Ako študovať genetickú diverzitu Herba Cistanches?
Mar 14, 2022
Štúdia o genetickej diverzite Herba Cistanches od RAPD
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(Inštitút čínskej Materia Medica, Čínska akadémia čínskej medicíny, Peking 100700)
Abstraktné
Účel:Na štúdium populáciegenetická diverzitazCistanche deserticolaaCistanche tubulosa.
Metódy:Dve voľne žijúce populácieCistanche deserticolaa štyri voľne žijúce populácieCistanche tubulosaboli analyzované pomocou RAPD agenetická diverzitapopulácií bol analyzovaný softvérom verzie 1.31 POPGENE.
Výsledky:Priemerné percento polymorfných lokusovCistanche deserticolabola 47,37 percenta, polymorfné lokusy týchto dvoch populácií boli 39,47 percenta a 35,53 percenta a priemerná Neiho génová diverzita bola 0.135 8. Shannonova bola viac. Index stavových informácií je 0.207 2 a koeficient génovej diferenciácie Gst {{1{{20}}}}.254 6. Priemerné percento polymorfných lokusov v Cistanche bolo 27,59 percenta a percento polymorfných lokusov v každej populácii sa pohybovalo od 19,54 percenta do 25,29 percenta, z ktorých populácia Andier mala najvyšších 25,29 percent a priemerná Neiho génová diverzita bola 0. { {21}}, Shannonov informačný index polymorfizmu je 0,1258, koeficient génovej diferenciácie Gst =0.175 5.
Záver:Cistanche deserticolaaCistanche tubulosamajú medzi populáciami určitú diferenciáciu. Thegenetická diverzitaDesert Cistanche je výrazne vyššia ako u Cistanche tubulosa a rozdelila sa na dva ekotypy.
Kľúčové slová: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetická diverzita
[Klasifikačné číslo čínskej knižnice] S 567 [Identifikačný kód dokumentu] A [Číslo článku] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche je parazitická rastlina patriaca do rodu Cistanche z čeľade Lidanaceae, známa aj ako Dayun, čo je vzácny čínsky liečivý materiál. Hlavnými zdrojmi rastlín Cistanche deserticola v mojej krajine súCistanche deserticolaYCMa a C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Hostiteľskými rastlinami Cistanche deserticola sú Haloxylon ammodendron a Haloxylon ammodendron, ktoré sú distribuované hlavne v Alashan League vo Vnútornom Mongolsku, severnom Sin-ťiangu, Qinghai, Gansu a na iných miestach. Rozšírenie Cistanche deserticola je rovnaké ako v prípade hostiteľských rastlín. V mojej krajine sa Cistanche cistanche distribuuje iba v okresoch okolo púšte Taklimakan južne od pohoria Tianshan v Sin-ťiangu a jeho distribúcia nie je úplne synchronizovaná s hostiteľom Tamarix. Iné regióny ako severný Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Vnútorné Mongolsko, Shaanxi a ďalšie miesta výskytu rastlín Tamarix nie sú parazitické Cistanche Tubula[2]. V dôsledku rýchleho nárastu dopytu po cistanche v posledných rokoch, ktorý viedol k vyhynutiu jeho zdrojov, sa zdroje divokých cistanche zmenšili len na niekoľko hlavných produkčných oblastí. Obidva boli v mojej krajine uvedené ako ohrozené chránené druhy rastlín [3], medzi nimi ajCistanche deserticolabol zaradený do prílohy II CITES [4].
