CD8 a CD4 T bunkové populácie v ľudských obličkách
Mar 25, 2022
Abstrakt:Pozadie: Na hraničných miestach a vo vnútorných orgánoch prispievajú tkanivovo-rezidentné pamäťové T bunky (TRM) k imunitnej bariére proti patogénom, ako sú vírusy, baktérie, huby a rakovina. Informácie o prítomnosti a funkcii týchto buniek v ľudských obličkách sú však nedostatočné. Aby sme lepšie porozumeli imunologickej obrane tohto orgánu sprostredkovanej T bunkami, zamerali sme sa na určenie fenotypových a funkčných aspektov CD8 a CD4 T buniek prítomných v zdravých a aloimplantátoch.obličky tkaniva. Metódy: Pomocou viackanálovej cytometrie sme hodnotili fenotyp a funkciu T buniek vo vzorkách zdravého obličkového tkaniva (n=5) aobličkytkanivo aloštepu (n=7) a porovnali tieto aspekty s T bunkami v periférnej krvi od zdravých kontrol (n=13). Výsledky:Obličkyvzorky tkaniva obsahovali podstatné množstvá CD8 a CD4 T buniek. Na rozdiel od cirkulujúcich buniek,obličkyT bunky často exprimovali CD69 a CD103 a častejšie aktívne cyklovali. Navyše takmer všetkyobličkyT bunky exprimovali CXCR3 a často exprimovali CXCR6 v porovnaní s T bunkami v obehu. výrazne,obličkyT bunky produkovali väčšie množstvá IFN ako cirkulujúce bunky a boli často polyfunkčné. Záver: Funkčné T bunky s charakteristickými znakmi TRM sídlia u človekaobličkytkanív. Tieto bunky častejšie aktívne cyklujú a často exprimujú CXCR3 a CXCR6.
Kľúčové slová:lymfocyty rezidentné v tkanivách; T-bunky; CD8; CD4; CD69; CD103; obličky; aloštepu
CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN
1. ÚvodRezidentné pamäťové T bunky (TRM) pretrvávajú v tkanivách, aby poskytovali dlhodobú lokalizovanú obranu proti patogénom. Na rozdiel od recirkulujúcich T buniek nemožno populácie TRM detegovať v periférnej krvi a výrazne sa líšia od populácií recirkulujúcich T buniek, pokiaľ ide o ich fenotyp, funkciu a metabolizmus [1]. V skutočnosti to nie je prekvapujúce vzhľadom na skutočnosť, že rôzne orgánové systémy, ako napríklad pľúca, sú vystavené vyššiemu zaťaženiu rôznymi patogénmi ako v prípade obehu, ktorý je vo všeobecnosti izolovaný od vonkajšieho sveta [2].Retencia TkM v tkanivách pretrváva roky a je sprostredkovaná mechanizmami, ktoré zahŕňajú os sfingozín-1-fosfátový receptor1 (S1PR1)-sfingozín 1-fosfát (SP1). S1PR1 je receptor exprimovaný T bunkami, ktorý sprostredkováva egresiu zo sekundárnych lymfoidných orgánov po naviazaní na bioaktívnu signálnu molekulu SP1, ktorá je dôležitým mediátorom prenosu T buniek. Táto os môže byť prerušená CD69, membránovo viazaným lektínom typu c, ktorý antagonizuje expresiu S1PR1, čím sprostredkúva retenciu. Okrem toho u myší je expresia S1PR1 indukovaná transkripčným faktorom Krüppel-like Faktor 2 (KLF2), o ktorom sa zistilo, že je znížený v TRM, čím sa tiež inhibuje výstup lymfocytov [3]. Na druhej strane sa ukázalo, že downregulácia KLF2 je sprostredkovaná homológom transkripčného faktora Blimpl v T bunkách (Hobit), ktorý je exprimovaný TpM-špecifickým spôsobom v myších T bunkách [4]. Okrem toho niektoré TRM tiež exprimujú CD103 (integrín E), pričom TRM možno identifikovať pomocou expresie CD69 a CD103 [1].
Zatiaľ čo znalosti o fenotype a funkcii TRM pre rôzne ľudské tkanivá narastajú, o týchto aspektoch sa vie len máloobličky. Tu sú T bunky vystavené odlišnému súboru patogénov, ako sú baktérie vzostupne z dolných močových ciest a renotropné vírusy, ako je polyomavírus BK (BKPyV). Nedávno sme skutočne opísali, ako ľudské obličky obsahujú podskupinu T buniek exprimujúcich CD69 a/alebo CD103, medzi ktorými sú CD8 T bunky špecificky zamerané na BKPyV proteíny viriónový proteín1 (VP1) a veľký T antigénový proteín (LTAG) [5]. My a ďalší sme tiež preukázali prítomnosť CD69/CD103-exprimujúcich invariantné T bunky (MAIT)obličkytkaniva [6,7].
