Cistanche môže chrániť ischémiu a reperfúziu obličiek

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jan H. Lindeman1, Leonie G. Wijermars1, Sarantos Kostidis2, Oleg A. Mayboroda2, Amy C. Harms3 a kol.

Oneskorená funkcia štepu jeprejav ischemického reperfúzneho poškodeniav súvislosti s transplantáciou obličky. Kým stovky zásahovúspešne redukovať ischemické reperfúzne poškodeniev experimentálnych modeloch všetky klinické intervencie zlyhali. Toto exploratívne klinické hodnotenie skúmalo možný metabolický pôvod klinického ischemického reperfúzneho poškodenia kombinovaním údajov z 18 predreperfúznych a postreperfúznych biopsií tkaniva s 36 sekvenčnými odbermi arteriovenóznej krvi zo štepu v troch študijných skupinách. Tieto skupiny zahŕňali štepy od žijúcich a mŕtvych darcov s oneskorenou funkciou štepu a bez nej. Rozdelenie do skupín bolo založené na klinických výsledkoch. Na analýzu tkaniva sa použila NMR magického uhla a na analýzu plazmy sa použili platformy založené na hmotnostnej spektrometrii. Všetkyobličkyboli funkčné jeden rok. Integrácia metabolomických údajov identifikovala diskriminačný profil na rozpoznanie budúcej oneskorenej funkcie štepu. Tento profil bol charakterizovaný postreperfúznym katabolizmom ATP/GTP (výrazne narušená regenerácia fosfokreatínu a signifikantne pretrvávajúca produkcia (hypo)xantínu) a významným pretrvávajúcim poškodením tkaniva. Neúspešná regenerácia vysokoenergetického fosfátu sa vyskytla napriek aktivovanej glykolýze, oxidácii mastných kyselín, glutaminolýze a autofágii a súvisela s defektom na úrovni komplexu oxoglutarátdehydrogenázy v Krebsovom cykle. Klinické oneskorenie funkcie štepu v dôsledku ischemického reperfúzneho poškodenia spojeného s postreperfúznym metabolickým kolapsom. Úsilie o uhasenie oneskorenej funkcie štepu v dôsledku ischemického reperfúzneho poškodenia by sa teda malo zamerať na zachovanie metabolickej kompetencie, a to buď zachovaním integrity Krebsovho cyklu a/alebo náborom metabolických záchranných dráh. Kidney International (2020) 98, 1476 – 1488; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.07.026

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: ATP; oneskorená funkcia štepu; glykolýza; ischemické reperfúzne poškodenie; metabolizmus; Oxidačná fosforylácia

cistanche účinky: zabrániťischemicko-reperfúzne poškodenie

ischemické reperfúzne poškodenie (IRI)je fenomén zvýšeného poškodenia tkaniva po reperfúzii predtým ischemického tkaniva.1,2 Je hlavným prispievateľom k poškodeniu orgánov po infarkte myokardu alebo mozgu3 a poškodeniu štepu po transplantácii orgánov.4 Hoci nespočetné množstvo intervencií utlmuje IRI v predklinických modeloch, klinický úspech zostáva 3,4 Zdá sa teda, že medzi predklinickými modelmi a klinickým kontextom existuje translačná priepasť.

Oneskorená funkcia štepu (DGF) je prejavom IRI pri vznikuobličkytransplantácia.5 DGF je definovaný ako potreba dialýzy v prvom týždni alebo týždňoch po transplantácii.6 Hoci je DGF v kontexte transplantátov od žijúcich darcov extrémne zriedkavý, postihuje až 90 percent transplantácií transplantátov od mŕtveho darcu.6 ​​Predchádzajúce práca preukázala súvislosť medzi incidentom DGF a postreperfúznou normoxickou glykolýzou.7 Z tohto pozorovania vyplýva, že DGF súvisí s defektom energetickej homeostázy štepu v dôsledku mitochondriálnej dysfunkcie v reperfúznej fáze.7 Na základe toho sme predpokladali, že klinická DGF zahŕňa a môže byť spôsobená metabolickým defektom (alebo defektmi). Cieľom tejto štúdie bolo vykonať hĺbkovú analýzu metabolických reakcií naischémia-reperfúzias a bez IRI (DGF). Toto exploratívne metabolické hodnotenie je založené na integrovanom časovom prístupe, ktorý zahŕňal postupné hodnotenie rozdielov v arteriovenóznej koncentrácii (AV) oproti reperfundovaným štepom a paralelné profilovanie biopsií štepov (tkaniv). Boli zahrnuté tri študijné skupiny: štepy zo štepov od mŕtvych darcov s neskoršou IRI a bez nej a štepy od žijúcich darcov. Skupinová alokácia štepov od mŕtvych darcov (þDGF a –DGF, v uvedenom poradí) sa uskutočnila retrospektívne na základe ich klinického výsledku. Štepy od žijúcich darcov boli zahrnuté ako referencia, pretože tieto štepy sú spojené s okamžitým funkčným zotavením po reperfúzii. Na pokrytie primárnych aspektov metabolickej homeostázy sa táto štúdia zamerala na nasledujúce hrubé metabolické zhluky: metabolizmus nukleotidtrifosfátu, oxidácia mastných kyselín (b), glykolýza/glutaminolýza, autofágia, Krebsov cyklus (defekty) a poškodenie buniek. Údaje sú prezentované zodpovedajúcim spôsobom.

(Kešpondencia: Jan H. Lindeman, oddelenie chirurgie, Leiden University Medical Center, PO Box 9600, 2300 RC Leiden, Holandsko. E-mail: Lindeman@lumc.nl Prijaté 20. januára 2020; revidované 8. júna 2020; prijaté 2. júla 2020; zverejnené online 8. augusta 2020)

cistanche účinky: zabrániťischemicko-reperfúzne poškodenie

VÝSLEDKY

Vzorka štúdie zahŕňala 53 pacientov. Párové tkanivové biopsie sa získali od 18 pacientov a sekvenčný AV odber sa uskutočnil u 36 pacientov. Jednému pacientovi sa odobrali obe biopsie a podstúpil AV odber. Klinické podrobnosti pre 3 študijné skupiny sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1A (biopsie tkaniva) a S1B (AV odber vzoriek). Všetky prípady DGF vyžadovali viacnásobné dialýzy v časovom priebehu aspoň 7 dní a všetky vykazovali adekvátne funkčné zotavenie. Žiadny zo zosnulých darcov bez DGF nevyžadoval po transplantácii dialýzu. Jednoročné prežitie štepu bolo 100 percent.

