Polysacharid Cistanche Deserticola inhibuje stratu kostnej hmoty indukovanú OVX u myší a osteoklastogenézu indukovanú RANKL

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

ABSTRAKT

Osteoporóza je závažné ochorenie kostí, ktoré postihuje starnúcu populáciu. Ukázalo sa, že Cistanche deserticola (CD), tonikum a liečivá potravina široko používaná v Číne, poskytuje účinnú liečbu osteoporózy. Polysacharid Cistanche deserticola (CDP), extrahovaný z CD, má rôzne farmakologické vlastnosti, ale jeho úloha vosteoklastickétvorba a funkcia, ako aj osteoporóza, zostáva neznáma. Účelom tejto štúdie bolo extrahovať a vyčistiť CDP, aby sa ďalej preskúmal jeho potenciálny mechanizmus účinku na osteoporózu. Výsledky ukázali, že liečba CDP zabránila osteoporóze vyvolanej OVX a zlepšila stratu kostnej hmoty potlačením aktivity a funkcie osteoklastov. Okrem toho liečba CDP významne inhibovala RANKL-indukovanú osteoklastogenézu, kostnú resorpciu a génovú expresiu špecifickú pre osteoklasty. CDP mechanicky inhiboval RANKL-indukovanú aktiváciu signálnych dráh NF-KB a MAPK a následne ovplyvnil následnú aktiváciu NFATc1. Zistenia v tejto štúdii naznačujú, že CDP je potenciálne bezpečný liek na liečbu osteoporózy. (10 výhod, ktoré môže Cistanche poskytnúť)

