skJazyk
Domov / Vedomosti / Obsah

Vedomosti

Chrysogenamid A z endofytickej huby spojenej s Cistanche Deserticola a jej neuroprotektívnym účinkom na bunky SH-SY5Y

Mar 03, 2022

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Úvod

Cistanche deserticola(YC Ma) je parazitická rastlina pôvodom zo severozápadu Číny. Stonka tejto rastliny je dôležitou tradičnou čínskou medicínou a používa sa na liečbu nedostatku obličiek a neurasténie ("The Chinese Medicine Dictionary", 1977). Fenyltanoidové glykozidy zCistanchedeserticolabolo hlásené, že majú aktivity v prevencii a liečbe ochorení hlavových nervov a odstraňovaní voľných radikálov [1, 2]. Na základe skutočnosti, že endofytické huby dokážu produkovať nové liečivé zložky a rovnaké/podobné ako zložky z hostiteľských rastlín, ukazuje hľadanie nových účinných látok z endofytických húb významných liečivých rastlín hodnotu pre vývoj nových liečivých zdrojov. V priebehu nášho hľadania nových neuroprotektívnych zlúčenín z endofytických húb zCistanchedeserticolazozbierané z Vnútorného Mongolska v severozápadnej Číne boli tri aktívne kmene skrínované pomocou buniek SH-SY5Y. Medzi nimi kultivačný bujón huby č. 005, overený ako Penicillium chrysogenum, vykazoval významný ochranný účinok neurocytov proti bunkovej smrti indukovanej oxidačným stresom v bunkách SH-SY5Y. Štúdie na aktívnych zložkách tohto kmeňa viedli k izolácii chrysogenamidu A (1) (obr. 1) pomocou izolačného postupu riadeného biologickým testom. Okrem toho boli izolované štyri známe zlúčeniny a identifikované ako circumdat v G (2) [3], 2-[(2-hydroxypropionyl)amino]benzamid (3) [4], 2- ,3-dihydrosorbicilín (4) [5] a (9Z,12Z)-2,3-dihydroxypropyloktadeka-9,12-dienoát (5) [6] porovnaním ich spektroskopických údajov s údajmi z literatúry. Tu uvádzame izoláciu, identifikáciu a neuroprotektívny účinok chrysogenamidu A.

Cistanche deserticola

Cistanche deserticola

Materiály a metódy

Hubový materiál Vzorka Penicillium chrysogenum č. 005 bola izolovaná z koreňa C. deserticola zozbieraného z Vnútorného Mongolska v severozápadnej Číne. Na zemiakovo-dextrózovom agare mal makroskopický vzhľad roztiahnuté, hladké, zamatové, modrozelené kolónie niekedy porastené svetlými hýfami; povrch kolónií často vykazoval početné svetložlté kvapôčky; rubová žltá. Uskutočnilo sa vyhľadávanie GenBank s génovou sekvenciou 18S ribozomálnej DNA č. 005 (1676 nukleotidov; prírastkové číslo Gen-Bank EU203859). Výsledky naznačujú, že druh Penicillium chrysogenum je najbližší. Na základe svojho makroskopického vzhľadu a génovej sekvencie 18S rDNA je č. 005 kmeň Penicillium chrysogenum.

image

Fermentácia a extrakcia

Huba sa pestovala za statických podmienok pri 24 stupňoch počas 3{{10}} dní v 35 1000-ml kónických bankách obsahujúcich tekuté médium (30{{2{{22} }}} ml/fľaša) zložené z glukózy (10 g/liter), maltózy (20 g/liter), manitolu (20 g/liter), glutamanu sodného (10 g/liter), KH2PO4 (0,5 g/liter), MgS04.7H2O (0,3 g/liter), kukuričný výluh (1,0 g/liter) a kvasnicový extrakt (3,0 g/liter) a morská voda po úprave jej pH na 7,0. Fermentovaný celý bujón (10,5 litra) sa trikrát extrahoval EtOAc, čím sa získal EtOAc roztok, ktorý sa skoncentroval za zníženého tlaku, čím sa získal surový extrakt (9,5 g).