Po niekoľkoročnom výskume bol výskum umelého odchovu cistanche úspešný a je v štádiu rozsiahlej propagácie a výsadby. Ako však zabrániť úbytku druhov Cistanche počas priemyselnej výroby, ako čo najskôr obnoviť obmedzenú divokú populáciu a zachovať vzácne zdroje divokej zárodočnej plazmy, sú kľúčom k dosiahnutiu jej trvalo udržateľného využívania. Čo sa týka chráneného dedičstva Cistanche [Dátum prijatia], 2004-03-11 [Projekt fondu] Projekt sociálnej starostlivosti Ministerstva vedy a techniky (2001.109); Projekt Ministerstva vedy a techniky „Desaty päťročný plán“ (2001BA701A09a) [Korektívny autor] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Štúdium prenosu stále prebieha prázdna. Táto štúdia využíva technológiu RAPD na štúdium 2 divokých populáciíCistanche deserticolaa 4 voľne žijúce populácieCistanche tubulosa, a analyzovať oba Rozdiel vgenetická diverzitaOčakáva sa, že poskytne dôležitý experimentálny genetický základ na ochranu Cistanche, vzácneho čínskeho lieku.
1. Materiál a metódy
1.1 Materiály
Cistanche deserticolabol zozbieraný z okresu Jimsar v Sin-ťiangu a oblasti Jilantai zo starodávnej ligy Alxa vo Vnútornom Mongolsku. Populácie Cistanche boli zozbierané z okresov Minfeng a okresu Yutian, Xinjiang. Okres Minfeng je v súčasnosti oblasťou s najväčším výnosom cistanche cistanche, s najvyššou hustotou a relatívne úplnými spoločenstvami prirodzených lesov. Vzorkovacie miesta Andil, Sawuzek, Yatongguz a Daheyan v okrese Yutian sú hlavné výrobné oblasti, ktoré sa nachádzajú v rieke Andir, rieke Yeyike, rieke Yatongguzi a Kelaniya V dolnom toku rieky je vzdialenosť medzi populáciami väčšia ako 50 km. Každá populácia náhodne vybrala 19-30 jedincov. Vzorky boli rýchlo vysušené v silikagéli a použité na extrakciu DNA (tabuľka 1).
Tabuľka 1 Vzorkované populácie a produkčné oblasti Cistanche deserticola a Cistanche tubulosa
1.2 Extrakcia DNA
Metóda celkovej extrakcie DNA využíva metódu s vysokým obsahom soli a nízkym pH [5]. Vzorka DNA sa podrobila spektrofotometru na detekciu koncentrácie templátu DNA, potom sa na analýzu RAPD použila elektroforéza na 1 percentnom agarózovom géli, farbenie EB, pozorovanie a fotografovanie pod ultrafialovým svetlom, elektroforéza DNA s čírymi pásmi a menej chvostov.
1.3 Skríning RAPD primerov
Keďže experiment zistil, že rovnaký primér má neuspokojivý účinok na súčasnú amplifikáciu obochCistanche deserticolaa Cistanche tubulosa boli priméry testované nezávisle. Na amplifikáciu a skríning sa použilo 150 náhodných primérov (10 bp), 25 ul reakčného systému Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.; každý primér použil 2 populačné templáty a 1 sterilizovanú dvakrát destilovanú vodu ako slepú kontrolu a získal 10 primérov na amplifikáciu Cistanche deserticola s jasnými pásmi, silným polymorfizmom a dobrou opakovateľnosťou: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S{10}}, S{11}}, S{12}}, S{13}}, S{14}}, S{15 }}; 10 primérov zCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR amplifikácia a detekcia produktu
Vybrané priméry sa použili na amplifikáciu templátovej DNACistanche deserticolaaCistanche tubulosapomocou PCR. Genómová DNA bola nariedená na 50 ng·μl -1 podľa nameranej koncentrácie ako šablóny. Celkový reakčný objem je 25 μl, z toho 10 × pufer PCR 2,5 μl, Mg2 plus 1,5 μl, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μl, zmes dNTP (každá 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, templátová DNA 1 μL, sterilizovaná dvakrát destilovaná voda 18,8 μL, vyššie uvedený PCR amplifikačný roztok je produktom Shanghai Sangon. Amplifikácia sa uskutočnila na tepelnom cykléri PTC{22}}. Amplifikačný program bol 94 stupňová preddenaturácia počas 5 minút a potom 40 cyklov. Každý cyklus zahŕňal 94 stupňov 45 s, 34 stupňov 1 min, 72 stupňov 1 min 30 s a nakoniec Extend pri 72 stupňoch na 5 minút. Amplifikované produkty boli podrobené elektroforéze na 2,0 percentnom agarózovom géli (obsahujúcom EB) v 1 x TAE pufri a pozorované a fotografované pomocou gélového zobrazovacieho systému SYNGENE.