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Úvod

Osteoporóza – ochorenie charakterizované znížením kostnej hmoty, abnormálnou mikroštruktúrou kostného tkaniva, zvýšenou krehkosťou kostí a zlomeninami (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli a Ginaldi, 2006) – v súčasnosti postihuje viac ako 200 miliónov ľudí na celom svete a predstavuje významný medicínsky a socioekonomická záťaž modernej spoločnosti (Strom et al., 2011). Klinická liečba osteoporózy sa zameriava hlavne na hormonálnu náhradu,bisfosfonátalebo terapia denosumabom. Tieto metódy sú účinné, ale predstavujú dlhodobé vedľajšie účinky, ako je potenciálne riziko rakoviny prsníka a atypických zlomenín stehennej kosti (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011). Existuje teda naliehavá potreba preskúmať lieky, ktoré môžu nielen inhibovať osteoporózu, ale majú aj menej nežiaducich vedľajších účinkov. Cistanche deserticola (CD), tonikum a liečivá potravina široko používaná v Číne, známa ako „púštny ženšen“, je sušená sukulentná stonka so šupinovým listom C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) a má rôzne a účinné farmakologické aktivity, ako je regulácia imunity,antioxidačnéa vlastnosti proti osteoporóze (Hu a kol., 2020; Li a kol., 2012; Zhang a kol., 2014). Predchádzajúce štúdie o aktívnych látkach CD pri liečbe osteoporózy sa zamerali hlavne na fenyletanoidové glykozidy (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD však obsahuje aj ďalšie účinné zložky ako iridoidy, lignany, polysacharidy (Wang, Zhang, & Xie, 2012). Klinickou aplikáciou tradičnej čínskej medicíny (TCM) je najmä odvar z vody. Polysacharidy sú vo vode rozpustné zložky a s najväčšou pravdepodobnosťou sú hlavnými farmakodynamickými zložkami TČM. O polysacharidoch extrahovaných z TCM sa divoko uvádzalo, že majú antiosteoporózny účinok a niekoľko nežiaducich vedľajších účinkov, ktoré sa vo všeobecnosti používajú na klinikách (napr. polysacharidy extrahované zEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai a Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang a Yan, 2018) a Morinda officinalis (Yan a kol., 2019)). Preto sme predpokladali, žePolysacharid Cistanche deserticola(CDP) extrahovaný z CD môže byť potenciálne bezpečným liekom na liečbu osteoporózy. Resorpcia kostí a tvorba kostí zvyčajne udržiavajú dynamickú rovnováhu počas prestavby kostí v koordinácii s niekoľkými typmi buniek, vrátane osteoklastov,osteoblastybunky výstelky kostí a osteocyty (Kular, Tickner, Chim a Xu, 2012). Porušenie tejto rovnováhy môže viesť k rôznym metabolickým ochoreniam kostí, ako je osteoporóza (Zhu a kol., 2018) a osteoskleróza (Ihde a kol., 2011). Osteoklasty, ako koncové diferencované bunky odvodené z mononukleárnej/makrofágovej línie, sú jediné bunky s funkciou kostnej resorpcie (Teitelbaum, 20{{1{131}}6}}0). Existujú dva kľúčové cytokíny, ktoré sa podieľajú na diferenciácii a dozrievaní osteoklastov (Koga et al., 2004): faktor stimulujúci kolónie makrofágov (M-CSF) a receptorový aktivátor ligandu jadrového faktora κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF sprostredkováva diferenciáciu hematopoetických kmeňových buniek na progenitory osteoklastov a podporuje diferenciáciu osteoklastov upreguláciou expresie RANK receptora (Takayanagi, 2007). Väzba RANKL a RANK na povrch buniek osteoklastov vedie k nasledovnému: (1) náboru signálnych adaptorových molekúl, ako je faktor 6 spojený s TNF receptorom (TRAF6); (2) aktivácia viacerých downstream cieľov, vrátane NF-KB a mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK); a (3) upregulácia hladín expresie jadrového faktora aktivovaných T-buniek, cytoplazmatická 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktivácia týchto signálnych dráh priamo reguluje expresiu génov osteoklastov, vrátane kyslej fosfatázy 5 (Acp5) [kódujúcej kyslú fosfatázu rezistentnú na vínan (TRAcP)], matricovej metaloproteinázy 9 (MMP9) a katepsínu K (CTSK) (Boyle, Simonet a Lacey, 2003). Preto je inhibícia RANKL-indukovaných signálnych dráh súvisiacich s diferenciáciou osteoklastov potenciálnou terapeutickou metódou pre osteoporózu. V tejto štúdii sme sa zamerali na určenie účinkov liečby CDP na myšom modeli osteoporózy indukovanej ovariektómiou (OVX) in vivo a na aktivitu osteoklastov indukovanú RANKL in vitro, so zameraním na expresiu génov špecifických pre osteoklasty a aktiváciu NFATc1 a signálnych dráh NF-KB a MAPK. Naše zistenia môžu poskytnúť nový pohľad na potenciál CDP ako bezpečného a účinného lieku na liečbu osteoporózy. 2. Materiály a metódy 2.1. CD so zbierkou chemikálií a vzoriek (č. 180801) bolo zakúpené od Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Čína) a identifikované profesorom Haibo Huangom z Fakulty farmaceutických vied, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Čína . Tablety estradiolvalerátu boli zakúpené od Bayer (Leverkusen, Severné Porýnie-Vestfálsko, Nemecko). Alfa modifikované minimálne esenciálne médium (-MEM) a fetálne bovinné sérum (FBS) boli získané od Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicilín/streptomycín a súprava na farbenie TRAcP boli získané od spoločnosti Solarbio (Peking, Čína). Rekombinantný myšací M-CSF a rekombinantný myšací RANKL boli získané od R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hydroxyapatitom potiahnuté platne boli zakúpené od Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Primárne protilátky pre NFATc1 a CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IKB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK a P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); a -aktín (CWBIO, Peking, Čína). Ostatné činidlá použité v tejto štúdii boli analytickej kvality a voda bola čistená systémom na čistenie vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. Extrakcia CDP CD sa rozomlelo na jemný prášok a trikrát sa zmiešalo s petroléterom, aby sa porazilo. Pevný zvyšok sa zozbieral filtráciou a potom sa vysušil pri teplote miestnosti. Polysacharidy sa extrahovali z vopred upravených vzoriek trikrát vodou počas 2 hodín, skoncentrovali sa, vyzrážali sa pridaním bezvodého etanolu na konečnú koncentráciu 80 percent (v/v) a skladovali sa pri 4 °C počas 24 hodín. Precipitáty boli zozbierané centrifugáciou pri 3000 ot./min počas 20 minút, rozpustené v destilovanej vode a purifikované (odstránenie voľných proteínov) pomocou metódy Sevag (Zhao et al., 2019). Získané polysacharidy sa dialyzovali, sušili a skladovali až do ďalšieho použitia. Okrem toho výsledky chemického zloženia ukázali, že celkový obsah cukru, kyseliny urónovej, sulfátu a bielkovín v CDP bol 67,63 ± 0,98 percenta, 21,05 ± 0,49 percenta, 1,90 ± 0,24 percenta a 8,81 ± 0,36 percenta. Monosacharidové zloženie a infračervená analýza s Fourierovou transformáciou CDP boli znázornené na doplnkovom obrázku 1 a 2. 2.3. Myší model osteoporózy vyvolanej OVX Všetky experimenty na zvieratách boli schválené Výborom pre etiku zvierat Guangzhou University of Chinese Medicine (schválené SYXK 2019-0202). Tridsaťtýždňovým samiciam myší C57BL/6 dodalo experimentálne zvieracie centrum Guangzhou University of Chinese Medicine. Po aklimatizácii počas 1 týždňa bola jednej skupine myší vykonaná falošná operácia (Sham skupina), zatiaľ čo zvyšné myši boli podrobené operácii ovariektómie (OVX skupina). Po operácii sa myši nechali 1-týždeň zotavovať. Potom boli úspešne modelované myši náhodne rozdelené do 5 skupín, so 6 myšami na skupinu: (1) simulovaná skupina: liečená destilovanou vodou, (2) skupina OVX: liečená destilovanou vodou, (3) skupina OVX plus E2 (E2) : liečení 0,13 mg/kg tabletami estradiolvalerátu, (4) OVX plus CDP skupina s nízkou dávkou (CDP-L): liečená 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP skupina s vysokou dávkou (CDP H): liečená so 600 mg/kg CDP. Destilovaná voda, E2 alebo CDP sa podávali sondou raz denne. Všetky myši boli usmrtené po 12- týždni liečby (obr. 1A). Maternice sa odobrali a zvážili a ľavé holenné kosti sa odobrali na následné vyšetrenia. Vzorky plnej krvi boli odobraté a centrifugované pri 5000 ot./min. počas 15 minút pri 4 °C. Sérové ​​supernatanty sa odsali a skladovali pri -80 °C až do ďalšej analýzy. 2.4. Analýza mikropočítačovou tomografiou (mikro-CT) a kostná histomorfometria Ľavé holenné kosti boli fixované 4% paraformaldehydom počas 48 hodín a následne umiestnené do centrifugačných skúmaviek obsahujúcich normálny fyziologický roztok. Fixované vzorky boli skenované prístrojom Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgicko) s použitím nasledujúcich nastavení: napätie, 80 kV; prúd zdroja, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; veľkosť pixelov, 9,76 μm; a rotačný krok, 0,6◦. Niekoľko parametrov trabekulárnej kosti, vrátane kostnej minerálnej hustoty (BMD), objemovej frakcie kosti (BV/TV), kostného povrchu na celkový objem (BS/TV), trabekulárneho počtu (Tb. N) a trabekulárneho rozstupu (Tb.Sp ) boli merané pomocou softvéru CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trojrozmerné obrázky sa generovali pomocou softvéru CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Po mikro-CT analýze boli ľavé holenné kosti dekalcifikované v 14 percentnom roztoku EDTA a zaliate do parafínu na rezanie. Vzorky boli narezané na 5 um rezy pomocou mikrotómu pred experimentmi s farbením hematoxylínom a eozínom (H&E) a TRAcP. Zafarbené rezy sa skúmali a dokumentovali pomocou mikroskopu Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japonsko). 2.5. Analýza séra Koncentrácie vápnika (Ca) a fosforu (P) boli stanovené podľa inštrukcií súpravy navrhnutej Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Hladiny TRAcP-5b a RANKL v sére sa analyzovali pomocou súpravy TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Čína) a súpravy RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Čína).

