Štúdia o čistote chemických profilov a metabolitov

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Zhe Li, Lkhaasuren Ryenchindorj, Bonan Liu, Ji Shi, Chao Zhang, Yue Hua, Pengpeng Liu, Guoshun Shan & Tianzhu Jia

Abstraktné

Východiská: Spracovanie čínskej materia medica je význačná a jedinečná farmaceutická technika v tradičnej čínskej medicíne (TCM) používaná na zníženie vedľajších účinkov a zvýšenie alebo dokonca zmenu terapeutickej účinnosti surových bylín. Za zvýšenú účinnosť liečivých rastlín sú primárne zodpovedné zmeny základných zložiek vyvolané optimalizovaným postupom spracovania. Ledvinovo-jangový povzbudzujúci účinok Cistancha deserticola (C. deserticola) dusenej na ryžovom víne bol silnejší ako surový C. deserticola (CD). Metódy: Bola vykonaná porovnávacia analýza pomocou UPLC-Q-TOF-MSE s informatickou platformou UNIFI na určenie vplyvu spracovania. Boli uskutočnené štúdie in vitro na charakterizáciu zložiek, ako ajmetabolityin vivo. Thechemickýzložky boli stanovené v CD a jeho spracovaných produktoch. Na vyhodnotenie variácií medzi nimi sa uskutočnili viacrozmerné štatistické analýzy, zatiaľ čo OPLS-DA sa použil na párové porovnanie. Výsledky: Výsledky tejto štúdie odhalili značné rozdiely vo fenyletanoidných glykozidoch (PhGs) a iridoidoch po spracovaní. Celkovo bolo v extraktoch CD a jeho spracovanom produkte zistených 97 zlúčenín. PhG, ktoré majú 4'-O-kafeoylovú skupinu v 8-O- -D-glukopyranozylovej časti, ako je akteozid, cistanozid C, kamneozid II, osmanthuzid, sa po spracovaní znížili, zatiaľ čo PhG s 6'-O- caffeoylová skupina v 8-0{12}}D-glukopyranozylovej časti, ako je izoacetozid, izocistanozid C, izokampneozid I, izomartynozid, najmä v skupine CD-NP. Zvýšila sa aj intenzita echinakozidu a cistanozidu B, ktorých štruktúra obsahuje 6'-0- -D-glukopyranozylovú skupinu. V štúdii in vivo bolo použitých 10 prototypových komponentov a 44metabolitysa detegovali v potkanej plazme, výkaloch a moči. Získané výsledky ukázali, že spracovanie vedie k značným odchýlkam vchemickýzložky CD a ovplyvňujú dispozíciu zlúčenín in vivo a metabolické procesy fázy II sú kľúčovými kaskádami každej zlúčeniny a väčšinymetabolitysú spojené s echinakozidom alebo akteozidom. Závery: Toto je prvý globálny porovnávací výskum surových a spracovaných CD. Tieto zistenia prispievajú k nášmu chápaniu vplyvu spracovania CD a poskytujú dôležité údaje pre budúce skúmanie účinnosti.

Štúdia pravdepodobnosti chemických profilov a metabolitov

Úvod

Spracovanie čínskej materia medica (CMM) preukázalo významnú použiteľnosť v klinickej praxi tradičnej čínskej medicíny (TCM) a už niekoľko storočí sa považuje za životaschopnú liečbu. Ide o unikátnu farmaceutickú technológiu, ktorá bola odvodená z teórie TCM. Po spracovaní výrazné rozdiely vo vzhľade,chemickýidentifikovali sa zložky, charakteristiky a medicínsky význam všetkých typov TCM, čo viedlo k predpokladu, že spracovanie by mohlo zlepšiť účinnosť alebo znížiť toxické účinky TCM.

