Štúdia o mikrobiálnych enzýmoch produkovaných počas kombinovanej bakteriálnej fermentácie a ich biologických aktivít ⅲ

Kapitola 3 Štúdia o antioxidačnej aktivite enzýmov

 

Ukázalo sa, že veľa ľudských chorôb súvisíaktívne kyslík a voľné radikályako napríkladzápal, arterioskleróza,starnutie, cukrovka, rakovinaatď.Nadmerné voľné radikályV tele môže spôsobiť denaturáciu proteínu, poškodenie buniek a smrť a dokonca aj patologické zmeny v tele. Preto mnoho štúdií doma iv zahraničí hľadá potraviny bohaté na prírodné antioxidačné prísady, aby sa zabránilo a regulovali choroby spôsobené voľnými radikálmi prostredníctvom stravy. Dnes, so zvyšujúcou sa životnou úrovňou, ľudia postupne presúvajú svoje zameranie na svoje vlastné telá, takže čoraz viac zdravotníckych výrobkov sa objavuje v nekonečnom prúde. Nie je však ľahké byť skutočne užitočné. Enzýmy sú druhom jedla, ktoré si môžete vyrobiť v živote ľudí. Náklady nie sú príliš vysoké a existuje veľa výhod.
Mikrobiálne enzýmy majú celý rad zdravotných funkcií, ako sú antibakteriálne a protizápalové, podporujú metabolizmus, zlepšujú imunitu, bielenie a anti-starnutie, detoxikáciu a protirakovinové protirakoviny. V súčasnosti existuje relatívne málo štúdií o antioxidačných vlastnostiach mikrobiálnych enzýmov doma iv zahraničí, takže plánujeme vykonať hĺbkový výskum. Tento dokument berie jablkový enzým ako výskumný objekt a používa celkový obsah fenolu, redukciu energie, DPPH · voľný radikál, · OH voľný radikál, voľné radikálne radikály a schopnosti voľného radikálu ABTS po 3 mesiacoch po dobu fermentácie ABTS po dobu 3 mesiacov. Študovalo sa zloženie a obsah antioxidačných aktívnych zložiek a jej antioxidačná aktivita bola pochopená.

Nové bylinky Cistanche s oveľa viac antioxidačnou silou ako fermentácia baktérií

Podporná služba WeCistanche-najväčšieho vývozcu cistanche v Číne:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Materiály a metódy

3.1.1 Materiály

(1) Experimentálne materiály
Umyte čerstvé jablká sterilnou vodou v sterilných podmienkach, prirodzene ich vysušte do sterilného operačného stola, odlupujte ich a nakrájajte ich na neskoršie použitie. Pridajte biely cukor a jablká do sterilizovanej sklenenej nádoby v hmotnostnom pomere 1: 1. Aktivujte baktérie potrebné pre experiment a naočkujte ich do enzýmu podľa optimálnej schémy (tento operačný krok je vynechaný v kontrolnej skupine), utesnite ho a umiestnite na chladné a suché miesto. Po 3 mesiacoch fermentácie teploty miestnosti odoberte vzorku, aby ste získali celú enzýmovú kvapalinu obsahujúcu buničinu, a filtrujte ju. Zoberte supernatant ako experimentálnu vzorku a odstráňte vzorku pri 10000 ot./min. Počas 15 minút vo vysokorýchlostnej odstredivke pred určením príslušných údajov. Je potrebné poznamenať, že v procese výroby enzýmov, aby sa predišlo zbytočnej kontaminácii, sa všetky naše operácie vykonávajú za sterilných podmienok.

(2) Hlavné nástroje
Spektrofotometer: v -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Vodný kúpeľ s konštantnou teplotou: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Ostatné nástroje sú rovnaké ako 2.1.3.