CD so zbierkou chemikálií a vzoriek (č. 180801) bolo zakúpené od spoločnosti Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Čína) a identifikované profesorom Haibo Huangom zo školy Farmaceutické vedy, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Čína. Tablety estradiolvalerátu boli zakúpené od Bayer (Leverkusen, Severné Porýnie-Vestfálsko, Nemecko). Alfa modifikované minimálne esenciálne médium (-MEM) a fetálne bovinné sérum (FBS) boli získané od Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicilín/streptomycín a súprava na farbenie TRAcP boli získané od spoločnosti Solarbio (Peking, Čína). Rekombinantný myšací M-CSF a rekombinantný myšací RANKL boli získané od R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hydroxyapatitom potiahnuté platne boli zakúpené od Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Primárne protilátky pre NFATc1 a CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IKB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK a P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); a -aktín (CWBIO, Peking, Čína). Ostatné činidlá použité v tejto štúdii boli analytickej kvality a voda bola čistená systémom na čistenie vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. Extrakcia CDP CD sa rozomlelo na jemný prášok a trikrát sa zmiešalo s petroléterom, aby sa porazilo. Pevný zvyšok sa zozbieral filtráciou a potom sa vysušil pri teplote miestnosti. Polysacharidy boli extrahované z vopred upravených vzoriek trikrát vodou počas 2 hodín, zahustené, vyzrážané pridaním bezvodého etanolu na konečnú koncentráciu 80 percent (v/v) a uskladnené pri 4 ◦C počas 24 hodín. Precipitáty sa zhromaždili centrifugáciou pri 3000 otáčkach za minútu počas 20 min, rozpustili sa v destilovanej vode a purifikovali (odstránenie voľných proteínov) pomocou metódy Sevag (Zhao a kol., 2019). Získané polysacharidy sa dialyzovali, sušili a skladovali až do ďalšieho použitia. Okrem toho výsledky chemického zloženia ukázali, že celkový obsah cukru, kyseliny urónovej, sulfátu a bielkovín v CDP bol 67,63 ± 0,98 percenta, 21,05 ± 0,49 percenta, 1,90 ± 0,24 percenta a 8,81 ± 0,36 percenta. Monosacharidové zloženie a infračervená analýza s Fourierovou transformáciou CDP boli znázornené na doplnkovom obrázku 1 a 2. 2.3. Myší model osteoporózy vyvolanej OVX Všetky experimenty na zvieratách boli schválené Výborom pre etiku zvierat Guangzhou University of Chinese Medicine (schválené SYXK 2019-0202). Tridsaťtýždňovým samiciam myší C57BL/6 dodalo experimentálne zvieracie centrum Guangzhou University of Chinese Medicine. Po aklimatizácii počas 1 týždňa bola jednej skupine myší vykonaná falošná operácia (Sham skupina), zatiaľ čo zvyšné myši boli podrobené operácii ovariektómie (OVX skupina). Po operácii sa myši nechali 1-týždeň zotavovať. Potom boli úspešne modelované myši náhodne rozdelené do 5 skupín, so 6 myšami na skupinu: (1) simulovaná skupina: liečená destilovanou vodou, (2) skupina OVX: liečená destilovanou vodou, (3) skupina OVX plus E2 (E2) : liečení 0,13 mg/kg tabletami estradiolvalerátu, (4) OVX plus CDP skupina s nízkou dávkou (CDP-L): liečená 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP skupina s vysokou dávkou (CDP H): liečená so 600 mg/kg CDP. Destilovaná voda, E2 alebo CDP sa podávali sondou raz denne. Všetky myši boli usmrtené po 12- týždni liečby (obr. 1A). Maternice sa odobrali a zvážili a ľavé holenné kosti sa odobrali na následné vyšetrenia. Vzorky plnej krvi boli odobraté a centrifugované pri 5000 ot./min. počas 15 minút pri 4 °C. Sérové ​​supernatanty sa odsali a skladovali pri -80 °C až do ďalšej analýzy. 2.4. Analýza mikropočítačovou tomografiou (mikro-CT) a kostná histomorfometria Ľavé holenné kosti boli fixované 4% paraformaldehydom počas 48 hodín a následne umiestnené do centrifugačných skúmaviek obsahujúcich normálny fyziologický roztok. Fixované vzorky boli skenované prístrojom Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgicko) s použitím nasledujúcich nastavení: napätie, 80 kV; prúd zdroja, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; veľkosť pixelov, 9,76 μm; a rotačný krok, 0,6◦. Niekoľko parametrov trabekulárnej kosti, vrátane kostnej minerálnej hustoty (BMD), objemovej frakcie kosti (BV/TV), povrchu kosti na celkový objem (BS/TV), trabekulárneho čísla (Tb. N) a rozstupu trabekulárnej kosti (Tb. Sp ) boli merané pomocou softvéru CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trojrozmerné obrázky sa generovali pomocou softvéru CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Po mikro-CT analýze boli ľavé holenné kosti dekalcifikované v 14 percentnom roztoku EDTA a zaliate do parafínu na rezanie. Vzorky boli narezané na 5 um rezy pomocou mikrotómu pred experimentmi s farbením hematoxylínom a eozínom (H&E) a TRAcP. Zafarbené rezy sa skúmali a dokumentovali pomocou mikroskopu Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japonsko). 2.5. Analýza séra Koncentrácie vápnika (Ca) a fosforu (P) boli stanovené podľa inštrukcií súpravy navrhnutej spoločnosťou Nanjing

Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Hladiny TRAcP{{0}}}ba RANKL v sére sa analyzovali pomocou súpravy TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Čína) a súpravy RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Čína) , resp. 2.6. In vitro test osteoklastogenézy BMM boli izolované z holennej kosti a stehennej kosti 6-týždňových samíc myší C57BL/6. Izolované bunky sa kultivovali v -MEM médiu obsahujúcom 25 ng/ml M-CSF, 10 percent FBS a 1 percento penicilín/streptomycín. Po dosiahnutí konfluencie boli BMM (1 x 104 bunky/jamka) nasadené na 96-jamkové platne a ošetrené CDP v prítomnosti 50 ng/ml RANKL. Médium a CDP sa vymieňali každé 2 dni. Po 7 dňoch boli bunky fixované 4 percentami paraformaldehydu a zafarbené na prítomnosť stopy. Počet osteoklastov, definovaných ako TRAcP pozitívne bunky s tromi alebo viacerými jadrami, bol spočítaný a dokumentovaný pomocou svetelného mikroskopu. 2.7. Test bunkovej proliferácie BMM (1 x 104 buniek/jamka) sa naočkovali na 96-jamkovú doštičku a inkubovali sa cez noc. Potom boli bunky ošetrené rôznymi koncentráciami CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 a 40 ug/ml) počas 48 hodín. Bunková konfluencia bola detegovaná a analyzovaná pomocou IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), dlhodobého dynamického zobrazovacieho systému živých buniek v reálnom čase. 2.8. Skúška resorpcie hydroxyapatitu BMM (1 x 104 buniek/jamka) sa naočkovali na doštičku potiahnutú hydroxyapatitom, ošetrili CDP v uvedených koncentráciách (0, 5 a 10 ug/ml) a kultivovali v kompletnom -MEM obsahujúcom 25 ng/ ml M-CSF a 50 ng/ml RANKL. Po 7 dňoch sa bunky premyli 10 percentným bieliacim roztokom, aby sa odstránili zložky buniek. Obrazy oblastí resorpcie hydroxyapatitu boli zachytené pomocou IncuCyte ZOOM® a analyzované pomocou softvéru ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. Izolácia RNA a analýza kvantitatívnej PCR s reverznou transkripciou (RT-qPCR) v reálnom čase. CDP v rôznych koncentráciách (0, 5 a 10 ug/ml) počas 5 dní. Celková RNA sa izolovala z buniek alebo kostného tkaniva myší pomocou činidla TRIzol (Sigma Aldrich). Komplementárna DNA sa syntetizovala z 2 ug celkovej RNA s použitím súpravy na reverznú transkriptázu (TransGen Biotech, Peking, Čína). Reakcie RT-qPCR boli pripravené s použitím PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) a detegované systémom ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Parametre cyklovania pre PCR boli nastavené nasledovne: 95 ◦C počas 5 minút, potom nasledovalo 40 cyklov 95 ◦C počas 15 s a 60 ◦C počas 30 s. Použité špecifické priméry sú uvedené v tabuľke 1 a množstvo každého cieľového génu bolo normalizované na GAPDH (vnútorná kontrola).

