Kapitola 2: Zlúčeniny zacielené na OSBPL7 Zvyšujú ABCA1- závislý odtok cholesterolu Zachovanie funkcie obličiek pri dvoch modeloch ochorenia obličiek

Pre viac info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskusia

Táto štúdia popisuje identifikáciu triedy zlúčenín pomocou objavu fenotypových liekov (PDD), ktoré zvyšujú reguláciu ABCA 1-závislého odtoku cholesterolu. Cieľová dekonvolúcia odhalila OSBPL7 ako molekulárny cieľ. Na zvieracích modeloch ochorenia obličiek tieto zlúčeniny znížili akumuláciu lipidov v obličkách, zabránili strate podocytov, normalizovali proteinúriu a znížili pokles funkcie obličiek.

Súčasné terapie pre chronickéochorenie obličieksú obmedzené na ACEi, ARB a nedávno na inhibítory sodno-glukózového kotransportéra typu 2 (SLGT2i). Napriek účinnosti týchto činidiel pri oddialení progresie chronického ochorenia obličiek, predovšetkým u pacientov s proteinurickým ochorením obličiek, neuspokojená medicínska potreba pri CKD zostáva obrovská3,3940. V randomizovanej štúdii so 4300 pacientmi sa neočakávane zistilo, že SGLT2i je účinný bez ohľadu na prítomnosti diabetu4, čo naznačuje, že sú zahrnuté aj iné mechanizmy renoprotekcie ako znižovanie glukózy. Nedávna štúdia v skutočnosti preukázala, že SGLT2i môže zvýšiť HDL v plazme a môže znížiť akumuláciu srdcového tuku42. Tento nedávny objavenie sa SGLT2i podčiarkuje výhodu zacielenia viacerých mechanizmov riadenia CKD na vývoj účinnejších terapií.

My a iní sme opísali akumuláciu glomerulárneho cholesterolu vobličkové ochoreniapochádzajúce z metabolického aj nemetabolického pôvodu. Akumulácia glomerulárnych lipidov v spojení so zníženým efluxom cholesterolu sprostredkovaným ABCAl sa vyskytuje v DKD7-11, FSGS12-14 a AS13. Tieto údaje naznačujú, že obnovenie funkcie ABCAl môže byť účinné pri liečbe týchto typov ochorení obličiek. Nedávno sme preukázali, že deplécia cholesterolu v obličkách s cyklodextrínom alebo genetická nadmerná expresia ABCAl chráni predrenálna dysfunkciav modeloch DKD9, FSGS13,14 a ASl3. Tiež sme demonštrovali, že podocytovo špecifický deficit ABCAl zhoršuje renálny fenotyp v DKD7. Štúdie s agonistami LXR, ako je T1317, tiež poskytli silnú podporu pre kľúčovú úlohu ABC Al, ktorá zostala atraktívnym terapeutickým cieľom napriek obmedzeniam týchto látok.

Hľadali sme agentov objavovaním fenotypových liekov a optimalizáciou kandidátskej drogérie s malými molekulami. Identifikovali sme sériu 5-arylnikotínamidov, ktorých niekoľko zástupcov zvýšilo hladiny proteínu ABCAl a odtok cholesterolu z buniek naplnených cholesterolom. Neprítomnosť efluxnej aktivity vo fibroblastoch od pacienta s Tangerovou chorobou a absencia zvýšenia ABCAl mRNA odhalili nový mechanizmus účinku.

Cieľové úsilie o dekonvolúciu identifikovalo OSBPL7 ako cieľ s vysokým záujmom. Molekulárna sonda (³H-Cpd K) účinne viazala OSBPL7 v živých bunkách a mohla by účinne konkurovať neznačeným zlúčeninám. Ešte dôležitejšie je, že sme preukázali korelačný vzťah "aktivita-aktivita" pre väčší súbor zlúčenín medzi ich schopnosťou zvyšovať ABCAl cholesterolový eflux a ich schopnosťou súťažiť o väzbu sondy na OSBPL7. Mutačná analýza v kombinácii s molekulárnym modelovaním a dokovacími štúdiami naznačuje priamu interakciu zlúčenín s predpokladaným priestorom viažucim sterol OSBPL7. Nakoniec štúdie siRNA potvrdili zapojenie OSBPL7 do funkcie ABC Al.

Kliknutím sa dozviete, kde cistanche kúpiť a na čo sa cistanche používa  

Ako potenciálny cieľ sme identifikovali aj CBIR. Niekoľko správ naznačuje úlohu endokanabinoidnej signalizácie v regulácii bunkového cholesterolu. Ukázalo sa, že rimonabant mierne upreguluje vychytávací receptor B1 (SR-B1) a ABCGl, ale nie ABC Al, čo je v súlade s našimi údajmi45. Ukázalo sa, že syntetický kanabinoid WIN55,212-2 znižuje expresiu ABC Al a zároveň zvyšuje vychytávač receptora CD36 v makrofágoch RAW264.7 naplnených oxLDL46. Tieto údaje spolu nepodporujú silnú úlohu CBIR pri regulácii ABCA1. V našich štúdiách boli rimonabant a iní agonisti/antagonisti CBIR vrátane AM251, WIN55-212-2 a arachidónového chlóroetylamínu (ACEA) neaktívni pri indukcii ABCA1 eflux cholesterolu (obr. 3a, 4a).

Cicavčie oxysterol viažuce proteíny (OSBP) sa pôvodne podieľali na biosyntéze cholesterolu a sfingomyelínu47-49. Niekoľko štúdií spojilo špecifické OSBP s reguláciou stability proteínu ABC Al a efluxom cholesterolu sprostredkovaným ABCAl50,51. Žiadne údaje pred touto správou nepreukázali, že OSBPL7 je regulátorom ABCA1. Naše údaje naznačujú, že OSBPL7 môže poskytovať funkciu prenosu chaperónu alebo substrátu ovplyvňujúcu ABC Al. Predbežné koimunoprecipitačné experimenty v transfekovaných bunkách neidentifikovali priamu interakciu medzi týmito dvoma proteínmi. Metaanalýza celogenómových asociačných štúdií (GWAS) však identifikovala OSBPL7 medzi 60 genetickými lokusmi ovplyvňujúcimi hladiny cholesterolu v plazme u ľudí.

Náš dlhodobý záujem o úlohu ABC Al pri ochorení obličiek nás viedol k hodnoteniu 5-arylnikotínimidov in vitro a in vivo modelov ochorenia obličiek. Zistili sme, že OSBPL7 je exprimovaný v obličkách, vrátane glomerulov a podocytov, a že Cpd A a Cpd G upregulujú apo Al-sprostredkovaný tok cholesterolu z podocytov naplnených cholesterolom. Cpd A a Cpd G podporujú zvýšenie ABCAl na plazmatickej membráne bez ovplyvnenia expresie mRNA. Tento mechanizmus je v kontraste s agonistami LXR, ktoré upregulujú mRNA ABCAl, čo vedie k zvýšeniu ABC Al v plazme aj intracelulárnych membránach. Hodnotili sme terapeutickú účinnosť Cpd A a Cpd G in vivo na myšom modeli FSGS (ADR-indukovaná nefropatia). Zistilo sa, že obe látky znižujú obsah cholesterolu v obličkách, čo koreluje so zníženou proteinúriou, stratou hmotnosti a patologickými zmenami obličiek. Cpd G bol vysoko účinný pri prevencii ADR-indukovanej straty podocytov a glomerulárnych štrukturálnych zmien. Významné zníženie ABCAL v obličkách sprevádzané zvýšenímzápalovéproteíny, zabránil Cpd G, čo podporuje kľúčovú úlohu ABCA1. Cpd G účinne znížil albuminúriu, BUN a hladiny kreatinínu v sére u myší AS. Ešte dôležitejšie je, že Cpd G predĺžil životnosť u starších zvierat Col4a3 s pokročilým zlyhaním obličiek.

Tieto údaje podporujú terapeutický potenciál zlúčenín zacielených na ABCAl a silne naznačujú, že tento nový spôsob účinku ponúkne dodatočnú alebo doplnkovú účinnosť k liekom zameraným na RAAS, SGLT2, NRF2 a syntézu alebo absorpciu cholesterolu. Je pozoruhodné, že na rozdiel od účinku Cpd G blokáda RAAS nepredlžuje životnosť u starších myší Col4a3, napriek tomu, že ide o najúčinnejšiu terapiu včasnej intervencie v tomto modeli53, 54. Antiproteinurická aktivita Cpd G bola lepšia ako účinky ramiprilu, ktoré sme predtým uviedli v syngénnom modeli AS38. Cpd G sa preto môže lepšie zacieliť na populáciu pacientov s AS a proteinúriou v porovnaní s bardoxolónom, agonistom NRF-2, u ktorého sa preukázalo, že zvyšuje GFR, ale nemá žiadny vplyv na proteinúriu, čo je najsilnejší prediktor 10- rok ESRD riziko vo všeobecnej populácii55,56. Zistilo sa, že statíny sú ochranné v experimentálnom AS57 a odporúčajú sa u všetkých pacientov s CKD na zníženie kardiovaskulárneho rizika, ale ukázali sa ako neúčinné na spomalenie progresie ochorenia obličiek 8. Napokon sme nedávno uviedli potenciálny prínos ezetimibu pri AS znížením absorpcia mastných kyselín a triglyceridov. Ezetimib však neovplyvnil obsah cholesterolu v obličkách a jeho účinnosť na zlepšenie GFR a zníženie proteinúrie bola nižšia ako účinky, ktoré tu uvádzame pre Cpd G

Stručne povedané, táto správa opisuje identifikáciu prvotriednych malých molekúl podobných liečivám, ktoré indukujú odtok cholesterolu sprostredkovaný ABCAl, objavením fenotypového lieku. Chemická biológia identifikovala OSBPL7 ako molekulárny cieľ a preukázala, že molekuly úzko interagujú v rámci svojej predpokladanej domény viažucej oxysterol. Pokiaľ je nám známe, ide o jeden z mála príkladov zlúčenín podobných liekom pôvodne objavených fenotypovými prístupmi, ktorých cieľ bol následne úspešne identifikovaný44. Zlúčeniny G a A boli vysoko účinné na zlepšenie funkcie obličiek u myších modelov odrážajúcich dve rôzne etiológie progresívneho ochorenia obličiek. Zdá sa, že sú bezpečné a dobre tolerované, čo sa odráža v ich schopnosti znížiť hladiny AST u myší s ADR a čo je presvedčivejšie, predĺžiť životnosť myší Col4A3 KO. Tieto zlúčeniny môžu ponúknuť potenciálnu novú terapiu ochorenia obličiek zacielením bunkového metabolizmu cholesterolu prostredníctvom nového spôsobu účinku. Tieto látky spolu so súčasnými liekmi zameranými na kontrolu krvného tlaku alebo glukózy môžu riešiť významnú neuspokojenú potrebu pri CKD.

Metódy

zlúčeniny. Zlúčeniny použité v tejto štúdii sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke 5 a boli syntetizované vo F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Švajčiarsko, pokiaľ nie je uvedené inak. Pre in vitro experimenty sa lyofilizované zlúčeniny rekonštituovali v DMSO (Sigma) a alikvóty sa skladovali pri -20 stupni. Pre in vivo experimenty boli lyofilizované zlúčeniny resuspendované vo vehikulách obsahujúcich 1,25 percenta hydroxypropylmetylcelulózy, 0,10 percenta sodnej soli dokusátu, 0,18 percenta sodnej soli propylparabénu a 0,02 percenta kyseliny citrónovej monohydrát, pri pH 6. Suspenzia jemných častíc sa vytvorila tromi krátkymi pulznými sonikáciami vykonanými na ľade.

Postupy syntetickej chémie a analytické údaje. Pozrite si súbor doplnkových údajov 1.

Chemická biológia/skríning kandidátskeho cieľa Stručne, plazmid exprimujúci kandidátsky cieľ záujmu fúzovaný s FLAG tagom bol transfekovaný do HEK293 buniek. Po 24 hodinách sa pridala tríciovaná zlúčenina K v koncentrácii schopnej vyvolať ABCA1-sprostredkovaný eflux cholesterolu（1.0 μM） na 3 hodiny, potom sa živé bunky vystavili UV svetlu (K{{ 7}} nm) na zistenie potenciálneho zosieťovania zlúčeniny/cieľu in situ. Pripravili sa bunkové lyzáty, exprimovaný proteín sa potom selektívne imunoprecipitoval s použitím anti-FLAG protilátky naviazanej na sefarózové guľôčky, naviazané proteíny sa oddelili pomocou SDS-PAGE a pripravili sa dva identické bloty a sondovali sa westernovým prenosom a autorádiografiou na detekciu expresie proteínu. a prítomnosť alebo neprítomnosť zosieťovania zlúčeniny. Vývojový diagram tohto skríningu je znázornený na obr. 2. Obrázok 2d znázorňuje schopnosť Cpd A a Cpd G vytesniť tríciované Cpd K z nadmerne exprimovaného a imunoprecipitovaného OSBPL7. Obrázok 3b ilustruje použitie tohto testu na detekciu väzby tríciovanej Cpd K na nadmerne exprimované a imunoprecipitované varianty OSBPL7 obsahujúce bodové mutácie v predpovedanej oxysterolovej väzbovej kapse OSBPL7. Výhody tejto metódy sú i. použitie plazmidovej transfekcie vedie k vysokej expresii každého kandidáta, čo znižuje pravdepodobnosť vynechania autentického cieľa pre tie, ktoré môžu byť exprimované na nízkych endogénnych hladinách, iii. k interakcii chemickej sondy s jej cieľom dochádza v relevantnom biologickom kontexte (živé bunky) pri farmakologicky aktívnej koncentrácii a iii. imunoprecipitácia umožňuje, aby sa exprimovaný požadovaný proteín purifikoval od proteínov pozadia, čím sa podstatne zlepšuje pomer signál/šum.

Bunková kultúra. Bunkové línie boli zakúpené od ATCC a subkultivované nie dlhšie ako pasáž 15, s výnimkou ľudských podocytov, ktoré boli pôvodne od Dr. Jochena Reisera. Podmienečne imortalizované ľudské podocyty boli kultivované za permisívnych podmienok pri 33 stupňoch v médiu RPMI (Corning) obsahujúcom 10 percent FBS (GIBCO), 1 percento penicilínu/streptomycínu,0.01 mg/ml rekombinantného ľudského inzulínu, 0,0055 mg/ml ľudského transferínu (v podstate bez železa) a 0,005 ug/ml seleničitanu sodného (ITS, Corning). Na vyvolanie diferenciácie sa podocyty kultivovali pri 37 stupňoch počas 14 dní v médiu RPMI obsahujúcom 10 percent FBS (GIBCO) a 1 percento penicilínu/streptomycínu. Diferencované podocyty sa nechali hladovať v RPMI-0.2 percent FBS počas 18 hodín a potom sa ošetrili s 1 uM, 5 uM a 10 uM zlúčenín čerstvo pripravených v DMSO počas 18 hodín pri 37 stupňoch, ako je uvedené.

Odtok cholesterolu v makrofágoch a fibroblastoch. Schopnosť zlúčenín indukovať ABCAl-sprostredkovaný eflux cholesterolu bola stanovená v replikovaných kultúrach THP1 buniek alebo fibroblastov v 96-jamkových mikroplatniach. Bunky boli nanesené na platne s hustotou 150 000 buniek/jamku. Monocyty THP1 sa diferencovali na makrofágy pridaním PMA (100 nM) počas 72 hodín v médiu RPMI obsahujúcom 10 percent fetálneho hovädzieho séra a 3 ul 2-merkaptoetanolu. Bunky boli raz premyté RPMI-1640 a potom naplnené 50 ug/ml acetylovaného LDL a 10μCi/ml 【'H】-cholesterolu v RPMI-1640 médiu obsahujúcom 2 percentá FCS počas 48 hodín pri 37 stupňoch . Po nanesení boli bunky raz premyté RPMI-1640 a inkubované s testovanými zlúčeninami počas ďalších 24 hodín v RPMI-1640 médiu obsahujúcom 1 mg/ml hovädzieho sérového albumínu bez mastných kyselín (BSA). Bunky sa potom raz premyli a eflux cholesterolu sa vyvolal pridaním 10 ug/ml ľudského apoAI alebo 30 ug/ml HDL2, HDL3 alebo LDL v RPMI-1640 obsahujúcom 1 mg/ml BSA na ďalší 6h. Rádioaktivita v supernatantoch kultúry bola stanovená scintilačným počítaním. Odtok cholesterolu bol vyjadrený ako relatívna hodnota oproti kontrolám inkubovaným v neprítomnosti akceptorov cholesterolu. Krivky dávka-odozva sa vypočítali pomocou XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK).

Odtok cholesterolu v podocytoch. Ľudské podocyty diferencované počas 13 dní boli značené počas 24 hodín pri 37 stupňoch v RPMI médiu obsahujúcom 2 percentá FBS a [PH]-cholesterol (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals). Bunky sa potom 3-krát premyli PBS a inkubovali sa s RPMI doplneným o 0,2 percenta beztukového BSA (Sigma) so zlúčeninami alebo bez nich počas 18-h pri 37 stupňoch. Zlúčeniny boli použité v nasledujúcich koncentráciách - Cpd C (1 uM), Cpd A (1 uM, 5 uM) a Cpd G (l uM, 5 uM, 1 0 uM). Po 18-hodinovej inkubácii sa do média pridal ľudský apoAI（Calbiochem） (20 ug/ml konečná koncentrácia) a bunky sa inkubovali ďalších 18 hodín pri 37 stupňoch. Alikvóty média odobraté pred (T =0h) a po (T=18h) pridaní apoAI sa centrifugovali pri 12,00×g počas 5 minút a rádioaktivita v supernatante bol počítaný kvapalinovou scintiláciou. Bunky sa potom premyli PBS, lýzovali 0,1 % SDS, 0,1 M NaOH a rádioaktivita v lyzátoch sa kvantifikovala kvapalinovou scintiláciou. Odtok cholesterolu sprostredkovaný apo Al, vyjadrený v percentách, sa vypočítal ako množstvo značky uvoľnenej do média po pridaní apo Al (rozdiel v rádioaktivite v médiu pred a po pridaní ApoA1) vydelené množstvom celkovej značky v každej jamke. (rádioaktivita uvoľnená do média plus rádioaktivita v lyzovaných bunkách).

štúdie siRNA. Súbory siRNA špecifické pre ľudský OSBPL7, ľudský CBIR a necieľovú siRNA negatívnu kontrolu sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke 6. THPI monocyty boli nasadené v hustote 80,000 buniek/jamka v {{4} }jamkové platne a diferencované pomocou PMA, ako je opísané vyššie. Po 72 hodinách sa médium nahradilo 50 ul čerstvého média na jamku. Bunky sa potom transfekovali s použitím činidla Viromer Blue (Origene) podľa pokynov výrobcu. Stručne, 10 ul siRNA （5 μM） sa zmiešalo s 90 μl Viromer Blue（zriedenej 1 % v/v v dodanom pufri）. Po 15 minútach inkubácie sa komplexy siRNA-transfekčné činidlo zriedili v pomere 1:6,5 v čerstvom médiu a pridali sa do objemu 50 ul na jamku. Po 24 hodinách boli bunky naplnené cholesterolom inkubáciou s acetylovaným LDL (25 ug/ml) v médiu RPMI, 1 percentá FBS, 100 nM PMA, 2 uCi H-cholesterol počas 24 hodín. Sada jamiek obsahujúcich transfekované bunky sa odložila na overenie účinnosti transfekcie pomocou RT-PCR. Makrofágy naplnené cholesterolom sa potom inkubovali v prítomnosti Cpd G 5 uM alebo vehikula (0,1 percenta DMSO) v médiu RPMI, ktorým bola fenolová červeň, 0,2 percenta BSA) ďalších 24 hodín. Potom sa meral odtok cholesterolu, ako je opísané vyššie.

RT-PCR. RNA bola izolovaná pomocou súpravy RNEasy Plus Mini (Qiagen). Reverzná transkripcia sa uskutočnila s použitím qScript cDNA SuperMix (Quantabio) podľa pokynov výrobcu. Kvantitatívna PCR v reálnom čase sa uskutočnila s použitím TaqMan Fast Universal PCR Master Mix a Taqman génových expresných testov (doplnková tabuľka 7).

Western blot. Lyzáty alebo bunkové frakcie sa inkubovali v Laemmliho pufri pri 55 stupňoch počas 10 minút za redukčných podmienok. Celkom 30 ug proteínu z bunkových lyzátov alebo jedna tretina objemu zhromaždeného v prípravkoch bunkových frakcií sa separovala pomocou SDS-PAGE v 4-20 percentných gradientových géloch (Biorad) a proteíny sa potom preniesli na PVDF membrány. Po blokovaní 5 percentami TBS-mlieka boli membrány testované primárnymi protilátkami cez noc pri 4 stupňoch. Boli použité tieto primárne protilátky: myšacia anti-ABCA1(Abcam; 1:1000), králičia anti-GAPDH protilátka (Milli-pore;1:10,000),myšia anti-aktín( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 a anti-Na plus /K plus ATPáza (bunková signalizácia; všetky 1:100) a králičia anti-OSBPL7 (Sigma 1:1000). Po premytí boli membrány inkubované s anti-králičím alebo anti-myším IgG-HRP protilátkami (Promega, 1:10,00). Signály sa detegovali po inkubácii so substrátom Westernbright ECL HRP (Advansta) a luminiscenčné signály sa zachytili pomocou pracovnej stanice Azure C600 Gel Imaging (Azure Biosystems Inc, USA) alebo röntgenových filmov.

Bunková frakcionácia. Diferencované podocyty boli ošetrené zlúčeninami Cpd C （1 μM）, Cpd A（5 μM） alebo Cpd G（10 μM） počas 18 hodín, premyté a potom zozbierané v ľadovo studenom PBS. Bunky sa centrifugovali pri 1000xg počas 5 minút, supernatant sa opatrne odstránil a peleta sa resuspendovala v hypotonickom pufri (15 mM KCl, 1,5 mM MgClz, 10 mM HEPES a 1 mM DTT) doplnenom proteázou koktail inhibítorov (Roche). Bunky sa rozrušili skleneným drvičom a pridala sa sacharóza, aby sa dosiahla konečná koncentrácia 227 mM. Bunkové lyzáty sa centrifugovali pri 1000xg počas 30 minút pri 4 stupňoch. Supernatant bol potom prenesený do novej skúmavky a centrifugovaný pri 10 000 x g počas 15 minút pri 4 stupňoch. Peleta obsahujúca mikrozomálnu frakciu sa zozbierala a supernatant sa preniesol do novej skúmavky a centrifugoval sa pri 100 000 x g počas 1 hodiny pri 4 stupňoch. Peletovaná frakcia plazmatickej membrány sa zozbierala a supernatant, obsahujúci cytosolickú frakciu bez organel, sa skoncentroval na filtračných kolónach Vivaspin 500. Western blot sa uskutočnil s použitím protilátok pre ABCAl a špecifických markerov pre každú membránovú frakciu, ako je opísané vyššie. Nat/K plus ATPáza sa použila na identifikáciu frakcie plazmatickej membrány, ERp72 ako markera pre mikrozomálne obohatenú frakciu a MEK ako kontrola pre nemembranóznu cytosolickú frakciu.

ABC AT ko-imunoprecipitácia. Konštrukciu vlajky ABCA{{0}}} láskavo poskytol Dr.Michael Fitzgerald z Harvardskej univerzity. Konštrukt OSBPL7-V5 (pcDNA3.{4}}V5-ORP7) bol zakúpený od spoločnosti Addgene. Cicavčie expresné vektory PCMV6-AN-GFP a pCMV6-AC-3DDK od spoločnosti Origene sa použili ako negatívne kontroly. Bunky HEK293 boli prechodne kotransfekované jednou z nasledujúcich kombinácií plazmidov: (1)ABCA1-Flag plus OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Flag plus PCMV{{19 }}AN-GFP; alebo(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK s použitím transfekčného činidla Fugene 6 (Promega) podľa pokynov výrobcu. 48 hodín po transfekcii sa bunky lyžovali s 1 ml imunoprecipitačného pufra (1 percento Triton X-100, 50 mM Tris-Cl pH 7,0, 150 mM NaCl) doplneným kokteilom inhibítorov proteázy (Roche). Lyzáty sa vyčistili centrifugáciou a rovnaké množstvá celkových proteínov z každého supernatantu sa inkubovali cez noc pri 4 stupňoch s 30 ul anti-Flag M2 afinitného gélu (Sigma Aldrich). Guľôčky boli peletované centrifugáciou a 5-krát premyté 1 ml imunoprecipitačného pufra. Imunoprecipitované proteíny sa eluovali inkubáciou guľôčok s 50 ul 2x vzorkového pufra počas 15 minút pri 56 stupňoch. Prítomnosť ABC Al a OSBPL7-V5 v lyzátoch a eluátoch sa overila pomocou Western blotu, ako je opísané vyššie.

Štúdie na zvieratách. Zvieratá boli chované v cykloch 12 h/12 ​​h svetlo/tma a pri kontrolovanej teplote (18-23 stupeň) a vlhkosti (40-60 percent) v zariadení pre zvieratá Divízie veterinárnych zdrojov na univerzite bez patogénov. z Miami, Miller School of Medicine. Myšiam bola poskytnutá štandardná 18-percentná bielkovinová potrava pre hlodavce a voda ad libitum. Protokol štúdie schválil Výbor pre starostlivosť a používanie zvierat (IACUC) Univerzity v Miami, ktorý je akreditovaný Asociáciou pre hodnotenie a akreditáciu Laboratory Animal Care International (AAALAC). Všetky postupy boli vykonané v súlade so všetkými federálnymi a štátnymi etickými predpismi, vrátane predpisov zákona o ochrane zvierat (AWA), na ktoré dohliadalo Ministerstvo poľnohospodárstva Spojených štátov amerických (USDA) a Politiky verejnej zdravotnej služby týkajúcej sa humánnej starostlivosti a používania laboratórnych zvierat (PHS). Politika), ktorú spravuje Národný inštitút zdravia (NIH), Úrad pre dobré životné podmienky laboratórnych zvierat (OLAW). Samice myší Balb/c boli zakúpené od Jackson Laboratories na štúdie nefropatie vyvolanej adriamycínom. Vo veku 8 týždňov myši dostali jednu dávku adriamycínu (Sigma-Aldrich, 12 mg/kg) alebo vehikula (0,9 % NaCI) injekciou do chvostovej žily. Myši boli náhodne rozdelené do šiestich experimentálnych skupín a počnúc 24 hodinami po injekcii ADR boli liečené buď vehikulom alebo rôznymi dávkami zlúčenín denne orálnou sondou počas 28 dní. Boli použité nasledujúce dávky: Cpd C (agonista LXR) 10 mg/kg; Cpd A 30 mg/kg; Cpd G 100 mg/kg. Všetky zvieratá boli usmrtené 28 dní po injekcii ADR. Col4a3 KO myši (Col4a3tmiDec kmeň 129X1/SvJ) boli zakúpené od Jackson Labs. Myši boli náhodne rozdelené do 2 skupín. Počínajúc vo veku 4 týždňov sa myšiam orálnou sondou raz denne podávalo buď vehikulum alebo Cpd G (100 mg/kg) počas 4 týždňov, po čom nasledovalo usmrtenie vo veku 8 týždňov. Druhá štúdia sa uskutočnila na myšiach Col4a3 KO s liečbou zahájenou vo veku 6 týždňov. Táto štúdia sa uskutočnila s cieľom posúdiť, či liečba Cpd G u myší s preukázaným zlyhaním obličiek môže oddialiť konečné štádium ochorenia obličiek, a teda predĺžiť prežitie. Na liečbu ramiprilom začali myši Col4a3 KO dostávať ramipril vo veku 4 týždňov. Ramipril bol pridaný do pitnej vody v koncentrácii, ktorá by viedla k dávke 10 mg/kg/deň 8.

Fenotypová analýza myší. Týždenne sa odoberali vzorky moču. Močový albumín bol meraný pomocou ELISA (Bethy! laboratories) a kreatinín kolorimetrickým testom (Stanbio). Albuminúria bola vyjadrená ako pomer albumín/kreatinín. Myši boli anestetizované ketamínom (90 mg/kg)/xylazínom (10 mg/kg), krv bola odoberaná do heparinizovaných skúmaviek a zvieratá boli potom perfundované cez ľavú komoru 0,9 % roztokom NaCl. Kôry obličiek boli starostlivo vyrezané a rozdelené do vzoriek, ktoré boli buď rýchlo zmrazené, vložené do OCT alebo fixované v 10 percentnom formalíne na následné hodnotenia.

Stanovenie ukladania lipidov v rezoch kôry obličiek. Vzorky kôry obličky zaliate do OCT boli narezané na kryosekciu pri hrúbke 4 μm a zafarbené olejom. Červený O-izopropanolový roztok (Electron Microscopy Science, PA) zriedený 6:4 vo vode a potom kontrastne zafarbený Hematoxylínom Harris Hg Free (VWR, PA). Rezy sa potom vyhodnotili pomocou svetelného mikroskopu (Olympus BX 41, Tokio, Japonsko).

Stanovenie obsahu cholesterolu a triglyceridov. Vzorky zmrazenej obličkovej kôry sa homogenizovali v 2 mM tlmivom roztoku fosforečnanu draselného, ​​pH 7, (1 {{1{12}}}} pul tlmivého roztoku/mg tkaniva） pomocou skleneného drviča na ľade. 10 0 ul Homogenizát sa dôkladne premiešal s 1 ml zmesi hexán:izopropanol (3:2;obj.) na objem tkanivového homogenátu. Vodná (pelety) a organická (supernet) fáza sa oddelili centrifugáciou pri 12,000× Pelety (vodná fáza) sa vysušili a rekonštituovali v 8 M močovine, 0,1 % SDS, 0,1 M NaOH a celkové proteíny sa kvantifikovali metódou BCA (Thermofisher) Organická fáza sa vysušila vystavením dusíku. Lipidy sa potom rekonštituovali v 100 ul izopropanolu∶NP-40 (9:1;obj.). Obsah triglyceridov sa analyzoval pomocou kolorimetrickej súpravy podľa pokynov výrobcu (Cayman Chemical USA). Celkový cholesterol a obsah CE sa stanovili použitím enzymatickou fluorometrickou metódou59. Na meranie celkového cholesterolu sa extrakty zriedili v pomere 1:100 v testovacom pufri (100 mM fosforečnan draselný e,50mM NAC,5mM kyselina cholová,0,1% Triton X-10,pH 7,4)obsahujúci cholesteroloxidázu (1U/ml), cholesterolesterázu (1U/ml), chrenovú peroxidázu）1U/ml）, a Amplex Red (75 μM). Reakcie sa inkubovali pri 37 stupňoch počas 30 minút v čiernej nepriehľadnej 96-jamkovej platni (Greiner) a fluorescencia sa merala v čítačke mikrodoštičiek (Spectramax i3X, Molecular Devices) pri excitácii 530 nm a emisiách 580.

Na stanovenie CE sa 150 ul vyššie opísaného testovacieho tlmivého roztoku doplneného o bovinnú pečeňovú katalázu (45 U/ml) a cholesteroloxidázu (1 U/ml) pridalo k 25 ul vzorky a inkubovalo sa cez noc pri 37 stupňoch, aby došlo k vyčerpaniu cholesterolu ostávajú len estery cholesterolu. Potom sa pridalo 75 ul činidla na detekciu esterov cholesterolu (1 U/ml cholesteroloxidázy, 4 U/ml cholesterolesterázy, 24 U/ml chrenovej peroxidázy, 300 μM Amplex Red）. Reakcia sa inkubovala pri 37 stupňoch počas 30 minút a fluorescenčný signál sa meral ako je opísané vyššie.Vnútorné štandardy zahŕňali vzorky obsahujúce 1 mM cholesterolu a 5 uM cholesterololeátu, aby sa overila úplnosť enzymatického rozkladu voľného cholesterolu, ako aj citlivosť a špecificita testu.

Histologické vyhodnotenie. Rezy kôry obličky s hrúbkou 4 um fixované v parafíne fixované vo formalíne boli zafarbené pomocou kyseliny jodistej-Schiff (PAS). Sklíčka boli analyzované renálnym patológom v dvojito zaslepenom dizajne. Glomerulárna skleróza (globálna a segmentálna), hypertrofia podocytov a hyperplázia podocytov boli vyjadrené ako percento glomerulov zistených s týmito abnormalitami. Tubulárne mikrocysty a intersticiálny zápal boli hodnotené na škále 0-4, kde 0=0 percent , 05=1-10 percent , 1=11-25 percent ,2:26-50 percent ,3:{{ 12}} percent a 4=viac ako 75 percent poškodenia. Mesangiálna expanzia bola hodnotená na základe semikvantitatívnej analýzy (škála 0-5) alebo percenta glomerulov vykazujúcich mezangiálnu expanziu ( percent ).

Imunofluorescenčná mikroskopia. Na detekciu expresie ABC Al boli 4 um parafínové rezy kôry obličiek zbavené parafínu a rehydratované. Antigény boli získané varom počas 30 min v citrátovom pufri pH 6.0(Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Sigma, USA). Rezy boli permeabilizované počas 30 minút pomocou 0,1 percenta Tritonu X-100 v TBS. Tkanivové rezy sa inkubovali s 10 percentným kozím sérom (kat. č. G9023, Millipore Sigma) a 1 percentom BSA (kat. č. SP-5050-500, Vector, USA) v TBS-T počas 1 hodiny pri izbovej teplote, aby sa zablokovali akékoľvek nešpecifické viazanie. Vzorky sa potom inkubovali cez noc pri 4 stupňoch s potkaním anti-ABCAl (Novus, 1:200) a králičím anti-WI1 (Abcam, 1:200) protilátkami vo zvlhčenej komore. Po dôkladnom premytí sa vzorky potom inkubovali 1 hodinu pri teplote miestnosti so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s fluorochrómom (Invitrogen, 1:500). Pred analýzou sa k rezom pridalo upevňovacie médium proti vyblednutiu obsahujúce DAPI (Vectashield Plus).

Snímky sa získali pomocou konfokálneho mikroskopu FluoView FV1000 (Olympus) s x63 olejovou šošovkou objektívu v rôznych rovinách pomocou vzoru série Z s veľkosťou kroku 0,18 um. Počas analýzy boli jednotlivé roviny dekonvoluované a naskladané na vytvorenie maximálneho premietaného obrazu pomocou softvéru na zobrazenie chrípky verzie 4.3b (Olympus). Na jednu vzorku bolo zachytených minimálne 5 obrázkov z 5 rôznych polí. Kvantifikácia ABCAl glomerulárnej strednej intenzity fluorescencie (MFI) sa uskutočnila pomocou softvéru Fiji-ImageJ.

Na detekciu OSBPL7,4 um zmrazené rezy obličkovej kôry vložené do OCT, boli fixované PFA-sacharózou (2 percentá, 4 percentá) v PBS počas 2 0 minút pri teplote miestnosti a permeabilizované 0,3 percentami Triton-PBS pre 15 minút a blokované blokovacím pufrom (5 percent FBS v PBS) počas 1 hodiny. Tkanivové rezy sa potom inkubovali s králičou anti-OSBPL7 (Sigma, 1:50) a kozou anti-Synaptopodin (Santa Cruz, 1:800) protilátkami vo zvlhčenej komore cez noc pri 4 stupňoch. Po dôkladnom premytí sa vzorky potom inkubovali so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s fluorochrómom a prikryli sa montážnym médiom, ako je opísané vyššie. Obrázky boli zachytené pomocou fluorescenčného mikroskopu Leica DMI 6000B.

Štatistická analýza. Na vykonanie všetkých štatistických analýz sa použil GraphPad Prism ver 6 alebo 7. Skupiny sa porovnávali pomocou dvojstranného t-testu alebo jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Dunnettov alebo Tukeyov test. F, Brown-Forsythe alebo Bartlettov test sa použili na určenie významných rozptylov medzi skupinami, ak P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

Všetky zvieratá boli náhodne rozdelené do liečebných skupín.