Najprv sme skúmali domnelé rozdiely v metabolických podpisoch pre 3 skupiny darcov (štepy od žijúcich [referenčných] darcov, štepy od mŕtvych darcov –DGF a štepy od mŕtvych darcov þDGF [IRI]) mapovaním plazmatického metabolómu (AV rozdiely) pre { {1}}minúty po reperfúznom časovom bode (obrázok 1a) atkanivový metabolóm(biopsie tkaniva) počas 40-minút po reperfúznom časovom bode (obrázok 1b). Tieto časové body boli zvolené tak, aby sa zabránilo interferencii z vymývania metabolitov, ktoré sa nahromadili počas ischémie alebo chladenia, alebo ktoré boli zložkami konzervačnej tekutiny (napr. vymývanie histidínu zo živých darcovských štepov; doplnkový obrázok S1 ukazuje selektívne použitie H [histidín] TK konzervačná tekutina v týchto štepoch.7 Výsledky (z-skóre) pre tieto časové body sú zhrnuté v tepelných mapách na obrázku 1a (AV rozdiely) a 1b (tkanivo). Zoskupenie údajov sa uskutočnilo podľa 6 zhlukov, ktoré pokrývajú všetky metabolické údaje: (i) katabolizmus nukleozidtrifosfátu, (ii) b-oxidácia, (iii) glykolýza/glutaminolýza, (iv) autofágia, (v) defekty Krebsovho cyklu, a (vi) poškodenie buniek.

Tepelné mapy pre AV rozdiely naznačujú paralelné metabolické podpisy pre živého darcu a štepy –DGF a jasne charakteristický podpis pre štepy þDGF (obrázok 1a). Podobný, aj keď menej výrazný vzor bol pozorovaný pre tkanivové metabolity (obrázok 1b). Exkluzívne mapovanie štepov –DGF a þDGF (bez štepu od živého darcu) viedlo k podobným záverom (nie sú znázornené), čo naznačuje, že zahrnutie (referenčných) údajov od živého darcu do analýzy neinterferovalo so závermi analýzy. Súhrnne údaje poskytujú hrubý metabolický podpis pre renálnu IRI.

Kvôli prehľadnosti sú údaje o jednotlivých metabolitoch prezentované ako 6 metabolických zhlukov. Aby sa zabránilo interferencii z počiatočného vymývania metabolitov, ktoré sa nahromadili počas chladenia počas prvých minút reperfúzie, odhady čistého uvoľnenia alebo príjmu po perfúzii sú založené na integrácii AV rozdielov pre 10-až {{3 }}minútové časové intervaly po reperfúzii (oblasť medzi krivkami).

Prvý zhluk metabolitov ("nukleozidtrifosfátový katabolizmus") signalizuje apretrvávajúca postreperfúziametabolická nekompetentnosť („power shutdown“) u štepov s neskorším DGF (þDGF). Tento záver je založený na zhoršenej postreperfúznej obnove vysokoenergetického fosfátového pufra fosfokreatínu v þDGF štepoch (P < 0.001;="" obrázok="" 2a)="" a="" na="" pretrvávajúcom="" post="" -reperfúzny="" katabolizmus="" adenozíntrifosfát/guanozíntrifosfát="" (atp/gtp).="" posledné="" uvedené="" sa="" odráža="" v="" pokračujúcom="" uvoľňovaní="" (av="" rozdiely)="" hypoxantínu="" a="" xantínu="" (obrázok="" 2b="" a="" c,="" p="">< 0,0001="" a="" 0,02),="" terminálnych="" degradačných="" produktov="" atp="" a="" gtp="" z="" týchto="" štepov.="" údaje="" pre="" biopsie="" tkaniva="" pred="" reperfúziou="" ukázali="" odstupňované="" stupne="" akumulácie="" inozínu="" a="" hypoxantínu="" na="" konci="" obdobia="" ischemického="" skladovania,="" s="" najnižším="" obsahom="" zisteným="" u="" živých="" a="" najvyšším="" u="" štepov="" od="" mŕtvych="" darcov="" (obrázok="" 2d="" a="" e).="" obsah="" tkaniva="" po="" reperfúzii="" (t="" ¼="" 40="" min)="" hypoxantínu="" a="" inozínu="" bol="" podobný="" a="" nízky="" vo="" všetkých="" 3="" skupinách="" darcov="" (obrázok="" 2d="" a="">

Postreperfúzny katabolizmus ATP v štepoch þDGF sa vyskytol napriek zjavnej postreperfúznej obnove b-oxidácie mastných kyselín (doplnkový obrázok S2), aktivovanej glykolýze / glutaminolýze (obrázok 3) a autofágii (obrázok 4). Všetky 3 typy štepov vykazovali jednotnú obnovu obsahu b-hydroxybutyrátu v tkanive (doplnkový obrázok S2A) a selektívny klírens (vychytávanie) mastných kyselín so stredne dlhým reťazcom (C8 – C12) z obehu (doplnkové obrázky S1 a S2B – E), čo naznačuje jednotné obnovenie b-oxidácie. Tkanivová akumulácia acetylkarnitínu v štepoch –DGF a þDGF od mŕtvych darcov (doplnkový obrázok S2F) a vymývanie (AV rozdiely) acetylkarnitínu zo štepov þDGF (doplnkový obrázok S2G, P < 0.03)="" však="" naznačuje="" odstupňované="" defekty="" v="" likvidácii="" acetylových="" skupín="" vytvorených="">