2.10. Analýza Western blot BMM (5 x 105 buniek/jamka) sa naočkovali na 6-jamkovú doštičku. Pre krátkodobé experimenty boli bunky preinkubované s rôznymi koncentráciami CDP (0, 5 a 10 µg/ml) počas 1 hodiny a potom ošetrené 5{{ 58}} ng/ml RANKL počas 30 min. Počas dlhého časového priebehu boli bunky stimulované 50 ng/ml RANKL v dňoch 3, 5 a 7 v prítomnosti CDP (0, 5 a 10 ug/ml). Celkové proteíny boli extrahované použitím RIPA lyzačného pufra (CWBIO). Proteíny boli oddelené pomocou 10 percent SDS-PAGE a prenesené na PVDF membrány. Membrány boli blokované 5 percentným odstredeným mliekom pri izbovej teplote počas 2 hodín, inkubované s primárnymi protilátkami cez noc pri 4 °C a potom so zodpovedajúcimi sekundárnymi protilátkami počas 1,5 hodiny. Membrány boli vyvinuté s použitím ECL činidiel (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) a snímky boli urobené pomocou Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Čína). 2.11. Detekcia translokácie NFATc1 pomocou imunofluorescenčného testu BMM boli naočkované na 12-krycie sklíčka jamiek, stimulované RANKL a M-CSF a ošetrené 10 ug/ml CDP počas 5 dní. Bunky boli fixované 4% paraformaldehydom počas 15 minút, premyté trikrát PBS a permeabilizované 0,1% Tritonom X-100 počas 10 minút. Bunky sa zmiešali s 10 percentným kozím sérom (CWBIO) a inkubovali sa 2 hodiny. Následne boli bunky inkubované s primárnou protilátkou cez noc pri 4 °C a potom s kozou anti-myšou sekundárnou protilátkou Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, USA) v tme počas 1 hodiny. Krycie sklíčka sa premyli PBS, vložili do Prolong Gold Antifade Reagent so 4′, 6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI) (Solar) a skontrolovali pomocou Zeiss LSM 800 s konfokálnym mikroskopom Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko). 2.12. Štatistická analýza Všetky experimentálne údaje sa analyzovali pomocou štatistického softvéru SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Údaje pre štúdie na zvieratách a bunkách sú vyjadrené ako priemer ± SEM a priemer ± SD. Výsledky sú pomocou jednosmernej analýzy rozptylu alebo Studentovho t-testu. Hodnoty p < 0,05="" sa="" považovali="" za="" štatisticky="" významné.="" 3.="" výsledky="" 3.1.="" cdp="" bráni="" ovx-indukovanému="" úbytku="" kostnej="" hmoty="" in="" vivo="" použili="" sme="" myšací="" model="" ovx-indukovanej="" osteoporózy="" na="" skúmanie="" účinkov="" liečby="" cdp="" na="" osteoporózu="" in="" vivo.="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" sham="" sa="" telesná="" hmotnosť="" myší="" ovx="" významne="" zvýšila,="" zatiaľ="" čo="" index="" maternice="" sa="" znížil,="" čo="" naznačuje,="" že="" model="" osteoporózy="" bol="" skonštruovaný="" úspešne="" (obr.="" 1b="" a="" d).="" mikro-ct="" analýza="" holenných="" kostí="" v="" skupine="" ovx="" ukázala="" rozsiahlu="" stratu="" kostnej="" hmoty.="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" ovx="" sa="" počet="" kostných="" trámcov="" zvýšil="" v="" skupine="" cdp-l,="" zatiaľ="" čo="" nárast="" v="" skupinách="" cdp-h="" a="" e2="" bol="" výraznejší="" a="" trámce="" v="" posledných="" dvoch="" skupinách="" zhrubli="" a="" medzera="" sa="" zmenšila="" (="" obr.="" 1c).="" kvantitatívna="" analýza="" potvrdila,="" že="" niekoľko="" kostných="" histomorfometrických="" parametrov,="" vrátane="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" a="" tb.="" n="" mal="" významne="" zvýšené="" hodnoty,="" zatiaľ="" čo="" tb.="" sp="" vykazoval="" znížené="" hodnoty="" v="" skupine="" cdp-h="" (obr.="" 1e="" a="" f).="" jeho="" patologické="" vyšetrenie="" pomocou="" farbenia="" h&e="" odhalilo,="" že="" počet="" kostných="" trámcov="" v="" skupinách="" cdp-h="" a="" e2="" bol="" významne="" vyšší="" ako="" počet="" v="" skupine="" ovx,="" zatiaľ="" čo="" v="" skupine="" cdp-l="" nedošlo="" k="" žiadnemu="" významnému="" zlepšeniu="" (obr.="" 1g).="" okrem="" toho="" farbenie="" tracp="" ukázalo,="" že="" počet="" osteoklastov="" sa="" výrazne="" zvýšil="" v="" skupine="" ovx,="" ale="" znížil="" sa="" v="" skupinách="" cdp-h="" a="" e2="" (obr.="" 1h).="" skupiny="" cdp-l,="" cdp-h="" a="" e2="" vykazovali="" inhibíciu="" ovx-indukovaného="" zvýšenia="" obsahu="" p,="" ale="" zvýšili="" obsah="" ca="" v="" krvnom="" sére.="" markery="" kostnej="" absorpcie,="" rankl="" a="" tracp-5b,="" vykazovali="" klesajúci="" trend="" v="">

