskej pokožky. Ak sa ho však tvorí v nadbytku a hromadí sa na koži, môže spôsobiť melazmu, pehy, škvrny na koži atď. a môže viesť k bunkovej smrti v dôsledku toxicity prekurzorov melanínu a chorôb, ako je rakovina kože [5–7].

Kyselina L-askorbová, arbutín a kyselina mliečna boli vyvinuté ako reprezentatívne inhibítory produkcie melanínu, ale ich použitie je prísne regulované z dôvodu podráždenia pokožky alebo bezpečnostných problémov. Preto sa aktívne uskutočňuje výskum s cieľom nájsť prírodné bieliace činidlo, ktoré je bezpečné a účinné [8].

Je známe, že rastlinné esenciálne oleje vykazujú rôzne funkčné vlastnosti, ako je silná antibakteriálna aktivita a účinky proti starnutiu a regenerácii pokožky [9, 10]. Esenciálny olej Cinnamomum cassia [4], esenciálny olej Polygonum odoratum [11] a esenciálny olej z listov Vitex negundo Linn [12] obsahujútyrozinázainhibičné aktivity.

Camellia japonica (japonský názov „tsubaki“) je v Japonsku obľúbeným stromom ako záhradná rastlina, ale aj ako zdroj ropy a ľudovej medicíny [13]. V Kórei, C. japonica je vždyzelený strom patriaci do čeľade Theaceae a rodu Camellia [14]. Olej zo semien C. japonica má dlhú históriu používania ako kozmetický ochranný prostriedok na zabezpečenie zdravia pokožky a vlasov a ako upokojujúci prostriedok [15]. Uvádza sa, že olej z C. japonicase vykazuje rôzne biologické aktivity, vrátane antioxidačnej aktivity [16], antibakteriálnej aktivity [17], protizápalovej aktivity [18] a kožnej bariéry [19]. Napriek širokému použitiu len málo štúdií skúmalo účinky oleja zo semien C. japonica na pokožku.bielenie-príslušnéhotyrozinázačinnosť.

Preto v tejto štúdii chemické zloženie C. Esenciálny olej japonica (CJS-EO) bol skúmaný pomocou plynovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie (GC-MS) atyrozinázabola skúmaná inhibičná aktivita tohto esenciálneho oleja. Ak chcete riešiť túto inhibičnú aktivitu, účinkyCJS-EOHodnotila sa melanogenéza stimulovaná -MSH a inhibícia tyrozinázy v bunkách melanómu B16F10.

2. Materiály a metódy

2.1. Rastlinné materiály.

Semená C. japonica boli zakúpené v marci 2021 od Seohyeon Herbal Medicine FarmingAssociation, Nonsan, Južná Kórea. Rastlinné materiály identifikoval Hee-Gon Kang, zástupca z experimentálneho lesa Gyeongsang National University.

Cistanche patrí medzi tradičnú čínsku medicínu

2.2. Činidlá.

Hubatyrozinázabola zakúpená od T-3824 (Sigma–Aldrich, USA) a myš B16F10 mela noma bola zakúpená od CRL-6475 (AmericanType Culture Collection, Manassas, VA, USA). Médiá a činidlá potrebné na kultiváciu buniek boli zakúpené od Invitrogen (USA), Sigma (USA) a Nunc (USA). Použil sa forwestern blot, súprava western blot a polosuchý prenosový systém (Bio-Rad, USA) a výsledky boli potvrdené pomocou systému analýzy obrazu (Bio-Rad, USA). Protilátky boli zakúpené od Santa Cruz Biotech (USA). sulfoxid (DMSO) bol zakúpený od Sigma--Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.3. Extrakcia a príprava vzoriek.