Stovky rokov,Cistanche deserticola(Roucongrong v čínštine, CD) sa bežne používa v klinickej praxi TČM na doplnenie funkcií obličiek. Pomáha tiež pri zvlhčovaní čreva, čo vedie k uvoľneniu čreva [1].Cistanchebol prvýkrát zaznamenaný v ShenNongBencaoJing. Bežne sa vyskytuje v suchých a polosuchých biotopoch v celej Eurázii a severnej Afrike vrátane Iránu, Číny, Indie a Mongolska [2]. Spracovanie CD sa uskutočnilo parením s ryžovým vínom pri normálnom tlaku, čo je spôsob prípravy zdokumentovaný v čínskom liekopise (v čínštine Jiucongrong, ďalej len "CD-NP"). A parenie CD s ryžovým vínom pod vysokým tlakom je efektívnejšia metóda prípravy (ďalej len „CD-HP“) [3, 4]. Niekoľko štúdií odhalilo, že farmakologické účinky CD sú odlišné od jeho spracovaných produktov [5]. CD môže tonizovať jang obličiek a uvoľniť črevá, zatiaľ čo po naparení ryžovým vínom sa účinok doplnenia jangu obličiek zosilní. V našej skoršej štúdii sa zistilo, že CD-NP môže zvýšiť tonizáciu obličiek a podporiť jang a zmierniť účinok zvlhčovania čriev a defekácie [6,7,8]. V klinickej praxi sú spracované produkty najčastejšie používanou formou.

Doteraz analyzovalo niekoľko štúdiíchemickýkomponentov CD, po ktorej nasledovala izolácia a identifikácia viac ako 100 zlúčenín [9,10,11], ako sú fenyletanoidové glykozidy (PhG), iridoidy, lignany a oligosacharidy ako jeho hlavné chemické zložky. Tiež sa uvádza, že existuje mnoho farmakologických aktivít PhG vrátane imunomodulačných, neuroprotektívnych, hepatoprotektívnych, protizápalových, antioxidačných atď.[12,13,14]. Iridoidy majú protizápalové účinky [15, 16]. Skoršie štúdie tiež odhalili, že niektoré chemické zložky vykazovali počas spracovania odchýlky [17,18,19,20]. Na základe týchto správ možno predpokladať, že následné spracovanie, variácie vchemickýzloženie vedie k rôznym farmakologickým účinkom, ktoré je potrebné ďalej skúmať.

V súčasnej štúdii sa na porovnávaciu analýzu vykonala citlivá a účinná metóda, tj ultra vysokoúčinná kvapalinová chromatografia spojená s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) a na kvalitatívnu analýzu extraktov sa vykonali štúdie in vitro. CD, CD-NP a CD-HP na objasnenie ich chemických profilov. Vo všeobecnosti exogénnechemikálies vysokou expozíciou v cieľových orgánoch boli považované za účinné zložky. Preto sa u potkanov CD a jeho spracované produkty podávali orálne, po čom nasledovala ich charakterizácia. Existujúca štúdia po prvýkrát odhaľuje porovnávaciu štúdiu (in vitro aj in vivo) surového a spracovaného CD. Získané výsledky by rozšírili naše chápanie vplyvu spracovania CD, čo by mohlo byť užitočné pre ďalšie štúdie.

vlastnosti chemických profilov a metabolitov

Materiály a metódy

Materiály

Štandardné zlúčeniny ajugolu (180120) a 2'-acetylacetozidu (M0601AS) poskytla spoločnosť Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Čína). Cistanozid F (MUST-17022620), echinakozid (D1105AS), cistanozid A (M0906AS) a izoakteozid (M0106AS) poskytla spoločnosť Must (Sichuan China); akteozid (O0618AS), salidrozid (J0526AS), katalpol (S0728AS), genipozid (A0407AS) a kyselina geniposidová (MB6001-S) boli získané od Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Čína). Kyselina 8-epideoxylogánová (B31123) bola získaná od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Čína. Metanol a acetonitril boli MS triedy a boli získané od Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko. Kyselina metanová (CH202) v čistote pre HPLC bola poskytnutá spoločnosťou Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). Voda použitá v existujúcej štúdii bola spracovaná systémom Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Ryžové víno poskytla spoločnosť Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Čína).