v skupine bez štatistického rozdielu, zatiaľ čo v skupine CDP-H boli významne znížené (obr. 1I). Ďalej sme skúmali účinok CDP na expresiu génov osteoklastových markerov v kostných tkanivách pomocou RT-qPCR. Hladiny mRNA NFATc1, Acp5, Mmp9 a CTSK v skupine OVX boli významne vyššie ako hladiny v skupine Sham. Skupiny CDP-H preukázali zníženie hladiny mRNA NFATc1, Acp5 a CTSK o 1.74-, 1.{12}} a 2.{14}}krát v porovnaní so skupinou OVX. (Obr. 1J). 3.2. CDP potláča RANKL-indukovanú osteoklastogenézu in vitro Sledovali sme bunkovú proliferáciu BMM ošetrených CDP pomocou dlhodobého dynamického zobrazovacieho analyzátora živých buniek v reálnom čase. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa konfluencia buniek v skupinách liečených CDP pri dávke nezmenila<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 ug/ml CDP vykazovalo významne zníženú veľkosť a počet (obr. 2B a C). Tieto výsledky ukázali, že CDP účinne inhibuje očakávanú osteoklastogenézu indukovanú RANKL bez ovplyvnenia životaschopnosti buniek. 3.3. CDP inhibuje RANKL-indukovanú aktivitu osteoklastickej resorpcie a expresiu génu špecifickú pre osteoklasty Ďalej sme určili účinky liečby CDP na aktivitu kostnej resorpcie osteoklastov s použitím platní potiahnutých hydroxyapatitom. Kostná resorpcia je hlavnou funkciou a štandardom na meranie aktivity a schopnosti osteoklastov (Novack & Faccio, 2011). Výsledky ukázali, že CDP môže významne znížiť kostnú resorpčnú oblasť osteoklastov spôsobom závislým od dávky, čo naznačuje, že CDP inhibuje aktivitu kostnej resorpcie indukovanú RANKL (obr. 3A a B). Najmä plocha resorpcie osteoklastov kosti sa znížila na približne 6,3 percenta po liečbe 10 ug/ml CDP. Aby sme lepšie zistili prekážku CDP pri osteoklastogenéze, merali sme hladiny transkripcie génov súvisiacich s osteoklastom. Bez liečby CDP indukcia s RANKL podporovala expresiu génov NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 a Mmp9. Naopak, súčasná aplikácia CDP a RANKL signifikantne downregulovala týchto päť génov (obr. 3C a D).

3.4. CDP inhibuje aktiváciu NFATc1 indukovanú RANKL Farbenie TRAcP odhalilo, že liečba CDP významne znížila očakávané zvýšenie počtu zrelých osteoklastov po stimulácii RANKL počas 3–7 dní (obr. 4A a B). Ďalej sme skúmali, či liečba CDP môže účinne narušiť diferenciáciu osteoklastov inhibíciou expresie NFATc1. Výsledky ukázali, že NFATc1 bol vysoko exprimovaný po stimulácii RANKL počas 5 dní, čo bolo významne inhibované po liečbe CDP (obr. 4C a D). Okrem toho liečba CDP potlačila hladiny expresie CTSK, proteínu potrebného na normálnu tvorbu a funkciu osteoklastov (Bossard et al., 1996) (obr. 4E a F). Vybrali sme bodovú reprezentáciu stimulácie RANKL počas 5 dní, aby sme ďalej skúmali účinok liečby 10 ug / ml CDP na translokáciu NFATc1. Ako sa očakávalo, liečba CDP významne inhibovala RANKL-indukovanú NFATc1 jadrovú translokáciu (obr. 4G a H).