Prečistenie

Surový extrakt (9,5 g) sa rozdelil na 15 frakcií na silikagélovej kolóne s použitím krokovej gradientovej elúcie petroléter/Me2CO. Frakcia 2, eluovaná 8 : 2 petroléter/Me2CO, sa rekryštalizovala z MeOH, čím sa získala zlúčenina 3 vo forme bezfarebných ihličiek (8.{{10}} mg). Frakcia 3 (19.{{30}}} mg), eluovaná zmesou petroléter/Me2CO v pomere 7 : 3, sa ďalej separovala na kolóne s reverznou fázou (RP18, 40 6{{38 }} mm, Merck, MeOH - H20 3:2 -> 4:1 -> MeOH), čím sa získa fr. 3 7 (8.0 mg), ktorý bol purifikovaný extenzívnou PHPLC (60 percent MeOH obsahujúci {{70}},1 percenta TFA, 4).{77} } ml/minútu), čím sa získa 4 (2.{{80}} mg). Frakcia 4 (26,0 mg), eluovaná 6 : 4 petroléter/Me2CO, sa ďalej separovala na kolóne s reverznou fázou (RP18, 40 60 mm, Merck; MeOH - H20 3:2 -> 4:1 -> MeOH). fr. 4-3 (5,4 mg) a fr. 4-9 (7,6 mg). Potom fr. 4-3 sa oddelil pomocou rozsiahlej PHPLC [YMC-pack ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/minútu] (60 percent MeOH, 4,0 ml/minútu), čím sa získal 2 (1,0 mg) a fr. 4-9 sa oddelil extenzívnou PHPLC (80 percent MeOH, 4,0 ml/minútu), čím sa získala zlúčenina 1 (4,0 mg) a 5 (2,6 mg). 1: získaná ako svetložltá pevná látka; [a]D25 24,5 stupňa (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) 1 max 208, 251 nm; CD (MeOH) (pozri obr. 4); IR (KBr) nmax 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm1; 'H- a 13C-NMR (pozri tabuľku 1); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (vypočítané pre C28H38N302, 448,2964)

DPPH Radical Scavenging Effect

Roztok MeOH (160 ml) s rôznymi koncentráciami vzorky (1,{3}} mg/ml 0,0001 mg/ml) sa pridal k 40 ml DPPH (1,1- difenyl{{8 }}pikrylhydrazyl;Sigma) MeOH roztok (1,5 x 104 M). Po miernom premiešaní a ponechaní 30 minút pri teplote miestnosti sa merala optická hustota pri 520 nm pomocou spektrofotometra. Antioxidačná aktivita každej vzorky bola vyjadrená ako IC50 (mg/ml alebo mM potrebná na inhibíciu tvorby DPPH radikálov o 50 percent) a vypočítaná z logaritmickej inhibičnej krivky dávky.

neuroprotective of cistanche deserticola

neuroprotektívum cistanche deserticola

Bunková kultúra a liečba liekmi

Bunky ľudského neuroblastómu SH-SY5Y sa kultivovali v médiu DMEM a udržiavali sa pri 37 stupňoch vo vlhkej atmosfére s 5 0 percentami CO2. Tieto bunkové suspenzie (180 ml) s hustotou 5*104 bunkové ml-1 sa umiestnili do 96- jamkových mikrotitračných platní a inkubovali sa 24 hodín pri vyššie uvedený stav. Do každej jamky s výnimkou kontrolnej a modelovej skupiny sa pridal roztok chrysogenamidu A (2,0 ml v DMSO) v rôznych koncentráciách a ďalej sa inkuboval 1 hodinu za rovnakých podmienok. H202 (Sigma Chemical Co., MO, USA) bola pridaná na vyvolanie apoptózy v SH-SY5Y bunkách v konečnej koncentrácii 200 mM počas 24 hodín. Životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou MTT testu. Na konci inkubácie sa pridal MTT rozpustený vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom do konečnej koncentrácie 5,0 mg/ml (PBS) a potom sa inkuboval pri 37 stupňoch počas 4 hodín. Po odstránení supernatantu sa výsledný formazanový produkt rozpustil.