Bylina cistanche

Mapovanie sietí glykolýzy/glutaminolýzy (obrázok 3) ukázalo rovnaké hladiny glukózy v tkanivách (obrázok 4a) a potvrdilo pretrvávajúcu postreperfúznu normoxickú glykolýzu ako exkluzívnu vlastnosť darcovských štepov þDGF (pozri pretrvávajúce uvoľňovanie laktátu a pyruvátu (obrázok 3b a c, P<0.0001 and=""><0.04, respectively)="" and="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f,="" p="" <="" 0.02="" and="" <="" 0.0001,="" respectively).="" serine="" (figure="" 4b)="" and="" phosphoserine="" (supplementary="" figure="" 3d)="" released="" from="" þdgf="" grafts="" may="" (partially)="" reflflect="" transamination="" of="" the="" glycolysis="" intermediate="" phosphoglycerate.="" persistent="" post-reperfusion="" glutamate="" release="" (figure="" 3k,="" p="" <="" 0.002),="" selective="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f),="" and="" exhaustion="" of="" the="" tissue="" asparagine="" pool="" (figure="" 3j,="" p="" <="" 0.03)="" in="" þdgf="" grafts="" imply="" continued="" post-reperfusion="" glutaminolysis="" (alanine)="" and="" glutamine="" shuttling="" (asparagine="" aspartate)8="" in="" the="" post-reperfusion="" phase="" of="" these="" grafts.="" moreover,="" the="" exclusive="" release="" of="" serine,="" methionine,="" and="" tyrosine="" (figure="" 4a–c,="" all="" ps="" <="" 0.0005),="" along="" with="" disposal="" of="" butyryl="" carnitine="" and="" isovaleryl="" carnitine="" (figure="" 4d="" and="" e,="" p=""><0.006 and=""><0.003, respectively),="" deamination="" products="" of="" the="" branched-chain="" amino="" acids9,10="" from="" þdgf="" grafts,="" but="" not="" from="" the="" other="" graft="" types="" (figure="" 4a–e),="" implies="">po reperfúziiautofágia u týchto štepov.11.

Obrázok 1|Zhlukované tepelné mapy pre rozdiely v koncentrácii artériovo-venózneho metabolitu v štepe darcu po 30 minútach a obsah tkanivových metabolitov 40 minút po reperfúzii. (a) Zhluková tepelná mapa pre koncentrácie arteriálnych-venóznych metabolitov v čase t ¼ 30 minút po reperfúzii. Stĺpce predstavujú 3 skupiny darcov (štepy od žijúcich darcov [referenčná skupina, n ¼ 10]; štepy od mŕtvych darcov bez neskoršej oneskorenej funkcie štepu [DGF {–DGF, n ¼ 10}] a štepy od mŕtvych darcov s neskorším DGF [þDGF, n ¼ 16]). Zlúčeniny sú zoskupené podľa 5 metabolických zoskupení a v rámci každého zoskupenia sú zoradené na základe z-skóre skupiny žijúcich darcov. Zelená odráža príjem siete štepom a červená odráža uvoľnenie siete zo štepu. (pokračovanie)

Obrázok 1 (Pokračovanie) (b) Zhluková tepelná mapa pre tkanivové metabolity identifikované v analýze HR magického uhla nukleárnej magnetickej rezonancie biopsií štepu odobratých 40 minút po reperfúzii. Stĺpce predstavujú 3 skupiny darcov (skupina žijúcich darcov [referenčná skupina, n ¼ 6, štepy od mŕtvych darcov bez neskoršieho DGF [–DGF, n ¼ 6] a štepy od mŕtvych darcov s neskorším DGF [þDGF, n ¼ 6]). Červená odráža obsah tkaniva nad a zelená odráža obsah tkaniva pod geometrickým priemerom 3 skupín.

Postreperfúzna akumulácia acetylkarnitínu (v tkanive) v –DGF a þDGF štepoch (obrázok 2f) a počiatočné (žijúci darca a štepy –DGF) a pokračujúce (þDGF štepy) uvoľňovanie acetylkarnitínu (P < 0).{10="" }}="" 3)="" naznačujú="" prechodné="" (–dgf="" štepy)="" alebo="" pretrvávajúce="" (þdgf="" štepy)="" narušenú="" likvidáciu="" acetyl-koenzýmu="" a="" po="" reperfúzii="" (doplnkový="" obrázok="" 2g).="" hoci="" táto="" akumulácia="" môže="" byť="" výsledkom="" prehnanej="" glykolýzy="" a="" b-oxidácie,="" môže="" tiež="" naznačovať="" zhoršenú="" likvidáciu="" acetylu="" v="" dôsledku="" defektov="" krebsovho="" cyklu.="" v="" prípade="" štepov="" þdgf="" je="" druhý="" mechanizmus="" podporovaný="" selektívnym="" a="" pretrvávajúcim="" uvoľňovaním="" medziproduktu="" a-ketoglutarátu="" krebsovho="" cyklu="" (obrázok="" 5c,="" p="">< 0,0005)="" ako="" výlučným="" znakom="" týchto="" štepov="" a="" zhoršenou="" obnovou="" tkanivového="" sukcinátu="" v="" štepoch="" þdgf="" (obrázok="">

Posledný zhluk diskriminačných metabolitov súvisí s prebiehajúcim poškodením buniek. Tento klaster zahŕňapo reperfúziiuvoľnenie uracilu, zavedeného markera poškodenia buniek12,13 (doplnkový obrázok S3A, P < 0.0001)="" a="" derivátov="" aminokyselín,="" ktoré="" sa="" spájajú="" s="" hydrolýza="" plazmogénov="" (viď.="" fosfo-etanolamín,="" etanolamín="" a="" fosfoserín;="" doplnkový="" obrázok="" s3bd,="" p="">< 0.001;="" doplnkový="" obrázok="" s1).="" hoci="" neboli="" prítomné="" žiadne="" av="" rozdiely="" pre="" cholín="" v="" skupine="" þdgf="" (p="" ¼="" 0,60),="" toto="" pozorovanie="" je="" v="" kontraste="" s="" čistým="" vychytávaním="" cholínu="" v="" skupine="" žijúcich="" darcov="" a="" –dgf="" (p="">< 0,0001,="" resp.="" 0,02).="" preto="" v="" þdgf="" štepoch="" môže="" byť="" hydrolýza="" cholínových="" plazmogénov="" maskovaná="" absorpciou="" cholínu.="" takýto="" mechanizmus="" je="" podporovaný="" selektívnym="" a="" progresívnym="" uvoľňovaním="" betaínu,="" oxidačného="" produktu="" cholínu14="" v="" skupine="" þdgf="" (doplnkové="" obrázky="" s3g,="" p=""><>

Predchádzajúce pozorovania spájajú incident IRI s pretrvávajúcimpo reperfúziiKatabolizmus ATP a prebiehajúce poškodenie buniek v kontexte mitochondriálneho zlyhania a aktivácie glykolytických a lipolytických dráh (obrázok 6). Vzhľadom na životne dôležitú úlohu ATP v bunkovej homeostáze a prežití sa usúdilo, že nábor pomocných ATP-regeneračných dráh (napr. nezávislých od mitochondriálneho dýchania) by bol prospešný. V tomto kontexte sme uvažovali o inozíne, nukleozide, ktorý môže generovať ATP netradičnými cestami. Ako je znázornené na obrázku 7, ani preventívne, ani záchranné podávanie inozínu (v koncentráciách do 10 mmol/l) nezachránilo vyčerpanie ATP po chemicky vyvolanej metabolickej paralýze.