Cistanch deserticola bol zozbieraný z Neimenggu wangyedicistancheCo. Ltd. Vzorky identifikoval prof. Yanjun Zhai (farmaceutická škola, Liaoning University of TCM). Vzorky boli predložené Univerzite tradičnej čínskej medicíny v Liaoningu.

Zvieratá

Samce potkanov Sprague-Dawley (stupeň SPF) s celkovou telesnou hmotnosťou 180–220 g poskytla spoločnosť Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, licenčné číslo: SCXK-2015–0001). Tieto potkany boli umiestnené v chovnej miestnosti s dobre udržiavanou teplotou a vlhkosťou, tj 20-26 stupňov, 50-70 percent počas jedného týždňa. Potkany boli pred experimentom kŕmené obvyklým laboratórnym jedlom a vodou. Zvieratá hladovali cez noc, avšak pred experimentom bola poskytnutá voda ad libitum. Potkany boli popravené 10 percentným anestetikom chloralhydrátu. Inštitucionálny výbor pre etiku zvierat v provincii Liaoningskej nemocnice čínskej medicíny schválil všetky experimentálne protokoly (25. 3. 2019, 2019015).

Príprava CD, CD-NP a CD-HP extraktu

CD-NP, CD-HP boli spracované z rovnakej šarže Cistanch deserticola. Na prípravu CD-NP sa suché kúsky CD (hrúbka 5 mm, 100 g) zvlhčili ryžovým vínom (30 ml) a dusili sa v pare pri 100 stupňoch počas 16 hodín, po čom nasledovalo sušenie pri 55 stupňoch v sušiarni. Zatiaľ čo CD-HP sa pripravil infiltráciou suchých kúskov CD (hrúbka 5 mm, 100 g) s ryžovým vínom (30 ml), nasledovalo naparovanie pri 1,25 atmosférickom tlaku počas 4 hodín. a potom sa suší v sušiarni pri 55 stupňoch.

V 100 ml odmernej banke sa jeden gram prášku preosial cez sito č. 4, potom sa pridalo 50 percent metanolu (50 ml) a potom sa tesne prikryl a premiešal. Táto zmes sa odvážila a nasledovala polhodina. macerácia. Po macerácii sa zmes podrobila ultrazvuku (výkon 250 W, frekvencia 35 kHz) počas 40 minút, nasledovalo ochladenie a opätovné váženie. Strata hmotnosti bola doplnená 50 percentným metanolom, riadne premiešaná a ponechaná stáť, nasledovala filtrácia supernatantu a potom bol získaný filtrát použitý ako testovací roztok.

MSE analýza aktívnych zložiek

Príprava štandardných látok: tubulozid-A (3.02 mg), echinakozid (3.00 mg), 2'-acetylakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cistanozid-F (2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalpol (2,39 mg), kyselina geniposidová (2,56 mg) a kyselina 8-epideoxylogánová (2,34 mg) sa pridali do 10 ml odmernej banky, pridal sa konštantný objem metanolu podľa mierky, konfigurovaný do zodpovedajúceho koncentračného referenčného roztoku. Každý zo 100 ul bol konfigurovaný do zmiešaného referenčného roztoku.

Podmienky analýzy MS: Hodnota hmotnosti bola pred experimentom korigovaná a bol použitý režim záporných iónov. Rozsah hmotnosti bol 50–1200 Da a vzorka bola vstreknutá cez prietokové vstrekovacie čerpadlo. Rýchlosť kužeľa bola 100 l/h, prietok rozpúšťadla bol nastavený na 800 l/h. Napätie kapiláry a kužeľa bolo podľa toho pevne nastavené na 2500 a 40 V. Teplota zdroja iónov a rozpúšťacieho plynu bola 100 stupňov a 400 stupňov a frekvencia získavania signálu bola 0,5 S-1.