Výsledky a diskusia

1 sa získala vo forme svetložltej pevnej látky. Molekulový vzorec bol stanovený ako C28H37N302 pomocou HRESI-MS (pozorované [MH] pri m/z 448,2951, označené [MH] C28H38N302, 448,2964). IČ spektrum naznačovalo prítomnosť NH (3433 a 3200 cm1) a karbonylovej skupiny (skupín) (1677 cm-1). 'H-NMR (tabuľka 1) spektrum zaznamenané v DMSO-d6 odhalilo tri metylové skupiny (dH 0,62, 0,87, 0,98) a dva vymeniteľné protónové signály (dH 10,36 a 8,29). Okrem toho tri ortos spojené aromatické signály (dH 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz a 7,18 J 7,3 Hz) indikovali 1,2,3-trisubstituovaný benzénový kruh. Metylénové protóny (d H 3,23) spojené s olefínovým protónom (d H 5,27) spolu s dvoma vinylovými metylmi (d H 1,67 a 1,70) indikovali prítomnosť 3-metyl-2-butenylovej skupiny v 1. Jednoväzbové konektivity týchto protónov a ďalších 14 metínových a/alebo metylénových protónov boli stanovené experimentom HMQC. 13C-NMR a DEPT spektrá (tabuľka 1), ktoré odhalili 28 signálov, tiež potvrdili prítomnosť týchto dvoch fragmentov [trisubstituovaný benzénový kruh (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC a 140,4 QC) a {140,4 QC) {79}}metyl-2-butenyl (dC28CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 a 17,7 CH3)]; okrem toho dva karbonyly (dC 183,1 a 172,3), štyri sp3 kvartérne uhlíky (dC 46,5, 58,7, 60,4 a 62,3), dva sp3 metíny (dC 46,1 a 58,7) a šesť sp3 metylénov (dC 31,8,7, dC 31,8,7 35,2, 39,9 a 64,9). Pretože bolo zahrnutých 6 z 12 nenasýtení, usúdilo sa, že 1 obsahuje šesť kruhov. Ďalšie vyhodnotenie týchto spektrálnych údajov spolu s výsledkami 1H-1H COSY a HMBC odhalilo, že 1 úzko súvisí s marcfortínovou skupinou metabolitov húb [7]. Interpretácia HMBC korelácií (obr. 2) naznačila prítomnosť parciálnej štruktúry A (HMBC korelácie 1-NH k C-8 a C-9; H-6 k C{{ 136}}; H-5 na C{138}} a C{139}}; H-26 na C{141}} a C{142}} a H{143 }} až C-29 a C-30) a B (HMBC korelácie H-10 až C-3, C{148}}, C-21, C{150}}, C{151}}; H{152}} až C{153}}, C{154}}, C{155}}, C{156}} a { {157}}NH až C-13, C-10) a C, šesťčlenný kruh G [8] s metylovaným uhlíkom na C-17 (HMBC korelácie H{{ 163}} až C-17, C{165}}). Konektivita subštruktúry A až B až C-3 bola podporená kľúčovými koreláciami HMBC od H-4 a 1-NH po C-3; H{170}} až C-2 a C{172}}. Spojenie medzi štruktúrou B a C s atómom dusíka bolo odvodené kľúčovými HMBC koreláciami z H-12 do C-17 a C-13 a porovnaním ich zodpovedajúcich chemických posunov C{{176 }} a C-17 (dC 64,9 a 58,7). Vyššie uvedená analýza ukázala, že 1 má podobnú štruktúru ako marcfortín A s výnimkou rozdielov v bočnom reťazci na benzénovom kruhu a metyle na C-17 šesťčlenného kruhu G. Takže hrubá štruktúra 1 bola priradená tak, ako je znázornené na obr

Relatívna stereochémia 1 bola objasnená na základe údajov NOESY (obr. 3). Predchádzajúce štúdie ukázali, že zlúčeniny typu 2-oxindolových alkaloidov prijali konformáciu, v ktorej je centrálny päťčlenný kruh ortogonálny k rovine oxindolovej podjednotky [9].

image

NOESY korelácie medzi H{{0}} a H-10a, H-25 a medzi 19-NH a H-10a naznačovali, že obe boli na prednej strane cyklopentanónového kruhu, ktorý ich orientuje smerom k H-4, fixujúc relatívnu stereochémiu na C-3, ako je znázornené. NOESY interakcie medzi H-21, H{8}}a, H-10b, H-23 a H-24 umiestnili zodpovedajúce substituenty spolu na prednú stranu cyklopentanónový kruh. Relatívna stereochémia navrhovaná pre 1 je v súlade s relevantnými znakmi relatívnej stereochémie marcfortínu A [7]. Cottonov efekt pri 200-250 nm vzniká z np* prechodu diketopiperazínových amidových väzieb, ktorý je diagnostický pre bicyklo-[2.2.2]diazaoktándiketopiperazínové jadro [10, 11]. CD spektrum 1 (obr. 4) korelovalo s relevantnými oblasťami spektra -brevianamidu A [11]. Takže absolútna stereochémia 1 by mala byť 3S, 11S, 13S, 17S, 21R a dostala názov chrysogenamid A. Predbežné vyhodnotenie ochranného účinku chrysogenamidu A na neurocyty bolo hodnotené pomocou bunkovej smrti vyvolanej oxidačným stresom v SH-SY5Y buniek pomocou MTT testu. Aktivita chrysogenamidu A zachytávajúca voľné radikály bola najprv skúmaná s použitím DPPH ako darcu voľných radikálov. Na rozdiel od vitamínu C (IC50: 29,0 mM), chrysogenamid A nevykazoval žiadnu schopnosť (IC50 väčšia alebo rovná 100 mM) vychytávať DPPH voľné radikály v koncentrácii do 100 mM. Medzitým sme testovali, či chrysogenamid A chráni bunky pred bunkovou smrťou vyvolanou oxidačným stresom v ľudskom neuroblastóme SH-SY5Y