1.5 Štatistika a analýza údajov
V spektre elektroforézy sa porovnáva zodpovedajúca poloha reakčného produktu na géli podľa štandardu molekulovej hmotnosti a odhaduje sa molekulová hmotnosť amplifikovaného produktu. Pás s pásom sa zaznamená ako 1 a pás bez pásma sa zaznamená ako 0, čím sa vytvorí maticový graf 0/1 a vloží sa do počítača pomocou POPGENE32 na výpočet percenta polymorfných miest (PPL) každej populácie, Neiov index génovej diverzity (H), Shannonov informačný index polymorfizmu (I), koeficient génovej diferenciácie (Gst), génová diverzita (Ht),Genetická diverzita(Hs), Neiho (1978) genetická identita (I) a genetická vzdialenosť (D) v rámci populácie a zhluková analýza sa uskutočnila pomocou metódy UPGMA.
2. Výsledky a analýza
2.1 Genetická diverzita Cistanche
Všetky vzorky získali pásy s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí od 200 do 2 200 bp (obrázok 1, 2). Celkovo bolo zistených 76 lokusov v 60 vzorkách z 2 populáciíCistanche deserticola, z ktorých 36 bolo polymorfných lokusov, čo predstavuje 47,37 percenta , H=0.135 8, I=0.207 2. Spomedzi nich je PPL Jimsara 39,47 percenta a Gilantyho 35,53 percenta. H je 0. 0 95 3 a 0.1 070 a ja je 0.15 12 a 0.163 7 v tomto poradí. Celkovo bolo zistených 87 lokusov u {{20}} jedincov zo 4 populácií Cistanche, z ktorých 24 bolo polymorfných lokusov, čo predstavuje 27,59 percenta , H=0.084 8, Ja=0.1278. Najvyšší PPL bol Andil na úrovni 25,29 percenta, zatiaľ čo PPL bol nižší v Savuzeku a Yatungusi (obe na 19,54 percenta). H je 0.062 1 -0.080 0, I je 0.095 0 -0.116. Veľkosť H a I je v súlade s trendom veľkosti PPL každej populácie a koeficienty sú najväčšie v Andierovi, po ktorom nasleduje Dayan. V prípade rovnakého PPL je Savuzekovo H=0.{40}} Súčet I=0.097 0 je o niečo vyšší ako 0.{44 }} a 0.{46}} z Yatunguska (tabuľka 2).
Obrázok 1 RAPD zosilnené pásy niektorých vzoriek púšteCistanche deserticola, základný náter S490 1-10. Garantie vzorky; 11-20. Jimpster vzorky M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)
Obrázok 2 RAPD amplifikované pásy niektorých vzoriek Cistanche Tubulosa, primer S2 042 1-20. Vzorka M-DNA markera Xinjiang Andier (200 - 2 000 bp)
Tabuľka 2genetická diverzitazCistanche deserticolaaCistanche tubulosapopulácií
2.2 Analýza genetických variácií Cistanche
Podľa úrovnegenetická diverzitav populáciách (Hs), diferenciácii medzi populáciami (Dst) a podiele genetických rozdielov medzi populáciami na celkových genetických rozdieloch (Gst), je možné vidieť, že celková genetická diverzita Cistanche deserticola Ht=0.{{{{101} 1}}, kde Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, z toho Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabuľka 3). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že medzi populáciami existuje určitý stupeň genetických variácií. Variácia medzi púštnymi populáciami Cistanche deserticola predstavovala 25,46 percenta celkovej variácie a variácia populácií Cistanche tubulosa predstavovala 17,55 percenta celkovej variácie.
Tabuľka 3 Analýza genetických variáciíCistanche deserticolaaCistanche tubulosa.