vlastnosti chemických profilov a metabolitov

UPLC-Q-TOF-MSE analýza CD extraktu

Chromatografické vyhodnotenie sa uskutočnilo v systéme Waters ACQUITY I-CLASS UPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Vrátane kolóny ACQUITY UPLC® BEH C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilná fáza pozostávala z vody s 0,1 percenta kyseliny mravčej (A) a acetonitrilu s obsahom 0,1 percenta kyseliny mravčej (B), elučné podmienky boli nasledovné: 97 percent až 85 percent A (0–5 minút), 85 percent až 75 percent A (5–15 minút), 75 percent až 65 percent A (15–16 minút), 65 percent až 55 percent A (16–18 minút) . Prietok bol 0,3 ml min-1, zatiaľ čo teplota miestnosti automatického vzorkovania a kolóny bola 30 stupňov a 8 stupňov oddelene. Objem injekcie bol 1,0 ul.

Vyhodnotenie hmotnostnej spektrometrie sa uskutočnilo pomocou Waters XEVO G{{0}}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), ktorý obsahuje zdroj ESI. Prietok plynného dusíka bol pevne stanovený na 800 l·h-1 s teplotou 400 stupňov, teplota zdroja bola pevne stanovená na 100 stupňov a kužeľový plyn bol nastavený na 50 l h-1. Napätie kužeľa a kapiláry bolo podľa toho upravené na 40 a 2000 V. Energia kolízie rampy sa použila v rozsahu 20–30 V. Údaje s ťažiskom všetkých vzoriek sa získali od 50 do 1200 Da, s 5-časom skenovania 0,5 s počas doby analýzy 10 minút . Na overenie presnosti hmotnosti sa použil LockSpray TM. [M–H]− ión leucín enkefalínu (prietok infúzie 200 pg·μL−1 10 μL min−1) pri m/z 554,2615 sa použil ako záchytná hmota. Na presnú hmotnosť, zloženie prekurzorových iónov a výpočet fragmentových iónov sa použil softvér MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA).

Analýza údajov na platforme Masslynx

Okrem toho bola na základe literatúry vytvorená interná knižnica obsahujúca názov zlúčeniny, jej štruktúru a molekulový vzorec (v mol.). Všetky zlúčeniny boli zaznamenané v špeciálnej šablóne, vyrobenej v Exceli. Okrem toho boli na lokálnom počítači uložené aj súbory mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) a súbory Excel všetkých jednotlivých štruktúr zlúčenín. Zavedený excelový hárok s dôležitými údajmi bol priamo importovaný do vedeckej knižnice v UNIFI.

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Veľká Británia bola použitá na hodnotenie štrukturálnych charakteristík, najmä pre charakteristické fragmenty a MS fragmentáciu. Pre detekciu 2D vrcholu bola nastavená minimálna oblasť píku 500. Počas odhaľovania 3D vrcholov bola zvolená nízka energetická vrcholová intenzita viac ako 300 impulzov a zvýšená energetická vrcholová intenzita viac ako 80 impulzov. Zistilo sa, že chyba hmotnosti bola pre známe zlúčeniny až ± 10 ppm a tolerancia retenčného času bola nastavená v rozsahu ± 0,1 min. Vybrali sme negatívne adukty obsahujúce –H plus HCOOH. Spracovanie nespracovaných údajov získaných z MS sa uskutočňovalo prostredníctvom zjednodušeného softvéru UNIFI na rýchle určeniechemickýkomponenty, ktoré spĺňali štandardy vlastnej databázy a vlastnej knižnice tradičnej medicíny.

Ďalej na overeniechemickýštruktúre každej cieľovej zlúčeniny sa izoméry rozlíšili podľa ich charakteristických MS fragmentačných vzorov, ktoré boli odhalené v uvedených štúdiách, a porovnaním retenčných časov referenčných štandardov.