3.1.2 Metódy

(1) Stanovenie celkového obsahu fenolu [53]
① Príprava štandardnej krivky:
Presne vážte {{0}}. 123 g kyseliny galovej, rozpustite ju v malom množstve destilovanej vody a preneste ju na 5 0 {{}} ml volumetrickú banku. Vezmite 8 Clean 1 {{1 0}} ml volumetrické bono, pridajte 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 a 1,4 ml galového kyseliny štandardného roztoku, respektíve zriedka na každú zriedka v každej zriedkate v každej zriedkach v KADE. 1 minúta, vychladnite a zriedi sa na 20 ml a umiestnite pri teplote miestnosti počas 30 minút. Na meranie absorbancie A pri vlnovej dĺžke 650 nm použite spektrofotometer a ako vertikálnu os nakreslite štandardnú krivku s absorbanciou A ako horizontálnu os a koncentráciu vzorky. ② Detekcia
Pridajte destilovanú vodu do 100 μl, 200 ul, 300 ul, 400 ul a 500 ul roztoku vzoriek do 46 ml, potom pridajte 1 ml fenol-fenolového činidla, zmes rovnomerne, reagujte na 3 minútu, potom pridajte 3 ml 20% naco3, potraste v 25-stupňovej teplote s konštantnou teplotou pre 2H, použite distilovanú vodu ako prázdnu kontrolu a zmerajte svoju absorpciu a pri AT a približne a približne a približne a približne a priblíku spektrofotometer. Celkový obsah fenolu je vyjadrený ako ekvivalenty kyseliny galovej a celkový obsah fenolu sa vypočíta podľa štandardnej krivky.

(2) test redukcie [54]
Pridajte 1 0 0 μl, 2 0 0μl, 300 ul, 400 ul a 500 μl vzorky na 2,5 ml fosfátového pufra s koncentráciou 0,2 mol/l At 50 At At At At At At At At At At At At At At At At At. stupeň po dobu 30 minút. Potom pridajte 2,5 ml kyseliny trichlóroctovej (hm/v) s hmotnostnou koncentráciou 10%a centrifuge pri 3000 ot/min počas 10 minút pri vysokorýchlostnej odstredivke. Ihneď po vytiahnutí vezmite 2,5 ml supernatantu do objemovej banky, pridajte 2,5 ml destilovanej vody a 0,5 ml chloridu železitého (hm/v) s hmotnostnou koncentráciou 0,1%. Použite destilovanú vodu ako slepú kontrolu a zmerajte absorbanciu A pri vlnovej dĺžke 700 nm pomocou spektrofotometra. Sila redukčnej energie sa dá posudzovať podľa hodnoty absorbancie. Čím vyššia je hodnota absorbancie, tým silnejšia je redukčná sila.

 

(3) Stanovenie účinku na čistenie voľného radikálu superoxidu [55]

Vezmite 4,5 ml 0. 0 5 mol/l pH 8,2 Tris-HCl pufra a predhrievajte ho v 25-stupňovom vodnom kúpeli pre 2 {0 min. Pridajte 1 ml roztoku vzorky enzýmov s koncentráciami 10%, 20%, 30%, 40%a 50%a 0,4 ml roztoku 25 mmol/l pyrogallolu. Dobre premiešajte a reagujte v 25 -stupňovom vodnom kúpeli 5 minút. Pridajte 1,0 ml 8 mol/l HCl, aby ste ukončili reakciu. Ako referenciu použite pufer Tris-HCL a na výpočet rýchlosti vyplašenia použite spektrofotometer na meranie absorbancie A pri vlnovej dĺžke 299 nm. Pre slepú kontrolnú skupinu sa namiesto vzorky použilo 1 ml rozpúšťadla. Rýchlosť vychytávania O {2- sa vypočítala podľa vzorca 3.1: o 2-} rýchlosť vychytávania (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1), kde: a1 je absorbancia prázdnej trubice; A2 je absorbancia vzorky.

(4) Stanovenie účinku vyčistenia na hydroxylové radikály [56]

1 0 0μl, 200 μl, 300 ul, 400 ul, 500 ul roztoku vzorky sa pridal s vodou do 2 ml, potom sa pridal k 1,4 ml peroxidu vodíka s koncentráciou molárnej hmoty 6 ml/l, potom sa pridal s 0,6 ml sodným sodným s sodnou hmotnou koncentráciou 20 ml. 1,5 mmol/l a zahrievané vo vodnom kúpeli s konštantnou teplotou pri 37 stupňoch počas 1 hodiny. Upravte na nulu destilovanou vodou a zmerajte absorbanciu A pri vlnovej dĺžke 562 nm pomocou spektrofotometra. Vykonajte 3 replikáty pre každé ošetrenie. Vypočítajte rýchlosť vychytávania hydroxylového radikálu podľa vzorca 3.2: Hydroxylová radikálna rýchlosť vychytávania (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.2), kde: A1 je priemerná absorbancia slepo; A2 je priemerná absorbancia roztoku vzorky. (5) Stanovenie účinku vychytávania voľných radikálov DPPH [57]