2.3 Genetická vzdialenosť a zhluková analýza medzi populáciami Cistanche deserticola
Genetická vzdialenosť dvoch populáciíCistanche deserticolaje {{0}}.080 0 a genetická identita je 0.9231. Genetická vzdialenosť štyroch populácií Cistanche bola 0.012 0-0.031 5 a genetická identita bola 0.9690-0.988 1 (Tabuľka 4) . Zhlukovanie jedincov Cistanche deserticola a cistanche tubulosa ukazuje, že Cistanche deserticola možno zoskupiť do dvoch odlišných skupín podľa populácie, zatiaľ čo rôzne jedince cistanche tubulosa nemožno zoskupiť podľa populácie, čo tiež naznačuje, že genetická diferenciácia medzi Cistanche deserticola populácií je pomerne vysoký. Veľká, ale genetická diferenciácia medzi populáciami Cistanche tubulosa je malá.
Tabuľka 4 Genetická identita (vľavo dole) a genetická vzdialenosť (vpravo hore).cistanche tubulosa.
3. Diskusia
3.1 Genetická diverzita Cistanche
Úroveňgenetická diverzitarastlín je neoddeliteľná od ich biologických vlastností, biotopov, pôvodu a vývoja. Medzi nimi má najväčší vplyv systém šľachtenia, rozsah distribúcie, forma života a metódy šírenia peľu a semien [6]. Podľa štatistických výsledkov údajov o alozýmoch 499 druhov rastlín v 165 rodoch od Ge Song et al. [7], polymorfizmus Cistanche na úrovni druhu by mal byť približne 50 percent a polymorfizmus na úrovni populácie by mal byť približne 40 percent . Okolo 0,17. Úrovne polymorfizmu získané v tomto experimente sú všetky nižšie ako tieto priemerné hodnoty. Zároveň v porovnaní s hladinami polymorfných lokusov získaných metódami RAPD pre niekoľko bežných ohrozených rastlín, ako je 32 percent ohrozeného druhu jedľa strieborná[18], 22,5 percenta trpasličej pivonky a 27,6 percenta pivonky purpurovej [9] ] Je vidieť, že genetická diverzita oCistanche deserticola je o niečo nižšia ako priemerná úroveň, zatiaľ čo genetická diverzita Cistanche tubulosa je už extrémne nízka.
3.2 Dôvody nízkej genetickej diverzity Cistanche
Cistanche je špecifická parazitická rastlina, rozšírená súčasne v úzkych púštnych oblastiach. Preto jedinečný životný štýl a relatívne úzka obytná plocha môžu byť neodmysliteľným dôvodom, prečogenetická diverzitaCistanche je vo všeobecnosti nižšia ako u bežných rastlín.
Rozdiel vgenetická diverzitamedzi Cistanche deserticola a Cistanche tubulosa môže súvisieť s rozdielom v distribučnom rozsahu týchto dvoch a či sú synchronizované s distribúciou hostiteľa. Oblasť rozšírenia Cistanche tubulosa je výrazne menšia ako oblasť Cistanche deserticola a jej distribúcia je extrémne nesynchronizovaná s hostiteľskou rastlinou. Štúdie ukázali, že medzi druhmi Tamarix je veľká rozmanitosť. Napríklad Zhang Juan a kol. uviedli, že genetická diverzita Tamarix sibiricus bola až 98,7 percenta [10], zatiaľ čo genetická diverzita Cistanche je extrémne nízka, čo naznačuje dlhodobý vývoj. Cistanche tubulosa mohla mať v histórii vážne prekážky, ktoré viedli k strate veľkého množstvagenetická diverzita.
Zároveň sa podľa šetrení zistilo, že žiadny z nichCistanche deserticolado 20 km od ľudských sídiel bolo možné objaviť a normálne rozkvitnúť. Veľké a malé jamy Cistanche boli vyhĺbené, najmä v hlavných výrobných oblastiach kvetu Cistanche. Preto to bolo spôsobené veľkým množstvom výkopov. Nedostatok pôvodu a ničenie biotopov môžu byť hlavnými príčinami nízkej úrovne spôsobenými človekomgenetická diverzitaz Cistanche.