Obrázok 3|Postreperfúzna glykolýza a glutaminolýza. Krivky pre arteriálne venózne rozdiely (červená krivka je arteriálna, modrá krivka je venózna). Tkanivové biopsie (stĺpcové grafy): biele stĺpce predstavujú predreperfúzne biopsie; sivé stĺpce predstavujú postreperfúzne biopsie (t ¼ 40 min po reperfúzii). *P < 0,05.="" a)="" obsah="" glukózy="" v="" tkanive.="" (b–i)="" medziprodukty="" glykolýzy:="" laktát,="" pyruvát,="" alanín,="" aspartát="" a="" asparagín.="" (k,l).="" glutaminolýza="" sprostredkuje="" glutamín="" a="" glutamát.="" tkanivová="" nukleárna="" magnetická="" rezonancia="" (nmr;="" n="6" na="" skupinu):="" (a)="" regenerácia="" tkanivovej="" glukózy="" u="" živého="" darcu.="" (d,="" f,="" h)="" obsah="" stabilného="" tkaniva="" laktátu,="" alanínu="" a="" aspartátu="" odráža="" vymývanie="" týchto="" medziproduktov="">

Obrázok 3 (pokračovanie) z obličky. (j) Nemerateľný tkanivový asparagín v postreperfúznych biopsiách s oneskorenou funkciou štepu (DFG). Rozdiely v arteriálnej-venóznej (AV) koncentrácii (n ¼ 10, 10 a 16 v živých skupinách, –DGF, respektíve þDGF): (b,c) perzistentný postreperfúzny laktát (P < 0.0001)="" a="" pyruvát="" (p="">< 0,04)="" sa="" z="" týchto="" štepov="" uvoľňujú.="" (e)="" alanín="" (p="">< 0,02),="" (g)="" kyselina="" asparágová="" (p="">< 0,0001)="" a="" (þk)="" uvoľňovanie="" glutamátu="" (oneskorená="" funkcia="" štepu="" (štepy="" dgf="" naznačujúce="" normoxickú="" glykolýzu="" v="" p="">< 0,002)="" zo="" štepov="" þdgf="" naznačujú="" prebiehajúcu="" oxidáciu="" glutamínu="" v="" pre="" glutamín="" (i)="" neboli="" pozorované="" žiadne="" významné="" av="">

cistanche účinky: zabrániťochorenia obličiek

DISKUSIA

Z tejto štúdie vykonanej v kontexte klinickej transplantácie obličky sa objavuje obraz IRI (DGF) ako dôsledok takmer okamžitého a pretrvávajúceho postreperfúzneho zlyhania oxidačnej fosforylácie a aktivovanej normoxickej glykolýzy, ktorá nie je schopná udržať energetickú homeostázu. Na druhej strane sa zásoby vysokoenergetických fosfátov postupne vyčerpávajú a bunková integrita nemôže byť zachovaná, čo vedie k pokračujúcemu poškodeniu tkaniva.

Táto klinická štúdia je založená na integrácii metabolických údajov odvodených z tkanivových biopsií odobratých bezprostredne pred a 40 minút po reperfúzii a zo sekvenčného hodnotenia AV rozdielov medzi reperfundovaným štepom. Tieto AV rozdiely poskytujú nielen indikáciu tempa a trvania metabolických (malých) adaptácií, ale umožňujú aj nasmerovanie trendov pozorovaných v párových tkanivových biopsiách a zhodnotenie klírensu metabolitu (napr. laktátu) alebo príjmu z (napr. média) -mastné kyseliny so stredne dlhým reťazcom) cirkulácia.15,16 Rozlíšenie AV prístupu je jasne ilustrované údajmi o acylkarnitíne, ktoré nielenže ukazujú selektívny príjem mastných kyselín so stredne dlhým reťazcom, ale tiež naznačujú, že nenasýtené C14 karnitínové druhy tetradecenoyl a tetradekadienylkarnitín sa správajú podobne ako mastné kyseliny so stredne dlhým reťazcom (doplnkové údaje S1) a nemusia sa spoliehať na špecifické transportéry mastných kyselín.17 V skutočnosti sa v procese analýzy údajov zistilo, že samotné spoliehanie sa na tkanivové biopsie by zakrylo väčšinu záverov v tejto štúdii pretože väčšina vytvorených metabolitov sa účinne vylučuje do obehu. Stabilné koncentrácie v arteriálnej krvi ukazujú, že homeostáza krvi je zachovaná a následne sa uvoľnené alebo absorbované metabolity účinne likvidujú alebo dopĺňajú inde.15,16 Pozorovaný stabilný obsah tkaniva, ale jasné AV rozdiely spochybňujú platnosť tkanivových metabolomických hodnotení. Všimnite si, že v kontexte obličiek od mŕtvych darcov a časového rámca štúdie nie je klírens moču rušivým faktorom, pretože všetky štepy od mŕtvych darcov boli počas 40- minútového intervalu merania anurické.