Nové bylinky Cistanche s oveľa viac antioxidačnou silou ako fermentácia baktérií

 

Presne pipette 2 ml roztoku vzorky enzýmov s koncentráciami 1 0%, 20%, 30%, 40%a 50%do 10 ml objemovej banky, potom pridajte 2 ml 80%dpph etanolového vodného vodného roztoku. Koncentrácia molárnej hmotnosti je 2 × 10-4 mol/l. Po miešaní nechajte stáť pri teplote miestnosti počas 30 minút. Pomocou 80% roztoku etanolu ako referencie zmerajte absorbanciu vzorky pri vlnovej dĺžke 517 nm, ktorá je zaznamenaná ako A1. Zmiešajte 2 ml roztoku DPPH a 2 ml roztoku etanolu s hmotnostnou koncentráciou 80% a zmerajte ich absorbanciu pri rovnakej vlnovej dĺžke, ktorá je zaznamenaná ako A0. Zmiešajte 2 ml enzýmového roztoku a 2 ml roztoku etanolu s hmotnostnou koncentráciou 80% a zmerajte ich absorbanciu pri rovnakej vlnovej dĺžke, ktorá sa zaznamenáva ako A2. Vypočítajte rýchlosť vychytávania voľných radikálov DPPH podľa vzorca 3.3:
DPPH Free Radical Scavenging Rate (%) {{0}} [1- (a {{{} a2)/a {0] × 100 (3,3), kde: A1 je absorbancia 2 ML DPPH 80% ETHANOL AMANOL AUCTUOUS RIEŠENIE A 2 MLIZYME RIEŠENIE; A2 je absorbancia zmiešaného roztoku 2 ml enzýmového roztoku a 2 ml 80% etanolu pomocou koncentrácie hmotnosti; A0 je absorbancia zmiešaného roztoku 2 ml roztoku DPPH a 2 ml 80% etanolu pomocou koncentrácie hmotnosti.

(6) ABTS Schopnosť vychytávania voľných radikálov [58]
Pridajte určité množstvo síranu draselného do roztoku 7 mmol/l ABT, kým konečná koncentrácia zmiešaného roztoku je 2,45 mmol/l. Zmiešaný roztok vložte do chladného a suchého miesta pri teplote miestnosti počas 12 až 16 hodín. 1μl, 3 ul, 5μl, 7μl a 9 ul roztoku vzorky sa doplnili k 10 ul s 5 mmol/l PH7,4 fosfátovým pufrom a potom rovnomerne zmiešané s 10 ml vyššie uvedeného sulfátu draselného a zmiešaného roztoku ABTS a nechali reagovať pri reakčnej teplote 30 stupňov a reakčný čas 5 mín. Nula s destilovanou vodou a zmerajte absorbanciu A pri vlnovej dĺžke 734 nm pomocou spektrofotometra. Vypočítajte rýchlosť vychytávania voľných radikálov ABTS podľa vzorca 3.4:
ABTS rýchlosť vychytávania voľných radikálov (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4), kde: A1 je absorbancia slepej kontrolnej skupiny; A2 je absorbancia experimentálnej skupiny

 

3.2 Výsledky a analýza

3.2.1 Celkový obsah fenolu

(1) Štandardná krivka
Štandardná krivka celkového obsahu fenolu bola nakreslená koncentráciou kyseliny galovej ako horizontálnej os a hodnotou absorbancie A ako vertikálnou osou, ako je znázornené na obrázku 3.1.

 

Obr.3.1 Štandardná krivka celkového obsahu fenolu

Z obr.3.1 vidíme, že štandardná krivka rovnice je y =11. 375x +0. 2593 (x je koncentrácia vzorky, y je absorbancia), r 2=0. 9981.