Obr. 4. CDP potláča aktiváciu NFATc1 indukovanú RANKL. (A) BMM boli nasadené na 6-jamkovú doštičku a stimulované RANKL a M-CSF v prítomnosti CDP (0, 5 a 10 µg/ml) pre uvedené dni. Reprezentatívne obrázky ukazujúce TRAcP-pozitívne viacjadrové bunky. Zväčšenie, ×100. Mierka {{10}}} μm. (B) Kvantifikácia TRAcP-pozitívnych viacjadrových buniek (jadrá väčšie alebo rovné 3). (CF) Western blot analýza expresie proteínov NFATc1 a CTSK v BMM stimulovaných M CSF a RANKL počas 3–7 dní v prítomnosti CDP. (G) BMM boli ošetrené 10 ug/ml CDP a stimulované M-CSF a RANKL počas 5 dní, potom imunofarbené pomocou NFATc1 (zelená) a DAPI (modrá) a pozorované pomocou konfokálneho mikroskopu. Zväčšenie, ×200. Mierka=20 μm. (H) Intenzita fluorescencie sa analyzovala pomocou Image-Pro Plus. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" vs.="" kontrolná="" skupina;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" vs.="" skupina="" rankl.="" 3.5.="" cdp="" inhibuje="" rankl-indukovanú="" aktiváciu="" signálnych="" dráh="" nf-kb="" a="" mapk="" na="" objasnenie="" mechanizmov="" zapojených="" do="" cdp-indukovanej="" inhibície="" diferenciácie="" osteoklastov="" sme="" skúmali="" vplyv="" liečby="" cdp="" na="" dráhy="" nf-kb="" a="" mapk.="" výsledky="" ukázali,="" že="" liečba="" cdp="" mala="" supresívne="" účinky="" na="" degradáciu="" ikb="" a="" fosforyláciu="" p65="" v="" závislosti="" od="" dávky="" (obr.="" 5a="" a="" b).="" fosforylácia="" troch="" členov="" rodiny="" mapk,="" konkrétne="" kináza="" regulovaná="" extracelulárnym="" signálom="" (erk),="" c-jun="" n-terminálna="" kináza="" (jnk)="" a="" p38,="" boli="">