Aby sme lepšie pochopili, aký druh T buniek tvorí lokalizovanú imunitnú odpoveď v tomto orgáne, použili sme viackanálovú prietokovú cytometriu na skúmanie fenotypu a funkcieobličkyTRM, izolované od darcuobličkymateriálu príjemcov obličkového transplantátu (RTR) a od zdravýchobličkytkaniva susediaceho s obličkovými čírymi bunkovými karcinómami, aby sme videli, ako sa tieto populácie porovnávajú s populáciami T buniek v obehu.Našli sme toho človekaobličkytkanivo obsahuje podstatné množstvá CD4 a CD8 T buniek exprimujúcich len CD69, CD69 a CD103, alebo žiadny z týchto markerov. Zistili sme, že bunky CD69-CD103- vobličkytkanivo sa podstatne líši od T buniek v obehu a môže predstavovať populáciu TRM bez kanonických TRM markerov. Okrem toho sme ukázali, že obličkové T bunky častejšie aktívne cyklujú, čo sa dá posúdiť podľa zvýšenej expresie Ki-67 v porovnaní s krvou. Tiež sme zistili, že CD8 a CD4 T bunky vobličkytkanivo takmer vždy exprimuje CXCR3 a často exprimuje CXCR6. Tieto zistenia naznačujú úlohu týchto chemokínových receptorov pri priťahovaní a udržiavaní populácií pamäťových T buniek rezidentných v obličkách.
2. Materiály a metódy
2.1. Pacienti a vzorkyVzorky boli získané z Biobank Renal Diseases v Amsterdame, UMC, AMC. V tejto Biobanke sa vzorky pacientov, ako je krv aobličkytkaniva, sa odoberajú a skladujú zo zdravého životaobličkydarcov a RTR, ktoré sa sledujú pred a po transplantácii obličky. Táto štúdia bola vykonaná v súlade so zásadami uvedenými v Helsinskej a Istanbulskej deklarácii a všetci účastníci poskytli písomný informovaný súhlas pred registráciou do Biobanky. Okrem toho reziduálne tkanivo od pacientov, ktorí podstúpili nádorovú nefrektómiu (obličkové tkanivo vzdialené od nádoru), darovalo oddelenie patológie a tiež sa uložilo v Biobanke. Tieto tkanivá boli spracované anonymne podľa Kódexu správania Federácie holandských lekárskych vedeckých spoločností (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).
2.2. Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC)Vzorky krvi boli získané od cytomegalovírusu (CMV)-séronegatívnych zdravých kontrol (živobličkydarcovia pred operáciou, n= 13). Charakteristiky účastníkov tejto štúdie sú uvedené v tabuľke 1. PBMC sa izolovali z krvi heparínu sodného centrifugáciou v štandardnom hustotnom gradiente a následne sa kryokonzervovali až do dňa analýzy.
2.3. Obličkové tkanivoVzorky tkaniva zdravých obličiek (n {0}}) boli získané z obličiek, ktoré boli chirurgicky odstránené v dôsledku karcinómu obličkových buniek (nenádorové tkanivo vzdialené od kontralaterálneho pólu obličky) a tkaniva transplantovanej obličky (n {{1 }}) sa získal z explantovaných obličkových aloštepov po zlyhaní transplantátu. Tieto vzorky sa označujú ako vzorky zdravých a transplantovaných obličiek. Plátky obličkovej kôry boli nasekané na 1-mm kocky pomocou McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), prenesené do 50 ml skúmaviek a premývané studeným PBS, kým nezmizla krv. viditeľne prítomný a supernatant bol číry. Pridalo sa predhriate (37 stupňov) tráviace médium, 40 ml na 10 g tkaniva (DNAse typ IV (50 KU/ml) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Holandsko), kolagenáza typ IV (0,5 mg/ml) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 ul/ml fetálneho teľacieho séra (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Holandsko), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Holandsko), penicilín-streptomycín (Biochrom GMBH, Berlín, Nemecko) v HBSS (Westburg BV, Leusden, Holandsko)) a inkubovali sa v trepačke 20 minút pri 37 stupňoch. Teplá suspenzia sa preniesla do C-trubice (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Nemecko) a podrobila sa programu M_slezina_04.01 na GentleMacs (Miltenyi). Tráviace médium sa deaktivovalo studeným PBS a výsledná bunková suspenzia prešla cez bunkové sitko, čím sa získala jednobunková suspenzia, ktorá sa podrobila štandardnej centrifugácii v hustotnom gradiente podľa protokolu výrobcu (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Nórsko ). Boli izolované mononukleárne bunky (obličkové MNC).kryokonzervované do dňa analýzy v IMDM doplnenom 20 percentami FCS, 000036 objemovými percentami -merkaptoetanolu, 5 percentami DMSO, penicilínom a streptomycínom.
2.4. Prietoková cytometriaMerania sa uskutočňovali na prietokovom cytometri LSRFortessa (BD Biosciences). Pre každú vzorku sa analyzovalo 2x106 PBMC alebo 0,5x106 až 10x106 obličkových MNC. Objem každej farbiacej reakcie bol relatívny k počtu buniek a koncentrácie protilátok zostali konštantné. Bunky sa inkubovali s povrchovými protilátkami (doplnková tabuľka S1) počas 30 minút pri 4 stupňoch v tme. Mŕtve bunky boli vylúčené s použitím fixovateľného farbiva eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonálne protilátky s intracelulárnymi cieľmi (doplnková tabuľka S1) sa pridali po fixácii a permeabilizácii buniek pomocou FoxP3/Transcription Factor Stained Set (eBioscience Inc.). Boli dodržané publikované metódy prietokovej cytometrie a triedenia buniek na imunologické účely [8]. Stratégiu hradlovania použitú na fenotypovú analýzu možno nájsť na doplnkovom obrázku S1. Už sme predtým ukázali, že žiadny z analyzovaných markerov nebol ovplyvnený metódou trávenia používanou na izoláciu obličkových MNC [7].
Obmedzenia vzoriek tkaniva viedli k vylúčeniu vzoriek zo závesových panelov. Počty buniek CD3 plus analyzované na vzorku v zdravých PBMC, zdravých obličkových MNC a TX obličkách možno nájsť na obrázku S3. Vzorky MNC sa analyzovali iba vtedy, keď obsahovali viac ako 50 percent živých buniek v lymfocytoch, ako bolo hodnotené pomocou dvoch viability, a podskupiny T buniek založené na CD69/CD103 sa ďalej charakterizovali len vtedy, ak ich celkový počet buniek presiahol 50.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
2.5. Stimulačný testPBMC a obličkové MNC boli stimulované, ako už bolo opísané [7,9]. PBMC a obličkové MNC sa rozmrazili v prítomnosti DNAázy I (200 KU/ml), premyli a nechali sa zotaviť cez noc na neošetrených 96-jamkových platniach s okrúhlym dnom (Corning) v kultivačnom médiu (RPMI doplnené o 10 percent FCS a penicilín-streptomycín) v koncentrácii 20 x 106/ml （100 μl/jamka）.
Nasledujúce ráno sa na stimuláciu buniek pridal forbol 12-myristát 13-acetát (PMA, 10 ng/ml; Sigma Aldrich) a ionomycín (1 ug/ml; Sigma Aldrich). Ako negatívna kontrola sa pridalo samotné médium. Všetky inkubácie sa uskutočňovali v kultivačnom médiu v prítomnosti CD28 (klon 15E8; 2 ug/ml), CD29 (klon TS 2/16; 1 ug/ml), brefeldínu A (10 ug/ml, Invitrogen) a GolgiStop ( BD Biosciences) v konečnom objeme 200 ul počas 4 hodín pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2.
Následne sa bunky inkubovali 30 minút s povrchovými protilátkami (doplnková tabuľka S2). Mŕtve bunky boli vylúčené s použitím fixovateľného farbiva eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonálne protilátky na intracelulárne farbenie (tabuľka S1) sa pridali po fixácii a permeabilizácii buniek pomocou súpravy Cytofix/Cytoperm Reagent Set (BD Biosciences). Bunky sa dvakrát premyli a analyzovali na prietokovom cytometri LSRFortessa. Stratégiu hradlovania použitú vo funkčnej analýze možno nájsť na doplnkovom obrázku S2. Na určenie polyfunkčnosti každej podskupiny T buniek sa vypočítal priemerný počet funkcií každej populácie pomocou nasledujúceho vzorca: ((percento buniek produkujúcich 1 cytokín]*1) plus ([percento buniek produkujúcich 2 cytokíny]*2) plus ([percento buniek produkujúcich 3 cytokíny]*3) plus ([percento buniek produkujúcich 4 cytokíny]*4) plus ([percento buniek produkujúcich všetkých 5 cytokínov]*5))/100.
2.6. Analýza údajov
Dáta sa analyzovali pomocou FlowJo verzie 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Všetky grafy a obrázky boli vytvorené pomocou Graphpad Prism verzie 8.00 pre Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Rovnaký program bol použitý aj na štatistické analýzy údajov. Na určenie významnosti nepárových vzoriek bol použitý neparametrický Mann-Whitney-U test. Na porovnanie párových vzoriek sa použil Wilcoxonov test so znamienkom. p-hodnoty<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Výsledky
3.1. Odlišná expresia CD8 a/alebo CD4 a markerov osídlenia tkaniva T bunkami v zdravom tkanive obličiekNajprv sme porovnali expresiu CD4 a CD8 CD3-pozitívnymi T bunkami v periférnej krvi s bunkami detekovanými v tkanive zdravých obličiek. CD4-CD8 plus (CD8) T bunky boli signifikantne častejšie detegované v tkanive obličiek ako v krvi ((medián) 25 percent oproti 38 percentám) (obrázok la). Na rozdiel od toho CD4*CD{{9} }(CD4)T bunky boli detegované vo vyšších frekvenciách v krvi ako v obličkovom tkanive ((70 percent vs. 52 percent) obrázok la). Celkovo boli CD4 T bunky pozorované častejšie v zdravom obličkovom tkanive ako CD8 T bunky (obrázok 1b).
Ďalej sme skúmali expresiu tkanivových rezidenčných markerov, CD69 a CD103, v podskupinách T buniek definovaných CD8 a CD{4}}. Ako sa očakávalo, CD69 a CD103 neboli prakticky exprimované bunkami v periférnej krvi (obrázok 1c). V zdravom tkanive boli fenotypy CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus a CD{14}}CD103 plus vyjadrené 46 percentami, 45 percentami, 6,6 percenta a 1,8 percenta CD8T buniek, 61 percent, 38 percent, 0,44 percenta a 0,43 percenta CD4T buniek, v tomto poradí (obrázok lc). Záverom možno povedať, že CD8, ale najmä CD4 T bunky boli detegované v značnom počte v zdravom ľudskom obličkovom tkanive. Okrem toho expresia CD69 a CD103, markerov tkanivovej rezidencie, bola detegovaná primárne medzi T bunkami nachádzajúcimi sa v zdravom tkanive a nie v krvi.
3.2. Rôzne expresné vzorce bežných markerov označujúcich podskupinu podľa T buniek v zdraví/podľa obličkového tkaniva
CD45RA, tyrozínfosfatáza, CCR7, chemokínový receptor, o ktorom je známe, že sprostredkúva prenos T buniek do sekundárnych lymfoidných orgánov, a CD28 a CD27, oba kostimulačné receptory silne zapojené do aktivácie T buniek, sú všetky markery tradične používané na identifikáciu funkčných podskupín T buniek J1{ {53}},1l. Chceli sme zistiť, do akej miery sa distribúcia týchto podskupín v krvi líši od distribúcie v obličkovom tkanive. Ako sa očakávalo, najväčšie podskupiny CD8 T buniek detegované v obehu (tj tie, ktoré sa týkali 5 percent alebo viac z celkovej populácie) boli tie s CD45RA plus CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (naivné T bunky alebo TN, ( medián) 13 percent), CD45RA-CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (bunky centrálnej pamäte alebo TcM, 6 percent), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27 plus (TEv1,30 percent), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27-(Tau2,10 percent), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 percent) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 percent) a CD45RA plus CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 percent )fenotypu. V zdravom tkanive neboli detegované takmer žiadne (0,6 percenta) CD8 T bunky s fenotypom TN a iba niekoľko (0,8 percenta) vykazovalo fenotyp Tax. Naproti tomu CD8 T bunky detegované v zdravom tkanive obličiek pozostávali zo značného množstva TEv1-(22 percent),TEM2-(12 percent), Tpx3-(18 percent),TEx{ {65}} (23 percent) a TEyRA (11 percent) populácie T buniek (obrázok ld a obrázok S4). Pri pohľade na CD4 T bunky v krvi boli najväčšie populácie tie, ktoré exprimovali Ty-(35 percent), TcM-(25 percent), TEMl-(16 percent), TFM2-(9 percent) a populácia s inak nešpecifikovaným fenotypom CD45RAtCCR7-CD28 plus CD27* (0,4 percenta) (obrázok 1d a obrázok S4). V zdravom obličkovom tkanive málo CD4 T buniek exprimovalo TN- (3 percentá) alebo TcM -(3 percentá) fenotypu. Namiesto toho sa v zdravom tkanive zistil značný počet buniek s fenotypom TEM1-(22 percent), TEM2-(40 percent) alebo TEM4(14 percent) (obrázok ld a obrázok S4) . Na záver, distribúcia CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definovaných podskupín CD8 a CD4 T buniek sa medzi krvou a zdravým obličkovým tkanivom podstatne líši.
3.3. CD8 a CD4 T bunky v zdravom ľudskom tkanive obličiek častejšie obsahujú aktívne cyklické bunkyĎalej sme skúmali, či existujú rozdiely v expresii markerov typických pre cytotoxický efektorovo-pamäťový profil medzi populáciami CD8 a CD4 T buniek v krvi a tkanive obličiek. Najprv sme sa pozreli na expresiu transkripčných faktorov T-boxu T-bet a eomeso-dermin (Eomes). Tieto regulátory transkripcie sa priamo podieľajú na vytváraní efektorových buniek akútnej fázy, indukovaní expresie molekúl, ako je interferón-y a granzým B, a pri vytváraní sekundárnych pamäťových reakcií. Ako sa očakávalo, expresia T-bet bola častá medzi cirkulačnými CD8 T bunkami (54 percent), zatiaľ čo cirkulačné CD4 T bunky zriedka exprimovali tento transkripčný faktor (13 percent). Je zaujímavé, že pre CD4 T bunky bola expresia T-bet významne vyššia medzi T bunkami zistenými v tkanive zdravých obličiek ako v obehu (53 percent oproti 13 percentám). Určitá expresia bola tiež detegovaná často medzi obehovými CD8 T bunkami (59 percent), zatiaľ čo medzi obehovými CD4 T bunkami bola opäť zriedkavá (15 percent). Expresia Eomes však bola častejšia medzi CD4 T bunkami v tkanive obličiek (32 percent) ako v krvi (obrázok 2a, b).
Ďalej sme skúmali expresiu granzýmu B, serínovej proteázy, o ktorej je známe, že sprostredkúva apoptózu po injekcii cytotoxických T buniek do cytoplazmy. V súlade s predchádzajúcimi správami sa expresia T-bet a granzýmu B detegovala vo veľkom počte v cirkulujúcich CD8 T bunkách (28 percent). Avšak jeho expresia bola medzi cirkulujúcimi CD4 T bunkami zriedkavá (1 percento), V prípade CD8 T buniek bola expresia granzýmu B podobná v obličkovom tkanive a cirkulujúcich populáciách (28 percent ys. 23 percent) (obrázok 2c). Je zaujímavé, že vyššie frekvencie expresie T-bet a Eomes zistené v obličkových CD4 T bunkách nezodpovedali vyššej frekvencii expresie granzýmu B v tomto kompartmente (5 percent). Potom sme sa zamerali na expresiu KLRGl, koinhibičného receptora, o ktorom je známe, že je prevažne exprimovaný cytotoxickými efektorovými bunkami akútnej fázy a efektorovými pamäťovými bunkami. KLRG1 bol často exprimovaný cirkulujúcimi CD8 T bunkami (54 percent), ale nie CD4 T bunkami ( 10 percent). Nezistili sa žiadne rozdiely medzi anatomickými kompartmentmi v expresii KLRG1l pre CD8 alebo CD4 T bunky. Nakoniec sme skúmali expresiu Ki-67, markera označujúceho aktívne cyklické bunky. V súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami bola expresia Ki-67 medzi cirkulujúcimi CD8 a CD4 T bunkami zriedkavá (1 percento a 2 percentá). Je zaujímavé, že medzi CD8 T bunkami, ale najmä medzi CD4 T bunkami, bola expresia Ki-67 významne častejšie detegovaná v T bunkách v tkanive obličiek (3 percentá a 11 percent, v tomto poradí) (obrázok 2e). Záverom možno povedať, že CD4 T bunky boli detegované v zdravom ľudskom obličkovom tkanive, ale nie CD8 T bunky v tomto kompartmente, častejšie exprimované T-bet a Homes. To sa však nepremietlo do častejšej expresie granzýmu B obličkovými CD4 T bunkami. Navyše, hoci celkový počet cyklujúcich buniek bol nízky, obličkové tkanivo obsahovalo podstatne aktívnejšie cyklujúce CD8 a CD4 T bunky ako cirkulácia.
3.4. CD8 a CD4 T bunky v zdravom tkanive obličiek sú takmer všetky CXCR3-pozíciePotom sme hľadali rozdiely v expresii iných markerov, typických v cirkulujúcich populáciách nie bezprostredne cytotoxických pamäťových buniek, ako bolo uvedené vyššie pre cirkulujúce populácie T buniek. Najprv sme sa zamerali na expresiu IL{0}}R, exprimovanú primárne na naivných a včasne diferencovaných pamäťových bunkách v obehu, kde sa podieľa na udržiavaní homeostatickej proliferácie [10,12,13]. V periférnej krvi bol IL{5}}Ra často exprimovaný CD8 T bunkami (84 percent) a CD4 T bunkami (98 percent). CD8 a CD4 T bunky v zdravom obličkovom tkanive exprimovali tento marker výrazne menej často ako cirkulujúce T bunky (71 percent a 76 percent, v uvedenom poradí) (obrázok 2f).
Ďalej sme skúmali expresiu rôznych iných chemokínových receptorov Zaujímavé je, že CXCR3, chemokínový receptor zapojený do prenosu T-buniek do zapálených tkanív[14-17], bol exprimovaný mimoriadne veľkým počtom CD8 a CD4 T-buniek v obličkovom tkanive (99 percent a 91 percent, v tomto poradí), a výrazne menej často cirkulujúcimi T bunkami (58 percent a 26 percent, v tomto poradí) (obrázok 2g). Nakoniec sme určili expresiu CXCR6, o ktorej je známe, že sa podieľa na tvorbe populácií TRM [18-22]. Zatiaľ čo CXCR6 bol exprimovaný iba malou populáciou cirkulujúcich CD8 T buniek (16 percent), a prakticky nie cirkulujúcich CD4 T buniek. významne väčší podiel CD8 a CD4 T-buniek v obličkovom tkanive exprimoval túto molekulu (40 percent a 40 percent, v tomto poradí) (obrázok 2h). Záverom možno povedať, že markery typicky spojené s nie bezprostredne diferencovaným stavom v obehu, pravdepodobne -7Ra, CCR7, CD28 a CD27, boli významne menej často exprimované obličkovými CD8 a T bunkami v porovnaní s tými v krvi. na rozdiel od toho obličkové T bunky častejšie exprimovali CXCR6 a takmer vždy exprimovali CXCR3.
3.5. Rozdiely vo fenotype medzi zdravou obličkou a aloštepovými T bunkami sú minimálneĎalej sme chceli preskúmať, či tieto nálezy zostali stáť v tkanive z transplantovaných obličkových aloimplantátov, ktoré boli získané pre rôzne klinické indikácie (tabuľka 1).Čo sa týka počtu CD8 a CD4 T buniek v zdravom tkanive a tkanive aloštepu, neboli pozorované žiadne rozdiely (obrázok 3a). Zaznamenali sme však nevýznamný trend smerom k väčšiemu počtu CD4T buniek a menej CD8T bunkám v zdravom tkanive ako v tkanive aloštepu (obrázok 3b). Okrem toho, keď sa pozrieme na expresiu CD69/CD103 a CD45RA/CCR7/CD28/CD{11}}definované podmnožiny, žiadne rozdiely v distribúcii CD69/CD103- alebo CD45RA/CCR7/CD28/CD27- boli zaznamenané definované podskupiny bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4 (obrázok 3d a obrázok S5). Pri skúmaní frekvencií expresie markerov typickejších pre cytotoxické cirkulujúce T bunky sme nezistili žiadne rozdiely v expresii T-bet, KLRG1 alebo granzýmu B medzi T bunkami zdravých obličiek alebo aloštepu (obrázok 3a, gh). Zistili sme, že expresia Eomes bola pozorovaná menej často v aloštepových tkanivových CD4 T bunkách ako v T bunkách zdravých tkanív (obrázok 3f). Neboli pozorované žiadne rozdiely v expresii ostatných markerov. (Obrázok 3-l a obrázok S5b-d). Záverom možno povedať, že okrem nižšej frekvencie expresie Eomes medzi aloštepovými CD4 T bunkami sa populácie buniek medzi študijnými populáciami nelíšili.
3.6. CD69-CD103-bunky T v obličkovom tkanive sa líšia od cirkulujúcich buniekVzhľadom na podobné fenotypové zloženie CD8 a CD4 T buniek nájdených v zdravom tkanive obličiek a v tkanive obličkového aloštepu sme zhromaždili údaje z oboch študijných skupín, aby sme ďalej preskúmali charakteristiky týchto buniek podľa expresie CD69 a CD103. Keďže bunky CD69-CD103 plus boli vždy detegované vo veľmi nízkych frekvenciách(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Najprv sme skúmali rozdiely v týchto podskupinách podľa koexpresie CD69/CD103 v populáciách T buniek obličiek (obrázok 4 a obrázok S6). Je zaujímavé, že v prípade CD8 aj CD4 T buniek boli zaznamenané podstatné rozdiely v distribúcii CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definovaných podskupín medzi CD69-CD103-,CD69 plus CD{10} {14}}a podmnožiny CD69*CD103*. V prípade CD8 T buniek obsahovali CD69-CD103-bunky značnú populáciu buniek TeyRA (21 percent), ktorá bola oveľa menšia medzi podskupinami CD69 plus CD103- a CD69 plus CD103 (5,8 percent a 2,2 percenta). Namiesto toho tieto posledné populácie obsahovali oveľa väčšie subpopulácie TEy3 (13 percent, 30 percent a 32 percent) a TEy4 (8 percent, 19 percent a 33 percent, v tomto poradí). Pokiaľ ide o bunky CD4 T, medzi podskupinami CD69-CD103-, CD69*CD103- a CD69 plus CD103* bolo pozorovaných niekoľko buniek TEyRA (2,6 percenta, 0 percent a 1,7 percenta, v uvedenom poradí). Namiesto toho tieto bunky obsahovali veľké subpopulácie TFw1 (26 percent, 0,24 percent, resp. 10 percent) a TEy2 ells (30 percent, 46 percent a 27 percent, v tomto poradí). Medzi CD69 plus CD103-a najmä medzi bunkami CD69*CD103* bola pozorovaná oveľa väčšia subpopulácia TEM4 (6 percent, 11 percent a 34 percent, v tomto poradí).
Vzhľadom na tieto rozdiely a predchádzajúce pozorovanie, že populácie T-buniek obličiek sotva obsahovali bunky TN a TcM, sme ďalej skúmali bunky CD69-CD103- nachádzajúce sa v tkanive obličiek, aby sme určili, do akej miery boli tieto bunky nielen cirkulujúce bunky prechádzajúce obličkovým obehom. Aby sme to dosiahli, porovnali sme tieto bunky s cirkulujúcimi bunkami. CD69-CD103~ bunky v obličkovom tkanive sa výrazne líšili od buniek v obehu: T-bet, Ki{5}} a CXCR3 boli častejšie exprimované obličkovými T bunkami, bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4 (obrázok 5a-c). Na rozdiel od toho, IL-7R, CCR7, CD28 a CD27 boli všetky výrazne menej často exprimované obličkovými T bunkami CD69-CD103- bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4 (obrázok 5d- g). CD69-CD103-CD4 T bunky v obličkovom tkanive exprimovali KLRG1 významne častejšie ako v krvi a CD69-CD103-CD8 T bunky v obličkovom tkanive exprimovali Eomes významne častejšie ako v krvi.
Ďalej sme chceli vidieť, ako koexpresia CD69 a CD103 ovplyvnila markery funkčného potenciálu. Najprv sme sa pozreli na markery spojené s cytotoxickým potenciálom. Hoci boli zaznamenané rozdiely medzi jednotlivými subpopuláciami, nezistili sa žiadne následné vzory pre T-bet a Eomes v CD8 T bunkách, keď boli CD69 alebo CD103 koexprimované (obrázok 6a, b). Koexpresia CD69 a CD103 (obrázok 6a, b). Pri pohľade na KLRG1 sme si všimli, že v prípade CD8 T buniek expresia KLRG1 klesla spolu s koexpresiou CD69/CD103. Pre CD4 T bunky sa pozoroval podobný trend. Tu však iba bunky CD69-CD103-exprimovali KLRG1 s vyššou frekvenciou ako bunky CD69 plus CD103- a CD69 plus CD103* (obrázok 6c). Frekvencie expresie granzýmu B tiež klesali spolu s markermi tkanivovej rezidencie, pričom frekvencia jeho expresie bola najnižšia medzi CD69 plus CD103* bunkami, v rámci CD8 aj CD4 T buniek (obrázok 6d). Expresia Ki-67, ktorá bola vyššia medzi obličkovými T bunkami v porovnaní s T bunkami v krvi, sa nelíšila podľa koexpresie CD69 alebo CD103 (obrázok 6e).
Potom sme skúmali markery normálne spojené s necytotoxickým pamäťovým profilom podľa koexpresie CD69/CD103. Expresia IL-7Ra, CCR7 a CD28 bola najvyššia v rámci populácie CD69-CD103- s trendom v definovaní expresie spolu s koexpresiou CD69/CD103 (obrázok 6f-h ). Potom sme sa pozreli na expresiu CXCR3 a CXCR6. Oba chemokínové receptory boli najčastejšie exprimované bunkami CD69tCD103t, bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4, a vykazovali stúpajúci trend s koexpresiou CD69/CD103. Len v prípade CXCR6 bol tento trend štatisticky významný a ovplyvnil tak CD8, ako aj CD4 Telly (obrázok 6j,k). Na záver, CD69-CD103- bunky v obličkovom tkanive sa podstatne líšia od buniek v obehu a môžu sa týkať inej populácie TBv, ktorá nie je poznačená expresiou CD69 alebo CD103. Jediný marker, ktorý sa konzistentne líšil, bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4, pokiaľ ide o koexpresiu CD69 a CD103, bol CXCR6.
3.7. T bunky v obličkovom tkanive častejšie produkujú interferón ako T bunky v krviNakoniec sme skúmali kapacitu produkcie cytokínov pomocou CD8/CD4-definovaných populácií T buniek v tkanive obličiek. Najprv sme porovnali produkciu interferónu-y (IFNy), tumor nekrotizujúceho faktora (TNF ), interleukínu-2 (IL-2), faktora stimulujúceho kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF) a IL-17 stimulovanými CD8/CD{10}}definovanými populáciami T buniek nájdenými v krvi až po tie v tkanive zdravých obličiek (obrázok 7a-e). Je zaujímavé, že iba IFNy bol konzistentne exprimovaný väčším podielom T buniek v tkanive zdravých obličiek v porovnaní s T bunkami v krvi, bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4 (obrázok 7a). Rozdiely boli zaznamenané aj na úrovni jednotlivých podmnožín. Konkrétne TNF a GM-CSF boli častejšie produkované CD4 T bunkami v tkanive obličiek (obrázok 7b.c). Čo sa týka polyfunkčnosti (tj počtu súčasne produkovaných cytokínov), zistilo sa, že CD4 T bunky v obličkovom tkanive sú viac polyfunkčné ako CD4 bunky v krvi (obrázok 7f).
Ďalej sme skúmali rozdiely v kapacite produkcie cytokínov medzi stimulovanými T bunkami zo zdravého tkaniva a tkaniva aloštepu. Medzi T bunkami zo zdravého alebo aloštepu obličkového tkaniva neboli zistené žiadne rozdiely v produkcii jednotlivých cytokínov alebo v množstve súčasne produkovaných cytokínov (obrázok S7). Keďže CD69 sa exprimuje po stimulácii T buniek, študovali sme len rozdiel medzi CD103-negatívnymi a CD103-exprimujúcimi CD4 a CD8 T bunkami (obrázok 7g-). Pri porovnaní CD4 a CD8 T buniek exprimujúcich CD103 s bunkami neexprimujúcimi CD103 v obličkovom tkanive sme si všimli, že CD8 a CD4 CD103 bunky exprimovali viac IFNy ako CD{15}} bunky (obrázok 7g). Okrem toho, hoci bunky produkujúce IL-1ZA boli nízke medzi CD103 plus CD8 a CD4 T bunkami v obličkovom tkanive, v tejto populácii sa konzistentne nachádzali častejšie v porovnaní s populáciou CD{22}}. Záverom, viac T' buniek v tkanive obličiek produkovalo IFNy v porovnaní s cirkulujúcimi T bunkami, bez ohľadu na fenotyp CD8/CD4. Najvyššie percento buniek produkujúcich IFNy sa skutočne našlo medzi CD103-exprimujúcimi CD4 a CD8 T-bunkami derivovanými z obličiek. Okrem toho sa T bunky v obličkových aloštepoch nelíšili od buniek v zdravom obličkovom tkanive, pokiaľ ide o tieto parametre.
4. Diskusia
V súčasnej štúdii sme sa zaoberali rozmanitosťou podskupín T buniek podľa expresie CD8 a CD4 a markerov tkanivovej rezidencie, CD69 a CD103, v ľudských obličkách a porovnávali sme ich s krvou. V tkanive obličiek bol skutočne detegovaný značný počet CD8 a CD4 T buniek. Okrem toho tieto T bunky v obličkách obsahovali značné množstvo CD69*CD103-buniek. Boli tiež detegované bunky CD69 plus CD103 plus, ale prevažne medzi CD8 T bunkami a medzi CD4 T bunkami sa prakticky nevyskytovali. Podobné zistenie sa už predtým týkalo pľúcneho TRM [23]. Ako sa očakávalo, takéto populácie exprimujúce CD69 a CD103-v obehu takmer chýbali. Pozoruhodný rozdiel pri porovnaní T buniek v obličkách s bunkami v krvi sa týkal odlišnej distribúcie tradičných podskupín definovaných CD45RA/CCR7/CD28/CD27-. Je zaujímavé, že expresia CD28 sa častejšie neexprimovala, keď T bunky koexprimovali CD69 samotný alebo v kombinácii s CD103. Teoreticky by to malo spôsobiť, že tieto populácie budú menej citlivé na kostimulačné signály CD80 a CD86. Ďalšie rozdiely sa týkali vyššej frekvencie expresie CXCR3, CXCR6 a Ki-67. Okrem toho obličkové T bunky častejšie obsahovali bunky produkujúce IFNy a boli často polyfunkčné. V obličkách CD103 plus Tpys skutočne obsahovali viac buniek produkujúcich IFN ako ich CD103-negatívne náprotivky. Okrem toho bunky CD103T častejšie produkovali IL-17, hoci sa to týkalo skromnej populácie.
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN
S ohľadom na častejšiu expresiu CXCR3 CD8 a CD4 obličkovými T bunkami sa predtým ukázalo, že os CXCR3/CXCL10 sa podieľa na formovaní populácií TpM v koži, pečeni a lymfoidnom tkanive [24-28]. Okrem toho sa podieľa na prenose do namáhaného epitelu a zápalu vo všeobecnom zmysle [14-17]. Vzhľadom na vysoké frekvencie CXCR3 medzi týmito T bunkami v zdravom tkanive obličiek sa zdá, že CXCR3 sa podieľa aj na homeostáze TRM v tkanive obličiek a nemusí nutne zahŕňať zápalové alebo nebezpečné signály. Pokiaľ ide o CXCR6, os CXCR6/CXCL16 sa už skutočne preukázala ako nevyhnutná pre transport Tpst do rôznych kompartmentov, ako sú pľúca, koža, pečeň a mozog, a môže sa týkať univerzálneho mechanizmu nevyhnutného na vedenie a udržanie TRM do a v tkanivách, čo sa týka aj TRM v tkanive ľudských obličiek [18-22].
Farber a spolupracovníci rozsiahlo charakterizovali a porovnávali populácie CD8 a CD4 TRM žijúce v rôznych typoch ľudských tkanív odvodených od darcov orgánov. Popísali, ako sa líšia populácie TRM v pľúcach, slezine, tenkom čreve a rôznych sekundárnych lymfoidných tkanivách, pokiaľ ide o transkriptóm, ale aj o expresiu rôznych proteínov vrátane cytokínov, skúmaných v súčasnej štúdii [29-31. Tieto výskumy však nezahŕňali populácie TRM v ľudských obličkách a údaje o tom
predmetu je málo. Predtým sme ukázali, že CD8 T bunky zacielené na polyomavírusové BK VP1 a LTAG proteíny pochádzajúce z vírusu, ktorý má silný tropizmus pre renálne epiteliálne bunky, sú detegovateľné v aloimplantátových obličkách. Tieto vírusovo špecifické T bunky exprimovali CD69 a CD103 vo vyššom počte ako ich náprotivky nachádzajúce sa v obehu tých istých pacientov. Okrem toho tieto T bunky vo všeobecnosti exprimovali CD45RA-CD27-granzým B-negatívny fenotyp[5]. Neskôr iní tiež informovali o populáciách TRM v ľudskom obličkovom tkanive získanom z transplantovaných nefrektómií. V tejto publikácii autori uvádzajú, že T bunky v týchto tkanivách sa týkali hlavne CD8 T buniek [321. Namiesto toho sme zistili, že CD4 T bunky v skutočnosti obsahovali najväčšiu podskupinu T buniek. Zistili sme však tiež, že rovnováha sa posunula, aj keď nie významne, smerom k väčšiemu počtu CD8 T buniek v tkanive aloštepu v porovnaní so zdravým obličkovým tkanivom. Ako taký môže byť tento nesúlad vysvetlený inou študijnou skupinou a môže sa stať, že v oblasti zdravia je imunologická obrana viac zameraná na extracelulárne hrozby, ako sú baktérie, oproti viac intracelulárnym hrozbám, ako sú vírusy a rakovina u hostiteľov s oslabenou imunitou. Nenašli sme iné rozdiely v študovaných markeroch medzi zdravými obličkami a aloštepovými T bunkami. Na zistenie, či je to skutočne tak, by sa však mal použiť ďalší výskum s použitím techník so širším pohľadom na transkriptómy, ako je sekvenovanie RNA alebo proteóm, ako je hmotnostná spektrometria.
Okrem toho de Leur a kol. opisujú, ako TRM v obličkách často exprimoval granzým B, zatiaľ čo sme detegovali len nízke množstvá granzýmu B v zdravom tkanive obličky aj v tkanive aloštepu [32]. V obličkovom tkanive sme však detegovali podstatné T-bet a Eomes exprimujúce T bunky, ktoré sú v cirkulujúcich populáciách T buniek normálne skutočne spojené s vyššou expresiou granzýmu B [10]. Aj keď to nemusí byť prekvapujúce, vzhľadom na skutočnosť, že expresia granzýmu B je tiež priamo indukovaná T-bet [33,34], táto asociácia nebola v súčasnej štúdii zjavná medzi obličkovými T bunkami. Ako sme my a iní ukázali, že aj TRM pochádzajúce z ľudských pľúc, mozgu a kože [25,26,3536], ako aj tkanivá MAIT ælls 【6,7】 pochádzajúce z obličiek majú nízky obsah granzýmu B obsah, hoci často vyjadruje značné množstvo T-betu a Eomes, môže to byť bežná črta (ľudského) TkM. Okrem toho sa v pľúcnom TRM ukázalo, že expresia granzýmu B je po stimulácii rýchlo zvýšená [35l, čo naznačuje, že k tomu môže dôjsť aj v iných TeM. Tu autori predpokladali, že takáto „skrytá cytotoxicita slúži na ochranu štrukturálnej integrity tkanív pred poškodením cytotoxickými T bunkami.
Na záver sme ukázali, že T cll v obličkovom tkanive sú prítomné v značnom počte a zahŕňajú populácie, ktoré často exprimujú CD69 plus a CD103 plus, molekuly, pomocou ktorých T bunky adherujú a pretrvávajú v tkanivách. Zdá sa však, že CD69-CD103- T bunky v obličkovom tkanive sú odlišné od cirkulujúcich T buniek a môžu sa týkať inej odlišnej populácie TiM, ktorá pravdepodobne pretrváva v obličkách inými mechanizmami, ktoré budú odhalené veterinárom. Ďalšou možnosťou môže byť, že tieto CD69-CD103-T bunky sa týkajú populácie, ktorá sa len nedávno dostala z obehu a seno iba prechodne získalo nové fenotypové znaky v dôsledku interakcie s mikroprostredím obličiek. Na objasnenie týchto možností je potrebný ďalší výskum tejto populácie. Ďalej. CD8 a CD4 obličkové T bunky často aktívne cyklovali a častejšie exprimovali CXCR6. Okrem toho populácie CD8 a CD4 vytlačili obzvlášť vysokú expresiu CXCR3, čo silne implikuje tieto chemokínové receptory, ako aj CXCR6 v prírastku TRM a perzistencii v ľudských obličkách. Preto sú potrebné ďalšie výskumy na zlepšenie nášho obrazu populácií Tpv v ľudských obličkách. Napriek tomu tu prezentované zistenia tvoria solídny prvý krok k podrobnejšej charakterizácii populácií T buniek v tkanive obličiek a ich úlohe v zdraví a chorobe.