Mapovanie údajov identifikuje metabolickú stopu, ktorá je úplne diskriminačná pre IRI. Konkrétne je reperfúzna fáza štepov s budúcim DGF jednotne a zreteľne charakterizovaná závažne narušenou oxidačnou fosforyláciou (histotoxickou hypoxiou)18 a kompenzačnou normoxickou glykolýzou, ktorá nie je schopná udržať regeneráciu ATP. Posledný záver je založený na neúplnej obnove vysokoenergetického fosfátového tlmivého roztoku fosfokreatínu19 a na pretrvávajúcom postreperfúznom katabolizme ATP/GTP, ktorý sa odráža v pokračujúcom uvoľňovaní (hypo)xantínu. V skutočnosti aproximácia strát adenozínu pre þDGF štepy na základe uvoľňovania hypoxantínu (AV rozdiely) v priebehu 30 minút po reperfúzii (približná hodnota založená na hlásených rýchlostiach prietoku po reperfúzii,20 priemerobličkové tkanivohmotnosť,21 a renálny obsah ATP22) naznačuje takmer vyčerpanie zásoby ATP štepu za 30 minútpo reperfúzii. Kritické vyčerpanie zásoby ATP môže viesť ku katabolickému zablokovaniu, ktoré spôsobí, že bunka nebude reagovať na obnovenie protónových hybných síl, ktoré poháňajú tvorbu ATP, čo spôsobí, že bunka nebude reagovať na záchranné stratégie.

Postreperfúzny deficit ATP a histotoxická hypoxia v štepoch þDGF môže byť základom selektívneho uvoľňovania aminokyselín spojených s hydrolýzou fosfolipidov (plazmalogénov) v štepoch þDGF. Experimentálne štúdie identifikovali hydrolýzu plazmalogénov a fosfolipidov ako skorú charakteristiku tkanivovej hypoxie23 a hydrolýza plazmalogénov bola opísaná v kontexte ischemického poškodenia obličiek.24 Mechanicky je tento jav spojený s translokáciou membrány a aktiváciou cytosolického vápnika. nezávislá fosfolipáza A2, ktorá je výsledkom tvorby komplexu riadeného hypoxiou medzi fosfolipázou a regulačným prvkom fosfofruktokinázy.25,26 Zvrátenie hypoxie alebo liečby ATP disociuje komplex fosfolipáza-fosfofruktokináza a ruší aktivitu fosfolipázy. Všimnite si, že dynamika postreperfúzneho zastavenia uvoľňovania (fosfo-)etanolamínu zo živých darcov a štepov –DGF, ako aj pretrvávajúce uvoľňovanie v štepoch þDGF, môže odrážať rôzne stupne a rýchlosti metabolickej obnovy. Zatiaľ čo predchádzajúce správy naznačujú úlohu cytosolickej fosfolipázy A2 nezávislej od vápnika, pozorované AV rozdiely pre betaín a (fosfo-)etanolamín znamenajú komplexnejšiu aktiváciu fosfolipáz, ktorá zahŕňa aj fosfolipázy typu C (fosfo-etanolamín) a D-fosfolipázy (etanolamín/cholín). Podobne deplécia tkanivového asparagínu (obrázok 4j) a uvoľnenie aspartátu (obrázok 4g) zo štepov þDGF môže odrážať zhoršenú aktivitu asparagínsyntázy v dôsledku deplécie ATP.

Obrázok 4|Aktivovaná postreperfúzna autofágia v štepoch D s oneskorenou funkciou štepu (DGF).. Krivky pre artériovo-venózne rozdiely (červená krivka je arteriálna, modrá krivka je venózna). Tkanivové biopsie (stĺpcové grafy): biele stĺpce predstavujú predreperfúzne biopsie; sivé stĺpce predstavujú postreperfúzne biopsie (t ¼ 40 min po reperfúzii). *P < 0,05.="" (a="" –="" c)="" postreperfúzne="" uvoľnenie="" metionínu,="" serínu="" a="" tyrozínu="">

Obrázok 5|Poreperfúzny defekt Krebsovho cyklu v štepoch s budúcou oneskorenou funkciou štepu (DGF). Krivky pre rozdiely arteriálnej-venóznej koncentrácie (AV) (červená krivka je arteriálna, modrá krivka je venózna). Tkanivové biopsie (stĺpcové grafy): biele stĺpce predstavujú predreperfúzne biopsie; sivé stĺpce predstavujú postreperfúzne biopsie (t ¼ 40 min po reperfúzii). *P < {{10}}.05.="" (a–h)="" av="" rozdiely="" pre="" medziprodukty="" krebsovho="" cyklu="" (n="" ¼="" 10,="" 10="" a="" 16="" v="" živých="" skupinách,="" –dgf="" a="" þdgf,="" v="" tomto="" poradí):="" pretrvávajúce="" uvoľňovanie="" a-ketoglutarátu="" (zo="" štepov="" þdgf;="" p="">< 0,001)="" .="" (e,g)="" neprítomné="" obnovenie="" sukcinátu="" tkaniva="" po="" reperfúzii="" v="" štepoch="" þdgf="" (p=""><>

Postreperfúzny katabolizmus ATP v þDGF štepoch nastal napriek komplexnej aktivácii katabolických dráh: glykolýza, b-oxidácia mastných kyselín so stredne dlhým reťazcom (rovnomerne aktivovaná vo všetkých typoch štepov), glutaminolýza (tiež prechodne aktivovaná po reperfúzii u živých darcov a štepov –DGF ) a aktivovaná autofágia. V skutočnosti bolo postreperfúzne uvoľňovanie izovaleryl- a butyrylkarnitínu, deaminačných produktov aminokyselín s rozvetveným reťazcom izoleucínu a leucínu11 identifikované ako diskriminačné biomarkery pre budúci DGF.

Pretrvávajúce uvoľňovanie acetylkarnitínu a pyruvátu zo štepov þDGF ukazuje, že toky vytvorené aktivovanými katabolickými cestami prekročili oxidačnú kapacitu. Postreperfúzne uvoľnenie ketoglutarátu, čisté vychytávanie citrátu a izocitrátu jeho prekurzora z obehu a neúspešná regenerácia tkanivového sukcinátu naznačujú, že narušená oxidačná fosforylácia zahŕňa defekt na úrovni komplexu oxoglutarátdehydrogenázy. Konkrétne, pozorovaná metabolická stopa a časový rámec metabolických porúch nenaznačujú úlohu pre obrátenú smerovateľnosť Krebsovho cyklu27,28 pri pretrvávajúcej metabolickej dysregulácii, čo poskytuje ďalší dôkaz, že pozorovaný mechanizmus IRI u hlodavcov28 sa úplne nepremieta na človeka. súvislosti.29.

Zhoršená aktivita oxoglutarátdehydrogenázy môže byť spôsobená poškodením komplexu súvisiacim s ischémiou30, ale môže tiež zahŕňať alebo byť zvýraznená narušenímpo reperfúziiZhoršená aktivita oxoglutarátdehydrogenázy môže byť spôsobená poškodením komplexu súvisiacim s ischémiou30, ale môže tiež zahŕňať alebo byť zveličená zhoršenou postreperfúznou dostupnosťou jeho kofaktorov acetyl-koenzýmu A, FADþ a NADþ. 31 V prípade štepov þDGF by sa takéto nedostatky mohli vyskytnúť v dôsledku vymývania acetyl-koenzýmom A po reperfúzii a zhoršeného stavu bunkového redoxu (redukčný stres so zhoršenou dostupnosťou NADþ), čo je názor podporovaný nízkym pomerom laktátu k pyruvátu v štepoch þDGF. 32.

Tento metabolický prístup neumožňuje hodnotenie zapojenia dýchacieho reťazca. Už skôr sme však identifikovali defekty súvisiace s ischémiou a reperfúziou v oboch respiračných komplexoch I a II.7,29 Na základe údajov z tejto štúdie a predchádzajúcej mitochondriálnej práce sa objavuje obraz klinického renálneho IRI, ktorý je dôsledkom primárnej (resp. vyvolávanie) urážky (urážok) mitochondriálneho Krebsovho cyklu-redoxného raketoplánu, ku ktorému dochádza pred alebo v prvých minútach reperfúzie. Neschopnosť obnoviť hladiny ATP má za následok trvalú a komplexnú aktiváciu katabolických dráh, ktorá udržiava energetickú krízu progresívnym vyčerpaním bunkovej zásoby NADþ a FADþ (redukčný stres).33 V tomto špecifickom kontexte zlyhania mitochondriálneho dýchania môže byť purín inozín prospešný. . Na rozdiel od adenozínu34 je inozín v plazme stabilný; bol identifikovaný ako alternatívny zdroj ATP v obligátnych glykolytických bunkách (tj v bunkách bez mitochondrií), ako sú erytrocyty35 a v hypoxických obličkových bunkách36 a je vyčerpaný po reperfúzii. Žiaľ, suplementácia inozínu nezachránila bunkovú depléciu ATP po nútenom metabolickom zastavení, čo ponechalo malý priestor pre stratégie metabolickej záchrany zamerané na uhasenie IRI, pričom sa zdôraznilo spoliehanie sa na preventívne stratégie na obmedzenie IRI.

Tonifikujte obličkové cistanche

Táto štúdia má svoje obmedzenia. Vzhľadom na veľký počet porovnaní je potenciál pre významné zistenia v dôsledku náhodnej náhody pri viacerých porovnaniach vysoký. Aj keď sú naše závery podporené zdravými biologickými vzťahmi, výsledky môžu byť skreslené problémami súvisiacimi s viacnásobným porovnaním.

Ďalším obmedzením je, že štúdia je založená na klinických vzorkách; ako také zmrazovanie svorky potrebné na priame hodnotenie ATP a redoxného stavu nebolo možné. Pretože pozorovaný metabolóm je jasne odlišný od metabolómu hláseného na zvieracích modeloch a odráža zlyhanie systému, nemohli sme vykonať podrobnejšie hodnotenia na zvieracích modeloch alebo ex vivo systémoch, ako je napríklad systém respirometrie. Výsledky v tejto štúdii sú preobličky; takže závery pre iné orgány môžu byť odlišné. Relatívne vysoký vek darcu v tejto štúdii je odrazom populácie darcov v Holandsku. Dôležité je, že 10-ročné výsledky transplantácie v Holandsku sú prinajmenšom rovnaké ako v krajinách s mladšími darcami, ako sú Spojené štáty americké.37 Ako sa očakávalo, väčšina prípadov þDGF boli štepy DCD. Všimli sme si podobnémetabolické profilypre DBD a DCD štepy; sila tejto exploratívnej štúdie je však zjavne príliš nízka na to, aby odhalila jemné rozdiely medzi týmito 2 typmi darcov.

Obrázok 7|Preventívna ani záchranná liečba inozínom nedokáže obnoviť hladiny adenozíntrifosfátu (ATP).. Línia obličkových buniek PK{0}} bola stabilne transfekovaná fluorescenčným biosenzorom PercevalHR pomeru ATP k adenozíndifosfátu (ADP).

Chemicky indukovaná metabolická paralýza bola vyvolaná pridaním rotenónu/aktinomycínu/2-deoxyglukózy a monitoroval sa pomer ATP k ADP (relatívna fluorescencia). Hnedá, kontrola; čierna, kontrola metabolickej paralýzy; zelená, preventívna liečba inozínom (10 mmol/l); červená, inozínová záchrana v t ¼ 15 minút po vyvolaní metabolickej paralýzy.

Na záver, táto štúdia ukazuje, že klinickej renálnej IRI predchádza takmer okamžitý metabolický kolaps a sprievodná vysokoenergetická fosfátová kríza. Tento hlboký a pretrvávajúci metabolický deficit a jeho okamžitá povaha (a následné minimálne okno terapeutických príležitostí) budú interferovať s akýmkoľvek farmaceutickým zásahom, ktorý závisí od dostupnosti ATP. To môže vysvetliť slabú prenosnosť predklinických zistení do klinického prostredia.2–4 Pozorovaný metabolóm klinického DGF ostro kontrastuje s hlásenými metabolickými odpoveďami u potkanov, 28 myší, 38 a ošípaných, 39, 40 ktoré všetky naznačujú obnovenie oxidačnej fosforylácie v rámci minúty reperfúzie. Môže to súvisieť so zásadnými rozdielmi v mitochondriálnej alebo metabolickej fyziológii medzi hlodavcami a väčšími cicavcami (napr. akumulácia sukcinátu vyvolaná ischémiou sa nevyskytuje v obličkách ľudského darcu).29 V tejto súvislosti je dôležité zdôrazniť, že všetky transplantované obličky sú vystavené doreperfúzia ischémiea že iba podskupina štepov de velops IRI (DGF). Pridelenie skupín (þDGF alebo –DGF) v tejto štúdii bolo vykonané retrospektívne, a preto rozlišuje medzi ischemickou reperfúziou a IRI. Nedá sa vylúčiť, že ischemická reperfúzia v experimentálnych modeloch28,38–40 nie je dostatočná na spustenie IRI.

Napriek vážnemu utrpenému poškodeniu sa všetky štepy þDGF nakoniec zotavili, čo znamená pozoruhodný potenciál obnovy za predpokladu, že sú dostupné premosťujúce zásahy (napr. dialýza). Treba poznamenať, že hoci podobné metabolómy pre DGF v štepoch odvodených od darcov, ktorí zomreli po smrti mozgu alebo srdcovej smrti, naznačujú jednotný mechanizmus, existuje kontrastný vplyv DGF na dlhodobé prežitie štepu pre 2 typy darcov.41 V skutočnosti, hoci DGF jednoznačne ovplyvňuje prežívanie štepov od darcov zosnulých po mozgovej smrti, u takýchto štepov od srdcových darcov nie. Zdá sa, že tento kontrast odráža vynikajúci potenciál obnovy štepov od darcov srdcovej smrti.41

METÓDY

Lekárska etická komisia Leiden University Medical Center schválila protokol štúdie. Od každého pacienta bol získaný písomný informovaný súhlas. Táto štúdia v jednom centre zahŕňala 53 pacientov, ktorí podstúpili liečbuobličkytransplantácia: 37 podstúpilo zákroky štepu od mŕtveho darcu a 16 zákrok od žijúceho darcu. Na základe klinického výsledku (DGF) boli príjemcovia transplantátov od mŕtvych darcov zaradení do skupiny þDGF (n ¼ 16) alebo do skupiny –DGF (n ¼ 10). DGF bol definovaný potrebou dialýzy v prvom týždni po transplantácii.6

Štúdia je založená na integrácii metabolomických údajov získaných zo sekvenčných arteriovenóznych (AV) odberov krvi počas prvej polhodiny reperfúzie a z párových biopsií tkaniva odobratých bezprostredne pred a 40 minút po

reperfúzia.

Sekvenčný AV odber krvi cez štep sa uskutočnil u 36 pacientov (doplnková tabuľka S1A). Vzorky krvi z obličkovej žily sa odoberali po 3 0 s a 3, 5, 10, 20 a 30 minútach a arteriálne vzorky po 0, 10 a 30 minútach po reperfúzii.42 Párové predreperfúzne a poreperfúzne biopsie boli získané bezprostredne pred a 40 minút po reperfúzii zo 6 živých a 12 mŕtvych darcovských štepov (doplnková tabuľka S1B; 1 pacient mal odobraté biopsie aj AV vzorky).

Cielené metabolomické analýzy sa uskutočnili pomocou štandardných operačných postupov s použitím zavedených platforiem založených na hmotnostnej spektrometrii alebo magickej uhlovej nukleárnej magnetickej rezonancie (biopsie tkaniva).43 Metabolity pokryté platformami sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke S1.

Potenciál inozínu zachrániť metabolický deficit počas metabolického kolapsu bol testovaný v bunkovej línii proximálneho tubulu (LLC PK1) stabilne transfekovanej fluorescenčným ATP adenozíndifosfátovým biosenzorom PercevalHR.44.

Čo sa týka štatistiky, tepelné mapy boli zostavené na základe z-skóre pre každú z nichmetabolit. Zmeny v obsahu tkanivových metabolitov v rámci skupiny boli testované Mann-Whitney testom a rozdiely medzi skupinami Wilcoxonovým testom. AV rozdiely boli odhadnuté pomocou lineárneho zmiešaného modelu. Oprava pre viacnásobné testovanie nebola vykonaná, pretože všetky pozorovania boli súčasťou teoretických sietí. Podrobnosti týkajúce sa pacientov a metód sú uvedené v doplnkových metódach.

extrakt z cistanche

DISCLOSURE

Všetci autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

POĎAKOVANIE

Základné zariadenie magnetickej rezonancie je financované Lekárskou fakultou NTNU Trondheim v Nórsku. Táto štúdia bola čiastočne financovaná holandskou nadáciou pre obličky (Metabolic Salvage Strategies to Improve Transplant Outcome, projekt17O/11).

DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkový súbor (PDF)

Doplnkoví pacienti a metódy.

Tabuľka S1. Charakteristiky pacienta a transplantácie postupov, pri ktorých sa odoberali párové tkanivové biopsie (A) a pri ktorých sa vykonal odber AV vzoriek (B).

Tabuľka S2. Pre AV vzorky sa používajú platformy a ich metabolity.

Obrázok S1. Úplné metabolomické údaje.

Obrázok S2. Obnovenie b-oxidácie (mastné kyseliny so stredne dlhým reťazcom) po reperfúzii.

Obrázok S3. Selektívne a pretrvávajúce postreperfúzne vymývanie uracilu a aminokyselín spojených s fosfolipidom (plazmalogénom) zo štepov s budúcim DGF.

Dodatok k údajom 1. Nespracované AV údaje pre acetylkarnitín, organické kyseliny a aminokyselinové platformy.

Doplnok k údajom 2. Nespracované AV údaje pre purínovú a pyrimidínovú platformu.

LITERATÚRA

1. Gutteridge JMC, Halliwell B. Reaktívne druhy pri chorobe: priatelia alebo nepriatelia? In: Halliwell B, Gutteridge JMC, eds. Voľné radikály v biológii a medicíne. Oxford, UK: Oxford University Press; 2015:511–638.

2. Davidson SM, Ferdinandy P., Andreou I. a kol. Viaccieľové stratégie na zníženie ischémie/reperfúzneho poškodenia myokardu: téma týždňa prehľadu JACC. J Am Coll Cardiol. 2019;73:89–99.

3. Lefer DJ, Bolli R. Vývoj konzorcia NIH pre predklinické hodnotenie kardioprotektívnych terapií (CAESAR): zmena paradigmy v štúdiách obmedzenia veľkosti infarktu. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2011;16:332– 339.

4. Cavaillé-Coll M, Bala S, Velidedeoglu E, a kol. Zhrnutie workshopu FDA o ischemickom reperfúznom poškodení pri transplantácii obličky. Am J Transplant. 2013;13:1134–1148.

5. Schröppel B, Legendre C. Oneskorená funkcia obličkového štepu: od mechanizmu k translácii. Kidney Int. 2014;86:251–258.

6. Mallon DH, Summers DM, Bradley JA a kol. Definovanie oneskorenej funkcie štepu po transplantácii obličky: najjednoduchšie je najlepšie. Transplantácia. 2013;96:885–889.

7. Wijermars LG, Schaapherder AF, de Vries DK a kol. Defektná postreperfúzna metabolická obnova priamo súvisí s oneskorenou funkciou štepu. Kidney Int. 2016;90:181–191.

8. Zhang J, Fan J, Venneti S, a kol. Asparagín hrá rozhodujúcu úlohu pri regulácii bunkovej adaptácie na depléciu glutamínu. Mol Cell. 2014;56: 205–218.

9. Holeček M. Vzťah medzi glutamínom, aminokyselinami s rozvetveným reťazcom a metabolizmom bielkovín. Výživa. 2002;18:130–133.

10. Newgard CB, An J, Bain JR, a kol. Metabolický podpis s aminokyselinami s rozvetveným reťazcom, ktorý odlišuje obéznych a štíhlych ľudí a prispieva k inzulínovej rezistencii. Cell Metab. 2009;9:311–326.

11. Drake KJ, Sidorov VY, McGuinness OP a kol. Aminokyseliny ako metabolické substráty počas srdcovej ischémie. Exp Biol Med (Maywood). 2012;237: 1369–1378.

12. De Jong JW, Huizer T, Janssen M a kol. Vysokoenergetické fosfáty a ich katabolity. In: Piper HM, Preusse CJ, eds. Ischémia-reperfúzia v kardiochirurgii. Dordrecht, Holandsko: Springer; 1993:295-315.

13. van Os S, de Abreu R, Hopman J, a kol. Metabolizmus purínov a pyrimidínov a elektrokortikálna mozgová aktivita počas hypoxémie u krátkodobo narodených jahniat. Pediatr Res. 2004;55:1018–1025.

14. Blom HJ, De Vriese AS. Prečo sú hladiny homocysteínu zvýšené pri zlyhaní obličiek? Metabolický prístup. J Lab Clin Med. 2002;139:262–268.

15. Ivanisevic J, Elias D, Deguchi H, a kol. Metabolomika arteriovenóznej krvi: odčítanie intra-tkanivovej metabostázy. Sci Rep. 2015;5:12757.

16. Jang C, Hui S, Zeng X, a kol. Metabolitová výmena medzi orgánmi cicavcov kvantifikovaná u ošípaných. Cell Metab. 2019;30:594–606.

17. Bremer J. Metabolizmus a funkcie karnitínu. Physiol Rev. 1983;63: 1420-1466.

18. Siggaard-Andersen O, Fogh-Andersen N, Gøthgen IH, Larsen VH. Stav kyslíka v arteriálnej a zmiešanej venóznej krvi. Crit Care Med. 1995;23:1284–1293.

19. Stoica SC. Vysokoenergetické fosfáty a ľudské darcovské srdce. J Transplantácia pľúc srdca. 2004;23:S244–S246.

20. Lisik W, Gontarczyk G, Kosieradzki M, a kol. Intraoperačné merania prietoku krvi v orgánových aloimplantátoch môžu predpovedať pooperačnú funkciu. Transplant Proc. 2007;39:371–372.

21. Molina DK, DiMaio VJ. Normálna hmotnosť orgánov u mužov: časť II – mozog, pľúca, pečeň, slezina a obličky. Am J Forensic Med Pathol. 2012;33:368– 372.

22. Hems DA, Brosnan JT. Účinky ischémie na obsah metabolitov v pečeni a obličkách potkanov in vivo. Biochem J. 1970;120:105-111.

23. De Medio GE, Goracci G, Horrocks LA a kol. Účinok prechodnej ischémie na metabolizmus mastných kyselín a lipidov v mozgu gerbilov. Ital J Biochem. 1980;29:412–432.

24. Rao S, Walters KB, Wilson L, a kol. Včasné zmeny lipidov pri akútnom poškodení obličiek pomocou lipidomiky SWATH spojenej so zobrazením tkaniva MALDI. Am J Physiol Renálny Physiol. 2016;310:F1136–F1147.

25. Portilla D, Shah SV, Lehman PA a kol. Úloha cytosolickej vápnikovo nezávislej plazmalogén-selektívnej fosfolipázy A2 pri hypoxickom poškodení proximálnych tubulov králikov. J Clin Invest. 1994;93:1609–1615.

26. Hazen SL, Wolf MJ, Ford DA, Gross RW. Rýchla a reverzibilná asociácia fosfofruktokinázy s membránami myokardu počas ischémie myokardu. FEBS Lett. 1994;339:213–216.

27. Chinopoulos C. Akým smerom sa otáča cyklus kyseliny citrónovej počas hypoxie? Kritická úloha komplexu a-ketoglutarátdehydrogenázy. J Neurosci Res. 2013;91:1030–1043.

28. Chouchani ET, Pell VR, Gaude E, a kol. Ischemická akumulácia sukcinátu riadi reperfúzne poškodenie prostredníctvom mitochondriálnych ROS. Príroda. 2014;515:431–435.

29. Wijermars LG, Schaapherder AF, Kostidis S a kol. Akumulácia sukcinátu a ischemicko-reperfúzne poškodenie: u myší, ale nie u mužov, štúdia renálnej ischémie-reperfúzie. Am J Transplant. 2016;16:2741–2746.

30. Tretter L, Adam-Vizi V. Alfa-ketoglutarátdehydrogenáza: cieľ a generátor oxidačného stresu. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2005;360: 2335–2345.

31. Heikal AA. Intracelulárne koenzýmy ako prirodzené biomarkery pre metabolické aktivity a mitochondriálne anomálie. Biomark Med. 2010;4:241–263.

32. Sun F, Dai C, Xie J a kol. Biochemické problémy pri odhade pomeru NAD/NADH voľného cytosólu. PLoS One. 2012;7:e34525.

    ---