Extrakcia sa uskutočňovala pomocou metódy publikovanej predtým s miernymi úpravami [4]. Stručne, semená C. japonica (500 g) sa umiestnili do nádoby a extrahovali sa destiláciou s použitím 2000 ml vody počas 4 hodín. Vzniknutá para sa ochladila pomocou uzavretého chladiaceho systému a výsledná kvapalina sa zachytila ​​v nádobe. - olej sa vznášal smerom k hornej časti destilovanej kvapaliny, zatiaľ čo voda sa usadila v spodnej fáze kvapaliny; teda,CJS-EOsa získal odstránením hornej fázy kvapaliny, ktorá obsahovala požadovaný olej, a potom sa skladoval pri teplote -20 stupňov až do použitia. Na bunkové experimenty sa použil 500 ppm zásobný roztok CJS-EO v DMSO.

2.4. GC-MS analýza.

Prchavé zložkyCJS-EOboli analyzované pomocou GC-MS (Clarus 600 GC-MS, PerkinElmer, Shelton, CT, USA). Použitý analytický stĺpec bol PerkinElmer Elite-5 ms (3{{10}} mm × 0,3 mm × 0,25 μm). Ako mobilná fáza sa použilo plynné hélium (1,0 ml/min). Teplota pece sa zvýšila zo 40 stupňov na 100 stupňov rýchlosťou 10 stupňov/min a potom sa udržiavala počas 1,0 minúty. Potom sa teplota zvýšila na 230 stupňov rýchlosťou 10 stupňov/min a potom sa udržiavala 5 minút. Teplota injektora bola nastavená na 200 stupňov a teplota detektora bola nastavená na 250 stupňov. Analyzované výsledky boli identifikované pomocou programu NIST Mass Spectral Search Program (verzia 2,0 g, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, USA).

2.5. Bunková kultúra.

Bunky myšacieho melanómu B16F10 boli zakúpené od banky Korea Cell Line Bank. Bunková kultúra sa uskutočnila s použitím DMEM (WELGENE, Daegu, Kórea) doplneného 10 percentami FBS (fetálne hovädzie sérum, WEL GENE, Daegu, Kórea) a 1 percentom penicilín-streptomycínu (Gibco BRL) pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2. Aby sa vyriešil fenomén nadmernej hustoty spôsobený proliferáciou počtu buniek, kultivované bunky B16F10 sa udržiavali vo vhodnom počte pomocou trypsínu (Hyclone, USA).

2.6. Test bunkovej životaschopnosti.

Bunky melanómu B16F10 sa vysiali v koncentrácii 3 x 104/ml na 6-jamkovú doštičku na bunkovú kultúru.CJS-EObol ošetrený vhodnou koncentráciou (31,25 ppm až 500 ppm) na jamku. - médium sa odstránilo po 72 hodinách a pridalo sa 200 μl roztoku 3-(4,{8}}dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromidu (MTT) (Promega, Madison, WI, USA). MTT činidlo sa po inkubácii v 37 stupňovom CO2 inkubátore počas 2 hodín čisto odstránilo. Pre zafarbené bunky boli ošetrené 2 ml DMSO, aby sa rozpustil všetok formazan vytvorený v jamkách. Životaschopnosť buniek sa merala absorbanciou pri 540 nm pomocou čítačky ELISA (SpectraMax190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA).

2.7. Test tyrozinázovej aktivity.

tyrozinázaaktivita bola odhadnutá meraním rýchlosti oxidácie L-DOPA [20]. Bunky B16F10 (2 x 105 buniek/jamka) boli ošetrené hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH) aCJS-EOa kultivované 3 dni. Bunky sa zozbierali, pridal sa lyzačný pufor (1 percento Triton X-100, 0,1 M PMSF) a potom sa bunky lýzovali reakciou pri 4 stupňoch počas 1 hodiny. -e supernatant sa zhromaždil centrifugáciou pri 12,000xg počas 15 minút. Po kvantifikácii proteínu v zozbieranom supernatante sa pridalo 10 mmol/ml L-DOPA. Ďalej boli bunky inkubované v C02 inkubátore pri 37 stupňoch počas 30 minút a absorbancia pri 490 nm bola zaznamenaná pomocou absorbančnej mikrodoštičkovej čítačky (SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA). Získané údaje boli vypočítané pomocou nasledujúceho vzorca: aktivita tyrozinázy (percentá) � (OD490 vzorky/OD490 kontroly) x 100.

2.8. Test obsahu melanínu.

Bunky B16F10 sa naočkovali na asi šesťjamkovú platňu (2 x 105 buniek/jamka) počas 12 hodín po obnovení kultivačného média buniek ošetrených rôznymi koncentráciami CJS-EO a -MSH počas 48 hodín a dvakrát premyli PBS [21]. Bunky B16F10 boli ošetrené -MSH aCJS-EOspolu, kultivovali sa 3 dni a bunky sa zozbierali a dvakrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Potom sa spracuje s 1N NaOH obsahujúcim 10 percent DMSO a nechá sa reagovať pri 80 stupňoch počas 1 hodiny. Na analýzu obsahu melanínu sa absorbancia merala pri 475 nm s použitím čítačky absorbancie mikrodoštičiek (SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA). -e percentuálna hodnota buniek ošetrených CJS-EO sa vypočítala vzhľadom na negatívnu kontrolu. Podrobne sa na stanovenie koncentrácie proteínu v každej vzorke použila súprava BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). - obsah emelanínu bol normalizovaný na koncentráciu bunkového proteínu (absorbancia melanínu/ug proteínu).

2.9. Skúmanie génov.

Bunky melanómu B16F10 boli naočkované do 100 mm misky v hustote 1 x 106 buniek v DMEM (GIBCO, USA) doplnenom 10 percentami hovädzieho dobytka a 1 percentami antibiotík; následne boli inkubované v 5 percentách CO2 pri 37 stupňoch. Po zmene na čerstvé 10 percent DMEMmedium,CJS-EOsa pridalo na kultivačný tanier a kultivovalo sa 3 dni a pridalo sa 1 percento Amisoftu ako povrchovo aktívnej látky v množstve zodpovedajúcom 1/1,000 objemu média. Po 3 dňoch sa 1 ml TRIzolu (Invitrogen, USA ) bol pridaný k bunkám, aby sa preskúmala hladina expresie mRNAbieleniepríbuzných génov a RNA sa izolovala pomocou izolačnej metódy Invitrogen'sRNA. Po kvantifikácii množstva RNA pri 260 nm pomocou ultrafialového detektora sa uskutočnila reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR). Pre RT-PCR sa použila súprava all-in-one RT-PCR (Super Bio, Kórea), experiment sa uskutočnil na základe inštrukcií výrobcu a priméry a reakčné podmienky boli nasledovné: sekvencia aktínu bola 5′- GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3';antisense, 5′-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3';reverzná transkripcia pri 50 stupňoch počas 30 minút; reverzná transkriptáza inaktivovaná pri 96 stupňoch počas 3 minút, 94 stupňoch počas 30 s a 62 stupňoch počas 1 minúty, po ktorých nasleduje 25 cyklov pri 72 stupňoch počas 1 minúty. Postupnosťtyrozinázabol 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT 3'; antisense, 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3';denaturovaný pri 90 stupňoch počas 30 s; reverzná transkripcia pri 60 stupňoch počas 30 minút; reverzná transkriptáza inaktivovaná pri 94 stupňoch počas 1 minúty. Potom sa uskutočnila PCR počas 30 cyklov pri 94 stupňoch počas 30 s, 56 stupňoch počas 30 s a 72 stupňoch počas 1 minúty. -e sekvencia proteínu 1 súvisiaceho s tyrozinázou (TRP-1) bola 5'-GCT GCA GGAGCC TTC TTT CTC-3'; antisense, 5′-AAG ACG CTG CACTGC TGG TCT-3'; denaturovaný pri 90 stupňoch počas 30 s; reverzná transkripcia pri 60 stupňoch počas 30 minút; reverzná transkriptáza inaktivovaná pri 94 stupňoch počas 1 minúty. Potom sa uskutočnila PCR v 30 cykloch pri 94 stupňoch počas 30 s, 56 stupňoch 30 s a 72 stupňoch 1 min. -e postupnosťtyrozináza-príbuzný proteín 2 was5'-TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'; antisense, 5′-CGGTTG TGA CCA ATG GGT GCC-3'; reverzná transkripcia pri 50 stupňoch počas 30 minút; inaktivácia reverznej transkriptázy pri 96 stupňoch počas 3 minút, 94 stupňoch počas 1 minúty a 60 stupňoch počas 1 minúty. Následne sa uskutočnilo 72 PCR reakcií v 25 cykloch počas 1 minúty.

2.10. Skúmanie expresie proteínov.

Myšie bunky melanómu B16F10 sa naočkovali do 100 mm misky pri hustote 5 x 105 buniek v DMEM doplnenom 10 percentami FBS a 1 percentami antibiotík a potom sa kultivovali v 5 percentách CO2 pri 37 stupňoch počas 1 dňa. Následne boli vymenené za nové médium aCJS-EObol ošetrený v rôznych koncentráciách a kultivovaný počas 3 dní. Pridal sa 1% vodný roztok Amisoftu ako povrchovo aktívnej látky v objeme zodpovedajúcom 1/1000 objemu média. -e kultivované bunky boli premyté PBS a prenesené do 1,5 ml mikroskúmavky a potom do tlmivého roztoku na rozrušenie buniek (40 mM Tris-Cl [pH 7,4], 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 1 mM PMSF a koktail inhibítorov proteázy). Po zničení buniek pridaním sa uskutočnila centrifugácia pri 15, 000 rpm pri 4 stupňoch počas 10 minút a supernatant sa izoloval, aby sa oddelili proteíny. Izolované proteíny -e sa kvantifikovali použitím metódy Sigma'sBCA a uskutočnila sa SDS-PAGE. Po prenose SDS-PAGE gélu na PVDF membránu sa proteín označil pomocou sekundárnej protilátky konjugovanej s primárnou protilátkou a peroxidázou a potom sa exponoval na rôntgenový film pomocou detekčnej súpravy Western blot (Intron, Kórea). Následne sa analyzovali hladiny expresie.

3. Výsledky

3.1. Chemické zloženie CJS-EO.

CJS-EO sa získal s výťažkom 18 % hmotn. Chemické zloženie CJS-EO sa analyzovalo pomocou GC-MS (tabuľka 1). Píky -e sa oddelili pomocou GC a pomocou MS sa identifikovalo 17 zlúčenín, ktoré tvorili 90 percent celkovej plochy píku (tabuľka 1). - hlavné chemické zložkyCJS-EOboli hexametylcyklotrisiloxán (42,36 percenta), oktametylcyklotetrasiloxán (23,28 percenta), dekametylcyklopentasiloxán (5,81 percenta), kyselina hexándiová (5,56 percenta) a vanilín (2,96 percenta). V predchádzajúcom výskume GC-MS analýza detekovala hexametylcyklotrisiloxán v extraktoch listov a stoniek Bauhinia acuminataLinn [22]. Prchavé zložky v Moringa oleifera boli zložené hlavne z esterov, kyselín, aldehydov a uhľovodíkov a uhľovodíky sú hlavne hexametylcyklotrisiloxán [23]. Podobne v našej štúdii bol hexametylcyklotrisiloxán potvrdený ako hlavná chemická zložka CJS-EO. Jedna z hlavných chemických zložiek CJS-EO, vanilín, bola zistená v esenciálnom oleji Eugenia caryophyllata a Ocimum basilicum[24], esenciálnom oleji Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae) [25] a esenciálnom oleji Calea clematidea [26]. V predchádzajúcich štúdiách bol inhibičný účinok vanilínu na aktivity monofenolázy a difenolázy obsiahnutých vtyrozinázauž bolo uvedené [27]. Je zaujímavé, že cyklické prchavé metylsiloxánové zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou vrátane hexametylcyklotrisiloxánu sa používajú v rôznych kozmetických výrobkoch a výrobkoch osobnej hygieny a mnohých iných spotrebiteľských výrobkoch [28]. V budúcnosti má byť zlúčenina zodpovedná za inhibíciu produkcie melanínu a aktivity tyrozinázy extrahovaná a mohla by sa použiť v prírodnej kozmetike alebo medicíne.

3.2. Životaschopnosť buniek melanómu indukovaná CJS-EO.

Naše výsledky ukázali, že bunky myšacieho melanómu B16F10 boli ošetrené koncentráciou 31,25 až 500 ppmCJS-EOpočas 24 hodín neindukovali žiadne zmeny v životaschopnosti buniek. Pri koncentrácii 31,25 až 500 ppm bola životaschopnosť buniek 90 percent až 100 percent, čo indikovalo nízku cytotoxicitu (obrázok 1). - Preto boli všetky koncentrácie (31,25 až 500 ppm) vhodné na ďalšie hodnotenie účinkov CJS-EO natyrozinázaaktivitu a syntézu melanínu v bunkách B16F10.

3.3. Inhibícia intracelulárnej tyrozinázovej aktivity CJS-EO.

ÚčinokCJS-EOo oxidácii bytrozinázy katalyzovanej L-DOPA, ako aj arbutínu, známehotyrozinázainhibítor, bol skúmaný. Ako je znázornené na obrázku 2, CJS-EO andarbutín vykazoval silné inhibičné účinky na aktivitu L-DOPA oxidázy spôsobom závislým od dávky. Výsledky ukazujú, že CJS-EO a arbutín vykazovali podobné inhibičné aktivity tyrozinázy. Na základe štatistickej analýzy mal arbutín významne vyššiu inhibičnú aktivitu tyrozinázy ako CJS-EO pri 125 a 500 ppm. Avšak pri 31,25, 32,50 a 250 ppm boli indikované podobné inhibičné účinky (nevýznamné) na tyrozinázu v porovnaní s tyrozinázovou inhibičnou aktivitou CJS-EO na dobre známy inhibítor tyrozinázy arbutín.

3.4. Účinok CJS-EO na obsah melanínu v bunkách B16F10.

Aby sa potvrdilo, či CJS-EO prispel k inhibícii produkcie melanínu, analyzoval sa rozdiel v sekrécii melanínu po ošetrení každou koncentráciou CJS-EO v prostredí, ktoré podporuje produkciu melanínu stimuláciou -MSH.CJS-EObol ošetrený v koncentráciách 31,25, 62,5, 125, 250 a 500 ppm, rovnakým spôsobom ako prityrozinázačinnosť. CJS-EO signifikantne inhiboval melanogenézu v skupine liečenej -MSH a významné množstvo melanínu bolo potlačené (obrázok 3(b)). - bolo podobné pozorovaniu pri pozitívnej kontrole, arbutíne (obrázok 3(a)). Najmä pri najnižšej koncentrácii 32,25 ppm v liečenej skupine sa obsah melanínu významne znížil v porovnaní s neliečenou skupinou (0 ppm). Preto sa dospelo k záveru, že CJS EO účinne inhibuje syntézu alebo sekréciu buniek melaninínu B16F10. V skupinách liečených 31,25, 62,5, 125, 250 a 500 ppm CJS-EO sa obsah melanínu znížil 1,1, 1,5, 2,6, 2,7 a 4,3-krát v porovnaní s neliečenou skupinou, čo naznačuje výrazný inhibítor sekrécie melanínu účinok. - Výsledky testu cytotoxicity, testu inhibície tyrozinázy a testu obsahu melanínu naznačujú, že CJS-EO je mimoriadne cenný ako prírodný materiál vbieleniekozmetika.

3.5. Genetické vyšetrovanie.

Na určenie génu vCJS-EOktorý inhibuje biosyntézu melanínu ovplyvnením expresie génov zapojených do dráhy biosyntézy melanínu, experiment sa uskutočnil pomocou metódy RT-PCR a výsledky sú znázornené na obrázku 4. -MSH sa použil ako anegatívna kontrola a CJS-EO vykazoval inhibičné účinky na expresiu tyrozinázy, TRP-1 a TRP-2 vo všetkých koncentráciách. Konkrétne CJS-EO inhiboval expresiu tyrozinázy o viac ako 50 percent pri 125 ppm alebo vyššej. Zistili sme, že inhibičná účinnosťtyrozináza, expresia TRP-1 a TRP{1}} klesala so zvyšujúcou sa koncentráciou CJS EO. Výsledky tohto experimentu naznačujú, že inhibičný účinok CJS-EO na melanogenézu prispel k inhibícii expresie tyrozinázy, TRP-1 a TRP-2.

3.6. Skúmanie expresie proteínov.

Účinok CJS-EO na expresiu proteínov zapojených do biosyntézy melanínu bol potvrdený pomocou Western blottingu a výsledky sú znázornené na obrázku 5. Keď sa CJS-EO porovnal so skupinou liečenou -MSH, ktorá bola negatívnou kontrolnou skupinou, bolo to potvrdil toCJS-EOvykazovali inhibičný účinok; v skutočnosti CJS-EO vykazoval najvýraznejší inhibičný účinok na tyrozinázu a TRP-2. -e stupeň inhibície bol 46,6 percent a 40,7 percent pri 500 ppm tyrozinázy a TRP-2, v tomto poradí, v porovnaní so skupinou liečenou -MSH. Hoci TRP-1naznačovala najmenší inhibičný účinok, vykazovala významný pokles v porovnaní so skupinou liečenou -MSH. Proteínová analýza preto ukázala rovnaký trend ako genoanalýza a potvrdilo sa, že CJS-EO stimulovaltyrozináza, TRP-1 a TRP-2 na vyvolanie redukcie melanínu.

4. Diskusia

tyrozinázaje enzým podieľajúci sa na tvorbe melanínu prostredníctvom enzymatickej oxidačnej dráhy, ktorá určuje farbu pokožky, vlasov a očí, ako aj zhnednutie niektorých potravín [29]. Chemické látky, ktoré vykazujú antityrozinázovú aktivitu, sa používajú v klinickej medicíne na liečbu dermatologických porúch spojených s hyperpigmentáciou melanínu [30]. Produkcia melanínu môže prispieť k niektorým histopatologickým znakom výlučne pri malígnom nádore [31]. Preto môžu antityrozinázové látky uľahčiť liečbu rakoviny kože. V posledných rokoch vzrástol záujem o používanie prírodných produktov namiesto chemických alebo syntetických zlúčenín, pretože sú ekonomickejšie, ekologickejšie a bezpečnejšie [32]. Okrem toho je dôležitý výskum a vývoj ekologických technológií a lacných surovín. v priemysle, ako aj na zlepšenie využívania rastlinných zdrojov. Nedávno bola zaznamenaná antityrozinázová aktivita niektorých rastlín [33]. Údaje týkajúce sa esenciálnych olejov prírodných rastlín sú však obmedzené. Preto identifikácia rastlinných esenciálnych olejov, ktoré majú vysokú antityrozinázovú aktivitu, vyvolala značný záujem. Etiológia pigmentácie nie je dobre pochopená. Biosyntéza melanínu je katalyzovaná enzýmami špecifickými pre melanocyty, ako sú TRP-1 a TRP-2 [34].tyrozinázaje životne dôležitý pre biosyntézu melanocytov a je známy už mnoho desaťročí [34]. Preto je tyrozináza dôležitým indexom pri liečbe pigmentácie. V našej štúdii CJS-EO znížila syntézu melanínu a ovplyvnila aktivitu antityrozinázy; preto sme usúdili, že antimelanogenéza prostredníctvom CJS-EO môže byť spojená s inými enzýmami (TRP-1 a TRP-2). Uvádza sa, že prchavé látky vykazujú vysokú antioxidačnú aktivitu [35]. Ako prchavé látky sa CJS-EO vyznačuje štipľavým zápachom. Je syntetizovaný rastlinami ako sekundárne metabolity a je široko používaný vďaka svojim baktericídnym, virucídnym, fungicídnym, protirakovinovým, antioxidačným a antidiabetickým účinkom [36]. -e CJS-EO skúmaný v tejto štúdii pozostával predovšetkým z hexametylcyklotrisiloxánu, ktorý predstavoval 42,36 percenta celkového chemického obsahu. Ukázalo sa, že Toxicodendron vernicifluum obsahujúci hexametylcyklotrisiloxán vykazuje rôzne biologické a farmakologické účinky vrátane centrálnych, antimikrobiálnych a protinádorových účinkov [37]. V našej štúdii vysoké koncentrácie CJS-EO naznačovali len mierne cytotoxické účinky na melanocyty. Preto sa pozoroval inhibičný účinok CJS-EO na -MSH-indukovanú propagáciu buniek B16F10. Výsledky ukázali, že predbežné ošetrenie CJS-EO znížilo bunkovú propagáciu indukovanú MSH spôsobom závislým od dávky (obrázok 3) a tieto výsledky boli podobné s čistým arbutínom použitým ako pozitívna kontrola. Vo väčšine prírodných esenciálnych olejov používaných v tradičnej medicíne sa namiesto čistých zlúčenín používajú extrakty obsahujúce komplexné zlúčeniny. Tieto prírodné esenciálne oleje zvyčajne neobsahujú prchavé zlúčeniny s vysoko špecifickými biologickými aktivitami, ale prchavé zlúčeniny so širšími interakciami [38]. Preto je ťažké, aby CJS-EO, ktorý obsahuje veľa zložiek, mal vyšší antimelanogenézny účinok ako čistý arbutín. V budúcnosti je potrebné oddeliť prchavé zložky obsiahnuté vCJS-EOa študovať antimelanogenézny účinok na oddelenú jedinú zložku. Na základe našich výsledkov sme predbežne dospeli k záveru, že CJS-EO môže inhibovať melanocyty pred škodlivými faktormi, ako je TRP-1 (obrázky 4 a 5).Thpreto sme predpokladali, že hexametylcyklotrisiloxán bol hlavnou biologicky aktívnou zlúčeninou v CJS-EO. Existujúce štúdie týkajúce sabielenievlastnosť CJS-EO je nedostatočná; preto sa môže použiť ako základné údaje v budúcich štúdiách týkajúcich sa hlavných zložiek, ktoré vykazujú bieliacu účinnosť.

5. Závery

Podľa našich najlepších vedomostí je to prvá štúdia, ktorá uvádza účinnosť CJS-EO pri inhibícii produkcie melanínu v bunkách melanómu B16F10. Naše pozorovania ukázali, že CJS-EO inhiboval -MSH-indukovanú melanogenézu prostredníctvomtyrozinázainaktiváciu a súčasné potlačenie expresie proteínov zapojených do biosyntézy melanínu v bunkách melanómu B16F10.CJS-EOje známe, že je bezpečný, a v tejto štúdii sme potvrdili, že je necytotoxický.ThPreto môže byť CJS-EO potenciálne použitý ako účinný kožnýbieleniečinidlo pre budúci vývoj doplnkovej a alternatívnej medicíny založenej na aromaterapii.