bunky. Oxidačný stres peroxidom vodíka viedol k zníženiu životaschopnosti buniek o 43 percent v porovnaní s kontrolnou skupinou. Chrysogenamid A inhiboval bunkovú smrť vyvolanú peroxidom vodíka zlepšením životaschopnosti buniek o 59,6 percent pri koncentrácii 1*10-4 mM. Tieto údaje naznačujú, že chrysogénamid A vykazoval ochranný účinok neurocytov proti bunkovej smrti vyvolanej oxidačným stresom, nie prostredníctvom svojej antioxidačnej aktivity. Indolové alkaloidy s neobvyklým bicyklo [2.2.2] diazaoktánovým kruhovým systémom boli izolované z rôznych rodov húb, ako sú Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16] a Malbranchea [17]. 1 bol novým členom tejto skupiny zlúčenín, mal kostru, o ktorej sa očakáva, že bude medziproduktom v biosyntéze citrínových adminov A a B, ktoré boli v roku 2005 ohlásené ako nová trieda pentacyklických spiroín dolinónových alkaloidov [18]. Zo štrukturálneho hľadiska je dôležité zdôrazniť, že 1 je jedinečná štruktúra s metyláciou v polohe C-17 a oxindolovou skupinou 2- s izoprénovou jednotkou v C-7. Niektoré z týchto doteraz izolovaných indolových alkaloidov vykazujú silnú antiparazitickú aktivitu [19], inhibíciu ľudských nádorových buniek [13] a cytotoxicitu [10]. Podľa našich najlepších vedomostí je to prvá správa o neuroprotekcii tohto typu alkaloidov.

PoďakovanieTáto práca bola finančne podporená Čínskym národným prírodným vedeckým fondom (č. 30472136).

Prevent Alzheimer's disease

neuroprotektívum cistanche deserticola: anti-Alzheimerova choroba

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

Referencie

  1. Li LL, Wang XW, Wang XF. Antilipidová peroxidácia a antiradiačné pôsobenie glykozidov vherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364 – 367 (1997)

  2. Xie JH, Wu CF. Účinok etanolového extraktu zCistanche deserticolana obsah monoamínových neurotransmiterov v mozgu potkanov. Chin Trad Herb Drugs 24: 417 – 419 (1993)

  3. Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, nový alkaloid z huby Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Obr. 2 Kľúčové HMBC a 1 H-1 H COZY korelácie 1. Obr. 3 NOESYs 1. Obr. 4 CD spektrum 1.(2001)

  4. Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiotiká v chemickej komunikácii húb. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)

  5. Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Izolácia a objasnenie štruktúry troch metabolitov z Verticillium intertextum: sorbicilín, dihydrosorbicilín a bisvertinochinol. Tetrahedron 39: 4243 – 4256 (1983)

  6. Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glykolipidy z Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213-1215 (1997)

  7. Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Izolácia a štruktúra (röntgenová analýza) marcfortínu A, nového alkaloidu z Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601-602 (1980)

  8. Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Mikrobiologická hydroxylácia na šiestich jednotlivých atómoch uhlíka marcfortínu A. J Nat Prod 60: 1139-1142 (1997)

  9. Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sklerotiamid: Nový člen triedy paraherquamidov so silným antiinsektanovým účinkom zo sklerócií Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093-1095 (1996)

  10. Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamidy AD: prenylované indolové alkaloidy izolované z morskej huby, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254 – 2256 (2007)

  11. Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Pozoruhodná, enantio-divergentná biogenéza brevianamidu A a B. J Am Chem Soc 111: 3064-3065 (1989)

  12. Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Nové antihelmintické metabolity z druhu Aspergillus: aspergilimidy. J Antibiot 50: 840-846 (1997)

  13. Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)

  14. Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Výroba, izolácia a predbežné štúdie toxicity brevianamidu A z kultúr Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633-635 (1973)

  15. Birch AJ, Russell RA. Štúdie vo vzťahu k biosyntéze XLIV. Štrukturálne objasnenia brevianamidov B, C, D a F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)

  16. Liesch JM, Wichmann CF. Nové antinematodálne a antiparazitické látky z Penicillium Charles. II. Určenie štruktúry paraherquamidov B, C, D, E, F a G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamid, nový inhibítor kalmodulínu z huby Malbranchea aurantiaca. Tetrahedron 62: 1817 – 1822 (2006)

  17. Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolute stereochemistry of citrinadins A and B from a marine-derived fungus. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)

  18. Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Insekticídna aktivita paraherquamidov, paraherquamidov, vrátane paraherquamidu H a paraherquamidu I, dva nové alkaloidy izolované z Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921 – 2925 (2006)

neuroprotective of cistanche deserticola: anti-Alzheimer's disease

neuroprotektívum cistanche deserticola: anti-Alzheimerova choroba a Parkinsonova choroba


nie
Tiež sa vám môže páčiť