Kapitola 5 Zmeny v enzýmovej aktivite počas fermentácie enzýmov

Kapitola 5 Zmeny v enzýmovej aktivite počas fermentácie enzýmov

 

Proteáza, lipáza asuperoxidovdecletázy (SOD)sú hlavnými funkčnými enzýmamiMikrobiálne enzýmové zdravie potravín. Medzi nimi,proteázahrá úlohu vPodpora hydrolýzy bielkovín v potravináchv ľudskom tele. Okrem toho môže tiež rozložiť niektoré umierajúce bunky, odstrániť nečistoty na povrchu pokožky a póroch a hrať úlohu pri odlupovaní, takže sa široko používa vo výrobkoch v kúpeli. Lipáza pôsobí na esterovú väzbu medzi mastnými kyselinami a glycerolom a hydrolýzový substrát je všeobecne prírodné oleje. Preto sa vníma v mnohých potravinách na chudnutie a zdravotníckych výrobkov. Mnoho žien sa veľmi zaujíma o tému chudnutia, a preto sa enzýmy rýchlo stali populárnymi po celom svete.Enzýmy sú bohaté na lipázu, čo znamená, že majú vysokú výskumnú hodnotu a vyhliadky na aplikáciu.Slieskje špeciálny kovový enzým, ktorý katalyzuje dismutačnú reakciusuperoxidové aniónové radikálytakodstránenie superoxidových aniónových radikálovv tele. Je to ochranná bariéra pre organizmy, takže sa široko používa v oblasti lekárskej oblasti.
Táto kapitola berie ako príklad enzým Apple. Počnúc počiatočnou fázou fermentácie,aktivity superoxidu dismutázy, amyláza, lipáza, proteáza a celuláza v experimentálnej skupine a kontrolnej skupine sa merali každých 15 dní, aby sa komplexne a systematicky odrážali meniaci sa trend enzýmovej aktivity počas celého procesu fermentácie.

Nové bylinky cistanche

Kliknutím získate viac podrobností

 

Podporná služba WeCistanche-najväčšieho vývozcu cistanche v Číne:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Materiály a metódy

5.1.1 Materiály

(1) Experimentálne materiály

Umyte čerstvé jablká sterilnou vodou za sterilných podmienok, prirodzene ich vysušte na sterilnom operačnom stole, odlupujte ich a nakrájajte ich na neskoršie použitie. Pridajte biely cukor a jablká do sterilizovanej sklenenej nádoby v hmotnostnom pomere 1: 1. Aktivujte baktérie potrebné pre experiment a naočkujte ich do enzýmu podľa optimálnej schémy (tento operačný krok je vynechaný pre kontrolnú skupinu), utesnite ho a umiestnite na chladné a suché miesto. Po 3 mesiacoch fermentácie teploty miestnosti odoberte vzorku, aby ste získali celú enzýmovú kvapalinu obsahujúcu buničinu a filtrovali ju. Vezmite supernatant ako experimentálnu vzorku. Po odstredení vzorky pri 10, 000 rpm počas 15 minút vo vysokorýchlostnej odstredivke sa používa na meranie príslušných údajov. Je potrebné poznamenať, že v procese výroby enzýmov, aby sa predišlo zbytočnej kontaminácii, sa všetky naše operácie uskutočňovali za sterilných podmienok.

(2) Hlavné nástroje
Nástroje potrebné pre experiment sú rovnaké ako 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metódy

(1) Stanovenie aktivity superoxidu dismutázy (SOD) [66]
Roztok pyrogallolu bol predhrievaný v 25 -stupňovom konštantnom vodnom kúpeli po určitú dobu. Podľa tabuľky 5.1 sa do skúmavky pridalo vhodné množstvo pufra, destilovanej vody a rovnakého objemu kyseliny chlorovodíkovej alebo roztoku pyrogalolu. Vodný kúpeľ s konštantnou teplotou bol nastavený na 25 stupňov pre 2 0 min. Potom, čo sa zmiešaná tekutina rýchlo pretrela, bola okamžite vstreknutá do kyvety. Hodnota absorbancie A0 vzorky sa merala každých 30 sekúnd pri vlnovej dĺžke 325 nm pomocou spektrofotometra.

TAB.5.1 Pridajte množstvo susedného benzénu tri činidlá fenolu na stanovenie rýchlosti autoxidácie

 

Metóda na stanovenie aktivity SOD je v podstate rovnaká ako vyššie uvedená operácia. Jediným rozdielom je, že pred pridaním pyrogallolu je potrebné najskôr pridať {0}}}}}}. Zároveň sa pridá rovnaký objem destilovanej vody. Nameraná absorbancia je asod. The inhibition rate and SOD enzyme activity are calculated according to formula 5.1 and formula 5.2: Inhibition rate (%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100 (5.1) Enzyme activity (U/mL)=inhibition rate/50% × V1/V2×n (5.2) Kde: V1 je celkový objem roztoku, ML; V2 je objem roztoku vzorky enzýmov, ML; △ A0 je miera automatickej oxidácie pyrogallolu; △ Asod je rýchlosť zmeny hodnoty absorbancie vzorky; N je riedenie viacnásobné (2) stanovenie aktivity amylázy Táto štúdia použila kolorimetrickú metódu jódu škrob na stanovenie aktivity amylázy. Konkrétne činné kroky sa vzťahujú na „Národný postup klinického laboratória“ [67]. Je rozdelený hlavne na tieto dva body:

 

① Príprava roztoku
Buffered škrobové roztoky ({{0}}. 4g/l): presne zvážte 9 g chloridu sodného, ​​22,6 g bezvodého fosfátu disodia Kým sa roztok neuvarí; Presne vážte 0,4 g rozpustného škrobu, rozpustite ho v 10 ml destilovanej vody, rovnomerne premiešajte a upravte sa na pastu; Injekciu roztoku škrobu upravený na pastu do vyššie uvedeného roztoku vriaceho roztoku a kadičku premyjte opakovane, až kým sa škrob úplne prenesie do roztoku vriacej vody. Po rovnomernom miešaní sklenenou tyčou, ochladte na teplotu miestnosti, pridajte 5 ml roztoku 37% vlasov formaldehyd a zriedite na 1 l destilovanou vodou. Hodnota pH roztoku je 7,0 ± 0,1 a je umiestnená v chladničke na použitie.
Jódový zásobný roztok (0. 1 mol/l): Presne vážte 1,7835g jodátu draselného a 22,5 g jodid draselného v čistých 500 ml
Kadičky, pomaly a rovnomerne pridávajú 4,5 ml koncentrovanú kyselinu chlorovodíkovú, počas procesu pridávania miešanie nepretržite miešajú, zriedite sa do stupnice destilovanou vodou a rovnomerne premiešajte. Vložte ho do chladničky na použitie a uložte ju do hnedej fľaše na činidla.
Riešenie jódového aplikácie ({{0}}. 01Mol/l): Vezmite určité množstvo jódového zásobného roztoku (0,1 mol/l), zriedite ho 10 -krát destilovanou vodou, vložte ho do chladničky na použitie a uložte ho až na 1 mesiac.

② Experimentálne prevádzkové kroky
Vezmite enzýmový roztok a zriedite ho 10 -krát fyziologickým fyziologickým roztokom a pracujte podľa tabuľky 5.2. Dobre premiešajte, vlnová dĺžka spektrofotometra je 660 nm a ľahká cesta kolorimetrického pohára je 10 mm. Nula s destilovanou vodou a prečítajte si absorbanciu každej trubice. Vypočítajte aktivitu amylázy na základe vzorca základného výpočtu 5.3.

 

Tab.5.2 Kroky prevádzky stanovenia amylázy

 

(3) Stanovenie aktivity lipázy

Metóda určenia sa uskutočnila v súlade s QB/T {{0}} [68]. Testovací roztok 2% enzýmov sa pripravil s 0. {0 25 mol/l fosfátový pufer (pH 7,5), fenolftaleín sa použil ako indikátor a mastné kyseliny sa titrovali štandardným roztokom hydroxidu sodného. Lipázová aktivita bola vypočítaná na základe objemu hydroxidu sodného spotrebovaného v experimente. Pravidlo je: pri pH 7,5 a okolitej teplote 40 stupňov, 1 ml kvapalného enzýmu hydrolyzuje lipázu lipázy počas 1 minúty, aby sa vytvoril 1 μmol mastnej kyseliny, čo je jedna jednotka lipázy, vyjadrená ako U/ml. Potom bola lipáza aktivita vypočítaná podľa vzorca 5.4: enzýmová aktivita (U/ml)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N {= 200/3 x (BA) × C × N (5.4), kde: B je objem sodného hydroxidového roztoku, ml; A je objem štandardného roztoku hydroxidu sodného spotrebovaného v slepej kontrolnej skupine, ML; C je koncentrácia štandardného roztoku hydroxidu sodného, ​​mol/l; 0,05 je konverzný faktor koncentrácie štandardného roztoku hydroxidu sodného; 50 je obsah mastných kyselín v roztoku hydroxidu sodného; 15 minút je reakčný čas; n je viacnásobné riedenie.

(4) Stanovenie proteázovej aktivity

Pozri GB/T 23527-2009 [69] s miernymi úpravami.
① Príprava štandardnej krivky
Vezmite 1 ml štandardného roztoku tyrozínu s rôznymi hmotnostnými koncentráciami, ktoré sú 0, 1 0, 20, 30, 40 a 50 mg/l, a pridávajú do neho 5 ml 0,4 mol/l roztoku uhličitanu sodného a 1 ml roztoku Folin Reagent. Reagujte 20 minút pri teplote 40 stupňov. Po dokončení reakcie odstráňte reakčný roztok a zmerajte hodnotu absorbancie roztoku pri vlnovej dĺžke 680nm pomocou spektrofotometra. Nakreslite štandardnú krivku tyrozínu s koncentráciou tyrozínu ako horizontálnu os a hodnotu absorbancie ako vertikálnu os.

Nové bylinky Cistanche so silnou antioxidačnou silou

② Stanovenie proteázovej aktivity
Experimentálna skupina: Vezmite 1 ml roztoku kazeínu s koncentráciou 10 g/l a rovnomerne ho premiešajte s 1 ml roztoku vzorky, ktorý sa má testovať, a reagujte na 10 minút pri teplote okolia 40 stupňov; Filtrujte a získajte filtrát po státí, urobte 1 ml filtrátu, 5 ml roztoku uhličitanu sodného a 1 ml folínového činidla, rovnomerne premiešajte a reagujte na 20 minút pri okolitej teplote 40 stupňov; Na meranie hodnoty absorbancie roztoku pri vlnovej dĺžke 680 nm použite spektrofotometer.
Bloková kontrolná skupina: Urobte 1 ml roztoku vzorky, ktorý sa má testovať, pridať kyselinu trichlóroctovú, plne reagovať na inaktiváciu proteázy a ďalšie prevádzkové metódy sú rovnaké ako experimentálna skupina.

Vypočítajte proteázovú aktivitu podľa vzorca 5.5:
Proteázová aktivita (u/ml)=AK × 4/10 (5.5), kde: A je absorbancia enzýmového roztoku v experimentálnej skupine; K je množstvo tyrozínu, keď sa absorbancia rovná 1; 4 je celkový objem reakčného roztoku, ML; 10 je reakčný čas, min.

(5) Stanovenie celulázovej aktivity [70]

Aktivita celulázy v enzýmoch sa všeobecne exprimuje množstvom glukózy uvoľňovanej určitým množstvom enzýmového roztoku na jednotku času. Princíp použitia metódy filtračného papiera na meranie celulázovej aktivity je to, že celuláza môže vo filtračnom papieri rozložiť celulózu za vzniku sekundárnych metabolitov, ako je glukóza a glukóza, môže reagovať s 3, 5- dinitrosalicylovou kyselinou za vzniku žltého komplexu. Farba tejto reakcie je relatívne jasná, čo dokáže dobre určiť množstvo glukózy a ďalšie redukčné cukry.

 

①3, 5- kolorimetrické činidlo kyseliny dinitrosalicylovej
Presne vážiť 1 0 g z 3, 5- dinitrosalicylová kyselina s bodom topenia 168-169, rozpustite ho s destilovanou vodou, pridajte 20 g hydroxidu sodného s sodným pridaním 2G sodného sodného sodného, ​​pridávajú Fenol a 0,5 g bezvodého síranu sodného, ​​nepretržite sa miešajte počas procesu pridávania, až kým sa úplne nerozpustí, zastavte sa zahrievanie po rovnomernom premiešaní, chladní na izbovú teplotu, preneste všetky do 1 000 ml avelumetrickej banky, riedte sa na značku destilovanou vodou, vložte do miestnosti na jeden týždeň, filter, získajte supernatant a uložte do fľaše Brown Reagent.②enzymatická hydrolýza
Presne pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml roztoku vzorky enzýmu do 2 ml roztoku octaového acetátu kyseliny kyseliny-sodium s pH hodnotou 4,5. Po 5 minútach konštantného teploty vo vodnom kúpeli pri 40 stupňoch pridajte 6 kusov chromatografického filtračného papiera s plochou 1 × 1 cm2 a okamžite začnite načasovanie, aby sa reakčný čas presný na 60 minút. Okamžite preneste do vriacej vodnej kúpeľa na reakciu na 10 minút a celuláza stráca svoju aktivitu.

 

 

③ Farebná reakcia
Vezmite roztok enzýmovej vzorky, pridajte 3 ml z 3, 5- kolorimetrické činidlo dinitrosalicylovej kyseliny pripravené vo ①, ohrievajte vo vriacej vode v kúpeli počas 15 minút, vyberte, ochladte na teplotu miestnosti, pridajte 10 ml destilovanej vody, rovnomerne premiešajte spektrometer, použite spektrometometer a zmerajte jej absorpciu a zmerajte jej absorpciu.
④ kreslenie štandardnej krivky glukózy
Presne pripravte štandardný roztok glukózy s koncentráciou 1 mg/ml a pomocou destilovanej vody vytvoríte glukózový štandardný roztok s objemom 0, {{}}. 2, {0. 4, {{6}. 6, {} {8}. 3, 5- kolorimetrické činidlo dinitrosalicylovej kyseliny pripravené v ① na vykonanie reakcie na vývoj farieb. Vyneste štandardnú krivku s koncentráciou glukózy ako horizontálnu os a absorbanciu ako vertikálnu os.
⑤ Kalkulácia
Použite hodnotu absorbancie A po vývoji farby pomocou enzýmového roztoku a potom vypočítajte množstvo uvoľňovania glukózy podľa štandardnej krivky glukózy a vypočítajte podľa vzorca 5.6:
Celulázová aktivita (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) Kde: M je množstvo uvoľňovania glukózy, ug; t je enzymatický čas hydrolýzy, min; M je obsah enzýmu v reakcii, ug/ml.