(2) Stanovenie vzoriek

Výsledky celkového stanovenia obsahu fenolu v kontrolnej skupine a experimentálnej skupine v rôznych koncentráciách sú znázornené na obr.

 

 

 

Obr.3.2 Krivka celkového fenolového obsahu

Ako je znázornené na obr. 2, enzýmy Apple v kontrolnej skupine a experimentálnej skupine majú vysoký celkový obsah fenolu a obidve sa zvyšujú so zvýšením množstva pridaného roztoku vzorky. V rovnakom koncentračnom gradiente sa celkový obsah fenolového enzýmu v kontrolnej skupine zvýšil z 0. Celkový obsah fenolu v experimentálnej skupine je oveľa vyšší ako obsah kontrolnej skupiny a vzostupný trend je zrejmý. Podľa celkového obsahu fenolu je celková antioxidačná aktivita experimentálnej skupiny vyššia ako aktivita kontrolnej skupiny.

 

3.2.2 Zníženie výkonu

Výsledky zníženia stanovenia energie enzýmov jabĺk v kontrolnej skupine a experimentálnej skupine v rôznych koncentráciách sú znázornené na obrázku 3.3.

 

Ako je znázornené na obrázku 3.3, meniaci sa trend znižovania výkonu enzýmov jabĺk je podobný meniacemu sa trendu celkového obsahu fenolu. Redukčná sila experimentálnej skupiny je vyššia ako výkonnosť kontrolnej skupiny a či ide o experimentálnu skupinu alebo kontrolnú skupinu v rámci koncentračného rozsahu uvedeného v experimente, redukčný výkon vykazuje zvyšujúci sa trend so zvýšením množstva pridaného roztoku vzorky. Experimentálne údaje tiež potvrdili, že z hľadiska redukčnej energie je antioxidačná aktivita experimentálnej skupiny väčšia ako v kontrolnej skupine.

 

 

3.2.3 Schopnosť vychytávania voľného radikálu superoxidu

Výsledky schopnosti čistiacich sa enzýmov jabĺk v kontrolnej skupine a experimentálnej skupiny pri rôznych koncentráciách sú uvedené na obrázku 3.4, výsledky schopnosti čistiaceho sa enzýmov jabĺk v kontrolnej skupine a experimentálnej skupine.

Ako je znázornené na obrázku 3.4, medzi experimentálnou skupinou a kontrolnou skupinou je veľký rozdiel v schopnosti čistiacich radikálov s aniónom superoxidu. V rozsahu koncentrácie prezentovaného v experimente sa zmení schopnosť experimentálnej skupiny experimentálna skupina experimentálnej skupiny najvýznamnejšie zmeny, keď je koncentrácia vzorky 10%až 20%, a zmena nie je zrejmá po koncentrácii vyššia ako 20%; Ak je koncentrácia 50%, schopnosť vychytávania voľného radikálu superoxidu je vysoká ako 85,4%. Schopnosť vychytávania voľných radikálov superoxidu zobrazená kontrolnou skupinou je možné zreteľne vidieť z trendovej tabuľky. Keď sa koncentrácia enzýmu zvyšuje, táto schopnosť vychytávania voľných radikálov sa tiež zvyšuje, pomaly sa mení a postupne má tendenciu do stabilného stavu. Schopnosť vychytávania dosahuje maximálne 42,6%. Experimentálna skupina je takmer dvakrát vyššia ako kontrolná skupina.

 

 

3.2.4 Schopnosť vychytávania voľných radikálov hydroxylu

Zmeny v schopnosti vychytávania hydroxylových radikálových enzýmov v kontrolnej skupine a experimentálnej skupine v rôznych koncentráciách sú znázornené na obr. 3.5.

 

 

Obr.3

 

Z obr. 3.5 je zrejmé, že v rozsahu koncentrácie uvedeného v experimente sa schopnosť vychytávania enzýmov enzýmov v experimentálnej skupine a kontrolnej skupine zvýšila so zvýšením pridaného množstva. Schopnosť vychytávania experimentálnej skupiny vo voľnom radikáloch hydroxylu bola nižšia ako schopnosť kontrolnej skupiny a pri nízkych koncentráciách fungovala veľmi zle. Pri vysokých koncentráciách sa schopnosť vychytávania voľných radikálov hydroxylu významne zvýšila. Dôvodom môže byť ten, že počas procesu fermentácie boli typy a obsah mikroorganizmov v jablkových enzýmoch v experimentálnej skupine a kontrolnej skupine odlišné, a obsah sekundárnych metabolitov a zložiek každého produktu produkovaného fermentáciou bol iný, takže preukázaná antioxidačná kapacita sa líši.