Diskusia

Osteoporóza je bežné a degeneratívne ochorenie kostí. V súčasnosti existuje veľa liečiv chemickej syntézy používaných v klinickej liečbe osteoporózy, ako je estrogén a bisfosfonát. Dlhodobé užívanie týchto liekov však postupne oslabí klinickú účinnosť a dokonca spôsobí mnoho závažných vedľajších účinkov vrátane zvýšeného rizika rakoviny vaječníkov, prsníka a endometria a osteonekrózy čeľuste (Beral, 20}03 Khan a kol., 2009; Lacey a kol., 2002). Zatiaľ čo v tejto štúdii sme vybrali CDP, účinnú zložku extrahovanú z CD, ako terapeutické činidlo a preukázali sme, že CDP má ochranný účinok proti strate kostnej hmoty u OVX myší a inhibuje tvorbu a funkciu osteoklastov indukovanú RANKL. Medzitým podľa teórie tradičnej čínskej medicíny „obličky riadia kosť“ sa strata kostnej hmoty pripisuje nedostatkom obličiek. Ukázalo sa, že CD ako liečivá potravina tonizujúca obličky poskytuje účinnú liečbu osteoporózy (Fan a kol., 2019; Jiang, Wang, Li a Zhang, 2016). CDP extrahovaný z tejto prírodnej byliny je teda lepšou a bezpečnejšou možnosťou lieku. V súčasnosti je myšací model OVX klasickým modelom postmenopauzálneho úbytku kostnej hmoty u žien, ktorý skúma príčiny úbytku kostnej hmoty a vykonáva intervenciu (Wehrle et al., 2015). V súlade s tým sme vykonali bilaterálnu ooforektómiu na samiciach myší C57BL / 6J, aby sme vytvorili model osteoporózy. V predchádzajúcich štúdiách boli dávky CDP podávané zvieratám 50–200 mg/kg (nízka dávka) a 1800 mg/kg (vysoká dávka) (Guo a kol., 2016; Zhang a kol., 2018). Tu bola vysoká dávka CDP u myší 600 mg/kg, čo bolo založené na vysokej klinickej dávke 30 g CD v odvare; je teda podobná súčasnej klinickej praxi. V tejto štúdii liečba CDP významne inhibovala OVX-indukovaný prírastok telesnej hmotnosti, čo je bežný jav pozorovaný u OVX myší (Davis et al., 2019). Použitím mikro-CT skenovania a 3D rekonštrukcie sme zistili, že OVX viedlo k výraznému zníženiu BMD, BV/TV, BS/TV a Tb.N a zvýšeniu Tb.Sp, zatiaľ čo liečba CDP zvrátila všetky tieto zmeny. . Najmä v porovnaní s pozitívnym liekom by CDP mohla výrazne zlepšiť BMD myší OVX, čo je dôležitý marker kvality kostí a používa sa na vyjadrenie stupňa osteoporózy (Fuggle et al., 2019), čo naznačuje, že CDP má výhodu. oproti pozitívnemu lieku pri zlepšovaní BMD. Okrem toho histologické výsledky ukázali, že liečba CDP by mohla znížiť zvýšené množstvo TRAcP-pozitívnych osteoklastov indukovaných OVX. Tieto výsledky naznačujú, že podávanie CDP účinne zmiernilo stratu kostnej hmoty pri osteoporóze indukovanej OVX, pravdepodobne inhibíciou tvorby osteoklastov. V súlade s vyššie uvedenými výsledkami sme zistili, že CDP v závislosti od dávky inhibuje RANKL-indukovanú tvorbu a funkciu osteoklastov, zatiaľ čo CDP má malý účinok na proliferáciu prekurzorových buniek osteoklastov indukovanú M-CSF v našich in vitro experimentoch. Väzba RANKL a RANK môže viesť k náboru TRAF6 a následnej aktivácii niekoľkých downstream signálnych dráh, ako sú NF-KB a MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). Signálna dráha NF-κB hrá dôležitú úlohu v regulácii diferenciácie osteoklastov a umlčanie génov kódujúcich kľúčové proteíny v tejto dráhe môže viesť k abnormálnemu vývoju kostí (Leibbrandt & Penninger, 2008). Je dobre známe, že NF-KB je prítomný v cytoplazme nestimulovaných buniek v komplexe s IkB, ale po stimulácii RANKL rýchlo vstupuje do jadra (Boyle et al., 2003). Uvoľnený IκB sa potom rýchlo degraduje, zatiaľ čo NF-κB aktivuje špecifickú génovú transkripciu, čím podporuje diferenciáciu, dozrievanie a apoptózu osteoklastov (Abdelmagid et al., 2015). V tejto štúdii výsledky ukázali, že liečba CDP potlačila aktiváciu signálnej dráhy NF-KB indukovanú RANKL, čo dokazuje inhibícia degradácie IκB a fosforylácia p65 v závislosti od dávky, čo môže zahŕňať jeho antiosteoklastogénny účinok . Okrem toho sa signálna dráha MAPK, vrátane ERK, JNK a p38, úzko podieľa na osteoklastogenéze indukovanej RANKL (Li et al., 2002). Okrem toho dominantné inhibítory p38 a JNK môžu zabrániť RANKL-indukovanej osteoklastogenéze (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), zatiaľ čo ERK hrá významnú úlohu v prežívaní osteoklastov (Miyazaki et al., 2000). Je dobre známe, že RANKL aktivuje signálnu dráhu MAPK zvýšením fosforylácie ERK, JNK a p38 (Mizukami et al., 2002). V našej štúdii sme preukázali, že CDP potlačil RANKL-indukovanú fosforyláciu kľúčových proteínov v signálnej dráhe MAPK. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že inhibícia aktivácie signálnych dráh NF-KB a MAPK prispieva k inhibičnému účinku CDP proti osteoklastogenéze. Aktivácia signálnych dráh NF-KB a MAPK podporuje expresiu niekoľkých kľúčových transkripčných faktorov, ako je bunkový onkogén fos, aktivačný proteín 1 a NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, dôležitý člen rodiny NFAT, sa podieľa na diferenciácii terminálnych osteoklastov ako hlavný transkripčný regulátor (Asagiri et al., 2005). Bolo hlásené, že embryonálne kmeňové bunky s deficitom NFATc{64}} sa nedokážu diferencovať na osteoklasty pod stimuláciou RANKL a ektopická expresia NFATc1 spôsobuje, že prekurzorové bunky podliehajú diferenciácii obchádzajúcou signalizáciu RANKL, čo naznačuje, že NFATc1 má rozhodujúcu úlohu v diferenciácia osteoklastov (Takayanagi et al., 2002). Výsledky našej štúdie ukázali supresívny účinok CDP na expresiu NFATc1 a jeho nasledujúceho proteínu CTSK. Je zaujímavé, že sme pozorovali, že hladina proteínovej expresie NFATc1 sa najprv zvýšila a potom znížila, pričom najvyššiu hladinu dosiahla 5. deň po stimulácii RANKL. To bolo v súlade s výsledkami Baek et al. (2014), ktorí pozorovali degradáciu NFATc1 indukovanú M-CSF počas neskorej fázy osteoklastogenézy prostredníctvom Cbl-indukovanej ubikvitinácie NFATc1 spôsobom závislým od Src kinázy. Výsledky imunofluorescenčného testu konzistentne podporovali inhibičný účinok CDP na aktiváciu transkripcie NFATc1. Okrem toho, gény špecifické pre osteoklasty, vrátane CTSK, Acp5, Mmp9 a Atp6v0d2, sú všetky regulované priamo NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), boli potlačené CDP. Tieto zistenia ilustrujú, že NFATc1 je cieľom inhibičného účinku CDP na signálne dráhy NF-KB a MAPK.

Záver

V súhrne sme extrahovali a purifikovali aktívny polysacharid z CD a preukázali sme, že CDP vykazuje ochranný účinok na osteoporózu indukovanú OVX a zmierňuje stratu kostnej hmoty potlačením aktivity a funkcie osteoklastov. Okrem toho môže CDP inhibovať diferenciáciu a funkciu osteoklastov indukovanú RANKL tým, že interferuje so signálnymi dráhami NF-KB a MAPK a následne ovplyvňuje aktiváciu NFATc1 po smere. Na záver, naše zistenia poskytujú základ pre rozšírenie a aplikáciu CDP pri liečbe osteoporózy.

Tento článok pochádza zo zoznamov obsahu dostupných na domovskej stránke časopisu ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff