Ochranné účinky mikrovezikúl endoteliálnych progenitorových buniek na poškodenie potkaních obličkových buniek vyvolané Ang II
Mar 11, 2022
Abstraktné.Chronická hypertenzia môže viesť kpoškodenie obličiek,známe ako hypertenzná nefropatia alebo hypertenzná nefroskleróza. Ďalšie pochopenie molekulárnych mechanizmov, prostredníctvom ktorých sa hypertenzná nefropatia vyvíja, je nevyhnutné pre účinnú diagnostiku a liečbu. Táto štúdia skúmala mechanizmy, ktorými endotelové progenitorové bunky (EPC) opravujú primárne potkanyobličkybunky (PRK). ELISA, Cell Counting Kit-8 a testy prietokovej cytometrie sa použili na analýzu účinkov EPC alebo EPC-MV na oxidačný stres, zápal, bunkovú proliferáciu, apoptózu a cyklus PRK indukovaných AngII. Bol vytvorený model poranenia PRK s použitím angiotenzínu II (Ang II). Po indukcii Ang II sa proliferácia PRK znížila, apoptóza sa zvýšila a bunkový cyklus sa zablokoval vo fáze G1 pred vstupom do fázy S. Zistilo sa, že hladiny reaktívnych foriem kyslíka a malondialdehydu boli zvýšené, zatiaľ čo hladiny glutatiónperoxidázy a superoxiddismutázy boli znížené. Okrem toho sa významne zvýšili hladiny zápalových cytokínov IL-1, IL-6 a TNF-. Ang II teda poškodil PRK stimuláciou oxidačného stresu a podporou zápalovej reakcie. Keď sa však PRK kultivovali spoločne s EPC, poškodenie indukované Ang II sa výrazne znížilo. Súčasná štúdia zhromaždila mikrovezikuly (MV) vylučované EPC a kokultivovala ich s PRK indukovanými Ang II a zistila, že EPC-MV si zachovali svoj ochranný účinok na PRK. Záverom možno povedať, že EPC chránia PRK pred poškodením vyvolaným Ang II prostredníctvom vylučovaných MV.
CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN
Úvod
Hypertenzia je rizikovým faktorom pre výskyt kardiovaskulárnych a cerebrovaskulárnych ochorení a s nimi spojenú mortalitu (1). Theobličkymôžu spôsobiť hypertenziu a sú jedným z cieľových orgánov poškodenia hypertenziou (2). Chronickýochorenie obličiek(CKD) bola v posledných dvoch desaťročiach jednou z hlavných príčin zvýšenej úmrtnosti medzi jednotlivcami s vysokým krvným tlakom na celom svete (3,4). Existuje teda naliehavá potreba podporovať liečbu hypertenznej nefropatie a študovať jej patologický mechanizmus. Predchádzajúce štúdie ukázali, že angiotenzín II (Ang II) indukoval vaskulárne poškodenie a zohrával kľúčovú úlohu pri vaskulárnych ochoreniach prostredníctvom niekoľkých mechanizmov, ako je indukcia apoptózy (5), zastavenie bunkového cyklu (6), zvýšenie hladín reaktívnych foriem kyslíka (ROS) ( 7), podpora reakcie na oxidačný stres zvýšením sekrécie malondialdehydu (MDA) a znížením sekrécie glutatiónperoxidázy (GSH-Px) a superoxiddismutázy (SOD) (8,9). Ang II tiež podporuje produkciu faktorov súvisiacich so zápalom, ako sú IL-6, IL-1 a TNF- (10-12). Ang II-indukované poškodenie sa preto použilo na modelovanie hypertenzie in vitro, vrátane primárneho potkanaobličkybunky (PRK) (13,14).
Pre pacientov sfunkcie obličiekpoškodenie, poškodenie endotelových buniek a znížená regenerácia a oprava sú hlavnými príčinami straty peritubulárnych mikrovezikúl (MV) (15). Endotelové progenitorové bunky (EPC) odvodené z kostnej drene môžu podporovať opravu endotelu (16, 17). Predchádzajúce štúdie ukázali, že EPC môžu zlepšiť kardiovaskulárnu regeneráciu (18) a regulovať angiogenézu (19), ako aj mať terapeutické účinky na akútneobličkovéischemicko-reperfúzne poškodenie (20) a u pacientov stransplantácia obličiek(21). Podľa našich najlepších vedomostí však účinok EPC na hypertenznú nefropatiu nebol predtým hlásený. Predpokladali sme, že EPC môžu mať ochranný účinok proti hypertenznej nefropatiiobličkovébunky. MV sú kontinuálne vylučované rôznymi bunkami v tele, ako sú epitelové bunky, nádorové bunky a kmeňové bunky, a existujú v niekoľkých telesných tekutinách, ako je krv, moč a mlieko, kde sprostredkúvajú biologické funkcie (22). Hromadné dôkazy naznačujú, že ochranný účinok EPC je úzko spojený s uvoľňovaním MV (23, 24) V tejto štúdii sa skúmala potenciálna aplikácia EPC-MV na liečbu hypertenznej nefropatie skúmaním ochranných účinkov a mechanizmov prostredníctvom ktorých EPC-MV chránia pred poškodením PRK indukovaným Ang II, aby sa poskytol biologický teoretický základ na liečbu hypertenznej nefropatie.
Kľúčové slová:EPC-MV, hypertenzná nefropatia, Ang II, ROS, MV, zápal, obličky, obličky
Materiály a metódy
Zvieratá.Celkový počet 12 8-týždňových samcov krýs Wistar-Kyoto (WKY) bez špecifických patogénov (hmotnosť, 80-120 g) bol získaný z Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licencia SCXK, Guangdong, 2015-0063). Potkany boli umiestnené v miestnosti s konštantnou teplotou a vlhkosťou (teplota 23 ± 2 °C; vlhkosť 50 ± 10 percent), v 12-hodinovom cykle svetlo/tma s ad libitným prístupom k štandardnej potrave pre potkany a vode. polystyrénová klietka. Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie Lekárskej univerzity Hainan (Haikou, Čína; schválenie č. HYLL-2021-053) a boli vykonané v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia (25).
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL
Izolácia a kultúra PRK.Potkany WKY s voľným prístupom k vode hladovali 12 hodín pred experimentom. Myši WKY boli usmrtené pomocou intraperitoneálnej injekcie pentobarbitalu sodného (200 mg/kg telesnej hmotnosti), potomobličkysa asepticky odstránili a kortikálna časťobličkybol vyrezaný a transplantovaný do malej kadičky. Theobličkovékôra bola narezaná na tkanivové fragmenty ~1 mm3, premytá trikrát PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugovaná pri 1,000 x g pri 25 °C počas 5 minút a supernatant bol odstránený. Fragmenty tkaniva sa pridali ku kolagenáze typu I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) v konečnej koncentrácii 1 g/l a fragmenty tkaniva sa oscilovali a štiepili pri 37 °C počas 30 min. Po filtrácii cez sito z nehrdzavejúcej ocele s veľkosťou ôk 200 mesh (0,075 mm) sa bunky oddelili centrifugáciou v hustotnom gradiente Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (26). Po odstredení pri 1,000 x g pri 25 °C počas 2 minút sa medziproduktová suspenzia zozbierala a zmiešala s médiom MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), naočkovala do 6-jamkovej platne a kultivované pri 37 °C pod 5 percentami CO2. Po 24 hodinách sa médium odstránilo a nahradilo sa čerstvým médiom a nepripojilo saobličkovébunky a tkanivo sa vyhodili. Po 48 hodinách sa médium opäť odstránilo, bunky sa dvakrát premyli PBS a označili sa ako PRK (27, 28); hlavnou zložkou boli potkanie glomerulárne mezangiálne bunky. PRK boli kultivované počas troch generácií a ošetrené Ang II (1 uM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) pri 37 °C počas 24 hodín, aby sa stanovila PRKpoškodenie obličiekModel. Ang II-indukovaný zápal u potkanovobličkovétubulárne epitelové bunky sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané v Nair et al (29).
PRK boli identifikované pomocou imunofluorescenčného (IF) testu.Po trojnásobnom opláchnutí PBS a fixácii 4 percentami paraformaldehydu pri teplote 25 °C počas 1 hodiny boli bunky inkubované (25 °C) s Tritonom X-100 počas 2 hodín a následne 5 percentami BSA (Peking Solar Science & Technology Co., Ltd.) pri 25˚C počas 30 minút. PRK sa potom inkubovali cez noc v tme s aktínom z hladkého svalstva (-SMA; 1 ug/ml; kat. č. ab7817; Abcam) a vimentínom (1:250; kat. č. ab92547; Abcam) pri 4 °C. Po trojnásobnom premytí PBS boli bunky inkubované so sekundárnymi protilátkami Alexa Fluor® 488‑ (1:100; kat. č. ab150077; Abcam) alebo 647‑značenými (1:200; kat. č. ab150075; Abcam) v 37. ˚C počas 1 hodiny. Potom sa bunky farbili s DAPI (0,5 ug/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) pri 25 °C počas 5 minút. Nakoniec sa snímky zachytili pomocou fluorescenčného mikroskopu (zväčšenie, x400; Leica Microsystems GmbH).
Kultúra a identifikácia EPC.Stehenná kosť a holenná kosť potkana boli vyrezané a každá skúmavka kostnej drene bola prepláchnutá sterilným PBS. Výsledná zmes sa odstredila (1,000 x g; 25 °C; 15 minút) a častice sa resuspendovali v médiu MEM/F12. Bunky boli izolované Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) centrifugáciou v hustotnom gradiente (1, 000 xg; 25 °C; 20 min) a umiestnené do 25-cm2 kultivačnej banky potiahnutej fibronektínom (BD Biosciences). Bunky sa udržiavali v kompletnom médiu za štandardných podmienok (37 °C; 5 percent CO2). Kultivačné médium sa vymenilo po 4 dňoch a adherentné bunky sa kultivovali ďalšie 3 dni (30). Na identifikáciu EPC sa použilo farbenie acetylovaným lipoproteínom s nízkou hustotou (Dil‑Ac‑LDL) komplexom Dil (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Pre systém spoločnej kultivácie sa PRK (1x104 ) pridali do spodnej komory kokultivačnej platne (Corning, Inc.) na 24 hodín a potom sa pridal Ang II (1 uM) alebo 200 ul PBS a EPC (3x104). pridali do hornej komory a inkubovali pri 37 °C počas 24 hodín pred vykonaním ďalšej analýzy bunkovej funkcie. Pri skríningu PRK a najlepšieho podielu EPC boli pomery počtu buniek 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 a 1:7.
Príprava EPC-MV. EPC sa kultivovali 7 dní, ako už bolo opísané (30), premyli sa dvakrát PBS a nechali sa 12 hodín vyhladovať sérum. Následne sa zozbieralo médium MEM/F12 obsahujúce kultivované EPC a centrifugovalo sa pri 4 °C (1, 000 x g; 15 minút) a supernatant sa extrahoval pri 4 °C (100, 000 xg; 60 minút) na zber sekretovaných EPC-MV. Po zaliatí do epoxidovej živice Pon 812 (Structure Probe, Inc.) sa umiestnila cez noc pri 37 °C. Potom sa na 4 hodiny pridal roztok na fixáciu elektrónového mikroskopu (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) a octan uránový (2 percentá; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) a citrát olovnatý (Wuhan Service Technology Co., Ltd. ) sa farbili pri 25 °C počas 15 minút. MV boli potvrdené transmisnou elektrónovou mikroskopiou. V systéme spoločnej kultivácie sa do hornej komory testovacej platne Transwell pridalo 50 ug/ml EPC-MV (31) a do spodnej komory sa pridali parky, ako bolo opísané vyššie, a inkubovali sa 24 hodín.
Test bunkovej proliferácie.PRK boli štiepené trypsínom, naočkované do 96-jamkových doštičiek v hustote 3x103 buniek/jamka a kultivované 24 hodín. Optická hustota pri 450 nm sa merala pomocou 10 µl činidla Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) pri 37 °C počas 60 minút podľa pokynov výrobcu, aby sa vyhodnotil rýchlosť bunkovej proliferácie.
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN
Test bunkovej apoptózy.Test bunkovej apoptózy sa uskutočnil pomocou súpravy na detekciu apoptózy Annexin V-FITC (BD Biosciences) podľa pokynov výrobcu. PRK boli zozbierané, dvakrát premyté ľadovo studeným PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a resuspendované v 50}0 ul väzbového pufra. Resuspendované PRK sa potom inkubovali s 5 ul annexinu V-FITC a 5 ul PI v tme počas 15 minút pri 23 ± 2 °C. Apoptóza buniek bola hodnotená pomocou prietokovej cytometrie (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™ software, verzia: 1.0; BD Biosciences).
Fúzia EPC-MV a PRK.Aby sa zistilo, či EPC-MV boli fúzované s PRK, EPC-MV boli označené fluorescenčným farbivom vloženým do lipidovej membrány (PKH26) pred spoločnou inkubáciou. Stručne, 50 ug/ml EPC-MV sa spojilo s 2 ml PKH26 (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) a miešalo sa pri 23 ± 2 °C počas 5 minút. Označená zmes sa pridala do 2 ml 1% BSA (v) a centrifugovala sa pri 100, 000 x g pri 4 °C počas 60 minút, potom sa prepláchla studeným PBS. Precipitát sa suspendoval v 1 ml média MEM/F12, pridal sa k PRK a inkuboval sa pri 37 °C počas 24 hodín. Nakoniec sa pridal 1 ug/ml DAPI na farbenie jadier pri 25 °C počas 15 minút. Bunkové obrázky sa získali pomocou fluorescenčného mikroskopu (zväčšenie, x 400; Leica Microsystems GmbH).
Test bunkového cyklu.Test bunkového cyklu sa uskutočnil pomocou súpravy Cell Cycle Detection kit (BD Biosciences). EPC alebo PRK (1x106) boli zozbierané, dvakrát premyté PBS a potom fixované v 500 ul 70 % ľadovo chladného etanolu počas 2 hodín pri 25 °C. Bunky sa potom dvakrát premyli studeným PBS a inkubovali sa v PI (400 ul) a RNáze (100 ul) počas 30 minút pri 37 °C v tme. PI signál sa detegoval pomocou FCM (FACSCanto II). Percento buniek vo fáze G1, S a G2 sa spočítalo a porovnalo pomocou softvéru FlowJo (verzia 10.0.6; FlowJo LLC).
Meranie ROS pomocou FCM.PRK boli kultivované do 60-70 percent konfluencie a zozbierané trypsinizáciou. Všetky bunky boli inkubované s 1,0 uM 2',7'-dichlórdihydrofluoresceín diacetátom počas 15 minút pri 37 °C. Bunky sa potom dvakrát premyli PBS a analyzovali sa pomocou FCM na detekciu ROS s použitím 488 nm lasera na excitáciu a 535 nm lasera na detekciu.
ELISA.Po centrifugácii (1,000 xg; 25˚C; 5 minút) sa odobral bunkový supernatant z každej podskupiny na analýzu hladín MDA, GSH-Px, SOD a zápalových faktorov IL-6, IL- 1 a TNF‑. Nasledujúce súpravy boli použité podľa pokynov výrobcu: testovacia súprava Micro MDA (kat. č. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), testovacia súprava GSH-Px (kat. č. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), súprava na detekciu aktivity SOD (kat. č. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), súprava potkanieho IL‑1 ELISA (kat. č. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), potkaní IL-6 Quantikine ELISA kit (kat. č. R6000B; R&D Systems, Inc.) a potkaní TNF Quantikine ELISA kit (kat. č. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Štatistická analýza.Všetky experimenty sa opakovali trikrát a všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Údaje boli analyzované pomocou softvéru SPSS verzie 21.0 (IBM Corp.). Rozdiely medzi viacerými skupinami boli hodnotené pomocou jednosmernej ANOVA a Dunnettovho post hoc testu. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Výsledky
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 percent, čo potvrdzuje, že EPC boli úspešne izolované. Izolované PRK boli analyzované pomocou IF (vimentín/-SMA). Výsledky ukázali, že hladina expresie vimentínu/-SMA v PRK bola vysoká a pozitívna, čo naznačuje úspešnú izoláciu PRK (obr. 1B).
Optimálny pomer EPC k PRK.Skúmal sa účinok kombinovania rôznych pomerov PRK/EPC v systéme spoločnej kultúry a zistilo sa, že PRK pestované v pomere 1:3 PRK/EPC nemali zvýšenú mieru proliferácie v porovnaní s PRK pestovanými s 2: 1, 1:1 alebo 1:2 pomer PRK/EPC (obr. 1C). Okrem toho zvyšujúci sa podiel EPC (1:4, 1:5, 1:6 a 1:7) viedol k významnému zvýšeniu proliferácie PRK v porovnaní s proliferáciou EPC (1:3). Preto sa pre ďalšie štúdie zvolil pomer 1:3 PRK/EPC, aby sa zabránilo možnej interferencii nadmerných EPC v nasledujúcich experimentoch.