 

3.2.5 DPPH · Schopnosť vychytávania voľných radikálov

V porovnaní s inými detekčnými metódami sa schopnosť DPPH · voľného radikálneho vychytávania sa široko používa na vyhodnotenie antioxidačnej aktivity v krátkom časovom období [59]. Schopnosť vychytávania voľných radikálov DPPH · v rôznych koncentráciách bola vynesená podľa výsledkov kontrolnej skupiny a experimentálnej skupiny Apple enzýmy, ako je znázornené na obrázku 3.6.

Ako je znázornené na obrázku 3.6, keď bola koncentrácia enzýmu Apple kontrolnej skupiny nižšia ako 30%, schopnosť vychytávania voľných radikálov DPPH · voľného radikálu bola menšia ako 50%, ale experimentálna skupina jablkových enzýmu tiež vykazovala vyššiu schopnosť vychytávania radikálov DPPH · pri nízkych koncentráciách. Experimentálne výsledky ukazujú, že pridanie aspergillus oryzae, kvasiniek, termofilného streptokoku a bulharského laktobacilu je prospešné pre schopnosť vychytávania voľného radikálu enzýmu DPPH ·. Ak je koncentrácia enzýmu 50%, táto schopnosť je až 91,4%, čo je oveľa vyššia ako 69,8%kontrolnej skupiny pri rovnakej koncentrácii.

 

3.2.6 ABTS Radikálna čistiaca kapacita

Výsledky kapacity zachytávania radikálov ABTS v kontrolnej skupine a experimentálnej skupiny v rôznych koncentráciách sú znázornené na obr.

Obr.3.7 Krivka kapacity radikálov ABTS
Z obr. 3.7 je zrejmé, že rýchlosť vychytávania jablkových enzýmov v experimentálnej skupine je vyššia, keď je množstvo enzýmového pridania väčšie ako 5 ul. Štúdia Erel et al. ukázali, že zachytávajúca kapacita radikálov ABTS závisí vo veľkej miere od vyššej koncentrácie fenolových látok [60]. Výsledky celkového stanovenia obsahu fenolu ukázali, že celkový obsah fenolu v experimentálnej skupine bol vyšší ako obsah kontrolnej skupiny. Experimentálne výsledky na obr. 3.7 práve overili, či je kapacita zachytávania radikálov ABTS vyššia ako v kontrolnej skupine.

 

3.3 Zhrnutie tejto kapitoly

Táto kapitola študuje vzťah medzi antioxidačnou aktivitou jablkových enzýmov produkovaných fermentáciou so štyrmi vybranými kmeňmi jabĺk, koncentráciou vzoriek enzýmov a porovnaním antioxidačných aktívnych komponentov a schopnosťou zachytávania voľných radikálov medzi experimentálnou skupinou a kontrolnou skupinou. Experimentálne výsledky ukazujú, že celkový obsah fenolu v jablkovom enzýme v kontrolnej skupine je nižší ako v experimentálnej skupine a jeho redukčný výkon, voľný radikál aniónu superoxidu, voľné radikály DPPH a schopnosť vychytávania voľných radikálov sú lepšie ako v kontrolnej skupine; Enzým v kontrolnej skupine má obzvlášť dobrú schopnosť čistiaceho prostriedku pre hydroxylové voľné radikály.
Experimentálna skupina vo všeobecnosti vykazovala vyššiu antioxidačnú aktivitu, ktorá ďalej potvrdila uskutočniteľnosť umelo pridávania kmeňov na výrobu mikrobiálnych enzýmov. Týmto spôsobom majú mikrobiálne enzýmové potraviny viac látok prospešných pre ľudské zdravie na základe pôvodnej prírodnej fermentácie a môžu sa lepšie rozvíjať smerom, ktorý očakávajú ľudia.