3.3 Genetická diferenciácia Cistanche
Vzhľadom na geografickú vzdialenosť medzi Xinjiangom a Vnútorným Mongolskom spôsobila geografická izolácia diferenciáciu a izoláciu medziCistanche deserticolapopulácií a tieto dve populácie vytvorili odlišné geneticky odlišné ekotypy v dôsledku ich prispôsobenia sa miestnym podmienkam biotopu. Kvôli úzkemu rozsahu distribúcie a častým výmenám génov medzi populáciami je genetická diferenciácia medzi populáciami menšia ako u Cistanche deserticola.
3.4 Odporúčania na ochranu Cistanche
Genetická diverzitaje predpokladom pre dlhodobé prežitie druhov, aby nedošlo k vyhynutiu. Zníženiegenetická diverzitazníži schopnosť populácie prispôsobiť sa zmenám životného prostredia v krátkodobom aj dlhodobom horizonte [11]. Preto je ochrana genetickej diverzity Cistanche veľmi dôležitá pre ochranu tejto vzácnej a vzácnej čínskej medicíny. Keďže Cistanche je druh so špeciálnym ekologickým typom, mal by byť chránený najmä in situ a základňa prirodzenej ochrany Cistanche by mala byť vytvorená podľa jeho genetickej diverzity. Napríklad preCistanche tubulosaPretože genetická diverzita pochádza hlavne z populácie, budú prioritnými objektmi ochrany populácie s veľkou genetickou diverzitou [12], ako je Minfeng's Angier a Yutian's Daheyan. Je uvedený ako prirodzená základňa ochrany pre Cistanche. Čo sa týkaCistanche deserticola, populácie Vnútorného Mongolska a Sin-ťiangu prešli významnými zmenami, takže experimentálny výskum by sa mal ďalej posilniť, aby sa určili populácie, ktoré sú prioritne chránené. Zároveň realizovať základný výskum reprodukčnej biológie a opeľovacej ekológie Cistanche s cieľom poskytnúť informácie pre jej ďalšiu ochranu.
Referencie
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei a kol. IdentifikáciaCistanchea skúmanie komerčných liečivých materiálov. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.
[2] Liu Mingting. Komplexný výskum a všeobecná aplikácia rastlín Tamarix. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] Fu Guoli. Červená kniha čínskych rastlín. Peking: Science Press, 1992.
[4] Riadiaci úrad pre dovoz a vývoz ohrozených druhov v Čínskej ľudovej republike, Vedecký výbor pre ohrozené druhy v Čínskej ľudovej republike. Dohovor o medzinárodnom obchode s ohrozenými druhmi voľne žijúcich živočíchov a rastlín (CITES), príloha II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding a kol. Extrakcia a identifikácia celkovej DNA niekoľkých ohrozených rastlín a ich príbuzných. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Šľachtiteľský systém rastlín, genetická štruktúra a ochranagenetická diverzita. Biodiverzita, 1996, 4 (2): 92.
[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Evolučná biológia rastlín. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming a kol. RAPD analýza genetickej diverzity striebornej jedle. Čínska veda (C), 1997, 40 (2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen a kol. Predbežná správa o analýze RAPD trpasličej pivónie a fialovej pivonky. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.
[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Predbežná štúdia oGenetická diverzitaprirodzených populácií Tamarix kopijovitých. Yunnan Botanical Research, 2003, 25 (5): 557.
[11] Ellstrand NC, Elam D R. Dôsledky populačnej genetiky malej veľkosti populácie: Dôsledky pre ochranu rastlín. Výročná revue Ekológia a systematika, 1993, 34:217.
[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Princíp populačnej genetiky a jej uplatnenie pri ochrane vzácnych a ohrozených rastlín. Biodiverzita, 1999, 7 (4): 340.
Od: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, číslo 8 august 2004