Účinok ko-kultúry EPC na poškodenie vyvolané Ang II.PRK (1 x 104 ) sa naočkovali 24 hodín vopred do spodného oddelenia platne Transwell. Horná komora obsahovala 200 ul PBS v kontrolnej skupine a 200 ul EPC (3x104) v experimentálnej skupine. Modelovaťpoškodenie obličiek,Do spodného kompartmentu sa pridal 1 uM Ang II. Po 24 hodinách sa uskutočnili testy CCK-8 a FCM na meranie rýchlosti proliferácie PRK. PRK dostávajúce Ang II v neprítomnosti EPC mali významne znížené (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">obličkybunkový model.
EPC chránia PRK pred poškodením vyvolaným Ang II, skúmali sa hladiny oxidačného stresu vyvolaného Ang II v PRK spoločne kultivovaných s EPC. Výsledky z FCM testu odhalili, že Ang II sa významne zvýšil (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs. PRKs:EPC, skupina 2:1; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">obličkybunky; FCM, prietoková cytometria; CCK-8, súprava na počítanie buniek-8; Dil‑Ac‑LDL, komplex Dil acetylovaný lipoproteín s nízkou hustotou; OD, optická hustota; ‑SMA, ‑aktín hladkého svalstva; NS, nie je významné. opačné výsledky, pokiaľ ide o sekréciu týchto enzýmov. Tvorba ROS sa preto môže podieľať na poškodení buniek indukovanom Ang II a môže sa zlepšiť spoločnou kultiváciou s EPC.
Ang II môže tiež poškodiť bunky podporou sekrécie zápalových cytokínov, zatiaľ čo EPC môžu zabrániť zápalu (32). Ďalej sa skúmalo, či Ang II podporuje sekréciu zápalových cytokínov v PRK a či EPC môžu vykonávať svoju ochrannú úlohu inhibíciou sekrécie zápalových cytokínov. Sekrécia IL-1, IL-6 a TNF- bola významne zvýšená v PRK pridaním Ang II. Naopak, v PRK kultivovaných spoločne s EPC boli hladiny IL-1, IL-6 a TNF- (obr. 2E-G) porovnateľne nižšie (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Ochranný účinok EPC sa uplatňuje prostredníctvom MV.Mechanizmy, prostredníctvom ktorých EPC majú ochranné účinky na indukované Ang IIobličkybunky sa ďalej analyzovali izoláciou MV z EPC (obr. 3A). EPC-MV boli označené PKH26 a pridané k PRK spolu s Ang II na doštičke Transwell, ako už bolo opísané. Fluorescencia PKH26 bola detegovaná v cytoplazme PRK (obr. 3B), čo naznačuje, že EPC-MV fúzovali s PRK. Potom sa zistilo, že znížená rýchlosť proliferácie indukovaná Ang II, podporovaná apoptózou a zastavením cyklu vo fáze G1, boli inhibované EPC-MV (obr. 3C-E). Podobne ako PRK kultivované spoločne s EPC, PRK pestované v prítomnosti EPC-MV a vystavené Ang II mali znížené hladiny ROS a MDA (obr. 4A a B), zvýšené hladiny GSH a SOD (obr. 4C a D) a znížená sekrécia zápalových cytokínov IL-1, IL-6 a TNF- (obr. 4E-G) v porovnaní so skupinou Ang II.
Diskusia
Podľa našich najlepších vedomostí táto štúdia prvýkrát preukázala, že EPC môžu chrániť PRK pred poškodením buniek vyvolaným Ang II. Tento ochranný účinok je aspoň čiastočne sprostredkovaný MV, ktoré sú vylučované EPC a fúzujú s PRK počas spoločnej kultivácie. Pridaním obohatených MV k PRK vystaveným Ang II sa zistilo, že samotné EPC-MV by mohli chrániť PRK pred poškodením vyvolaným Ang II inhibíciou oxidačného stresu a zápalu. MV sú definované ako membránové nanodebris (0.05‑1 µm) (33) a vylučujú sa z povrchu bunky po aktivácii, strese alebo apoptóze. Okrem toho môžu byť MV odvodené z rôznych typov buniek, ako sú krvné doštičky, endotelové bunky, EPC a biele krvinky (34, 35). MV exprimujú špecifické markery bunkového povrchu, ktoré sa líšia v závislosti od pôvodnej bunky a ich tvorby a môžu mať protizápalové, antikoagulačné a angiogénne účinky (36). MV uvoľnené z EPC môžu niesť biologickú informáciu svojej rodičovskej bunky, a tak vykonávať podobnú funkciu na cieľové bunky (33). Napríklad EPC-MV chránia kardiomyocyty pred hypertrofiou a apoptózou indukovanou Ang II (28), zlepšujú funkciu endotelu a schopnosť regulovať angiogenézu (37) a zmierňujú dysfunkciu endotelu vyvolanú oxidačným stresom (38). Podľa našich najlepších vedomostí však účinok EPC-MV na hypertenznú nefropatiu nebol predtým hlásený. Preto sa táto štúdia zamerala na skúmanie potenciálnych ochranných účinkov EPC a EPC-MV vpoškodenie obličkových buniek.
V tejto štúdii bol vytvorený model poranenia PRK vyvolaním poškodenia pomocou Ang II. V súlade s predchádzajúcimi správami (26, 39) Ang II znížil proliferáciu PRK, zvýšil apoptózu a zastavil bunkový cyklus vo fáze G1 pred vstupom do fázy S. Na základe týchto markerov súvisiacich s hypertenziou sa dospelo k záveru, že model hypertenzie PRK indukovaný Ang II bol úspešne vytvorený. Ďalej sa zistilo, že kokultivácia s EPC chránila PRK pred poškodením vyvolaným Ang II. Po spoločnej inkubácii EPC s PRK plus Ang II sa hladiny enzýmov oxidačného stresu a zápalových faktorov v PRK znížili. Potenciálne mechanizmy, prostredníctvom ktorých EPC uplatňujú svoje ochranné účinky na PRK, teda môžu zahŕňať reguláciu oxidačného stresu a zápalu. Podľa našich najlepších vedomostí súčasná štúdia prvýkrát preukázala, že EPC môžu zlepšiť reakciu na oxidačný stres indukovanú Ang II a zápal v PRK.
EPC účinne chrániafunkcie obličiekpri CKD (40) a zohrávajú hlavnú úlohu pri udržiavaní vaskulárnej integrity a oprave endotelového poškodenia (15), ako aj pri znižovaní presakovania ciev, zlepšovaní funkcie orgánov a zvyšovaní miery prežitia pri sepse (41). Hromadné dôkazy naznačujú, že EPC môžu vykonávať ochrannú úlohu prostredníctvom sekrécie MV (37, 42, 43). Na testovanie ochranného účinku EPC-MV v PRK boli EPC-MV izolované a označené PKH26 a potom boli označené MV koinkubované s PRK plus Ang II. EPC-MV fúzovali s PRK a významne inhibovali reakciu na oxidačný stres a zápal indukovaný Ang II a tieto výsledky sú podobné ako výsledky Fu et al (44). Inhibičný účinok EPC-MV na hladiny enzýmov oxidačného stresu bol väčší ako účinok samotných EPC; možno to pripísať tomu, že MV sú prítomné vo vyššej koncentrácii v PRK ošetrených EPC-MV ako v tých, ktoré sú kokultivované s EPC. Tieto zistenia naznačujú, že ochranný účinok EPC na PRK proti poškodeniu buniek vyvolanému Ang II môže závisieť od vylučovaných MV. Obmedzením tejto štúdie je, že potenciálne mechanizmy, prostredníctvom ktorých EPC-MV regulujú osi mikroRNA/mRNA/transdukcie signálu, neboli úplne preskúmané. Úloha a mechanizmy, proti ktorým EPC-MV vykonávajú ochranupoškodenie obličiekby sa mali hodnotiť na zvieracom modeli hypertenznej nefropatie, čo je sľubný smer pre budúci výskum. Na záver, táto štúdia preukázala, že EPC môžu chrániť PRK pred oxidačným stresom vyvolaným Ang II a zvýšeným zápalom prostredníctvom sekrécie MV. To poskytuje nový smer liečby hypertenznej nefropatie a vytvára in vitro model na štúdiumpoškodenie obličiek.