Metabolomická analýza založená na viacrozmernej štatistickej analýze

Pred spracovaním nespracovaných údajov sa nastavili parametre, ako napríklad hmotnosť v rozsahu od 150 do 1200 Da, rozsah retenčného času (0 až 20 minút), prahová intenzita ( 2 000 impulzov), tolerancia hmotnosti, tj 5 mDa, kým hmotnostné a retenčné časové okno bolo 0,20 min a 0,05 Da, v danom poradí. V nasledujúcom zozname databázy boli identifikátorom iónov páry RT-m/z vzhľadom na ich elučné časy. Rovnaké hodnoty pre RT a m/z v rôznych dávkach vzoriek sa považovali za rovnakú zlúčeninu.

Uskutočnila sa viacrozmerná štatistická analýza na vyhodnotenie účinných biomarkerov, ktoré značne prispeli k variáciám medzi rôznymi skupinami. Počas analýzy bola použitá analýza hlavných komponentov (PCA) na označenie maximálnych rozdielov a rozpoznávanie vzorov na získanie prehľadu a klasifikácie. OPLS-DA je modelovací nástroj, ktorý poskytuje vizualizáciu prediktívneho zaťaženia komponentov OPLS-DA na pomoc pri vyhodnocovaní modelu. Variabilná dôležitosť pre projekciu (VIP) bola použitá na hodnotenie hodnotenia rôznych komponentov, respmetabolitywith VIP values >1.{1}} a P-hodnota< 0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r2/q2="" values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

vlastnosti chemických profilov a metabolitov

Pokusy na zvieratách

Potkany boli náhodne rozdelené do štyroch skupín (n = 6 pre každú skupinu), po ktorých nasledovalo orálne podávanie rôznych extraktov: (1) Slepá kontrolná skupina: potkanom sa podával normálny fyziologický roztok (2 ml/100 g); (2) CD skupina: potkanom bol podaný CD extrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP skupina: potkanom bol podaný CD-NP extrakt (2 ml/100 g); (4) Skupina CD-HP: potkanom sa podal extrakt CD-HP (2 ml/100 g). Ďalšia kategorizácia všetkých skupín sa uskutočnila do troch podskupín pre plazmu, moč a výkaly. O dve hodiny neskôr sa každému potkanovi orálne podalo rovnaké a rovnaké množstvo extraktov.

Po podaní sa odber vzoriek krvi uskutočnil o 1.0 h, 2.0 h a 4.0 h do heparinizovaných 1,5 ml polyetylénových skúmaviek (z orbitálnych žíl) s následnou centrifugáciou (pri 4500 ot./min.) všetkých vzoriek počas 15 minút.

Pre vzorky moču a výkalov sa potkany držali v metabolických klietkach a potom sa 24 hodín po podaní uskutočňoval odber vzoriek moču a výkalov. Odstreďovanie vzoriek moču sa uskutočňovalo pri 45 00 otáčkach za minútu počas 15 minút, zatiaľ čo vzorky výkalov sa sušili v tieni, rozomleli na prášok, potom sa odobralo 0,2 g a pridalo sa do 0,5 ml fyziologického roztoku roztokom, ultrazvukom počas 5 minút a centrifugáciou pri 12,000 otáčkach za minútu počas 15 minút. Všetky biologické vzorky sa až do analýzy udržiavali pri -80 stupňoch.

Príprava biologických vzoriek

Pridanie vzoriek plazmy, moču a výkalov sa uskutočnilo s 3 objemami metanolu, po čom nasledovalo vírenie počas 3 minút. Potom sa uskutočnila centrifugácia (pri 12, 000 rpm) zmesí počas 10 minút, nasledovalo prenesenie supernatantu do EP skúmavky a potom vysušenie dusíkom pri 37 stupňoch. Ďalej sa uskutočnilo pridanie 200 ul roztoku HCN-H2O (50 percent). Potom sa vortex použil na miešanie (1 minúta), po ktorom nasledovala centrifugácia (pri 12, 000 otáčkach za minútu) počas 5 minút. Supernatant (5 ul) ošetrených vzoriek sa vstrekol do systému UPLC-Q-TOF-MSE.

Podmienky kvapalinovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie

Analýza premetabolitybola tiež vykonaná prístrojom Waters UPLC cez rozhranie ESI. Separácie sa uskutočnili pomocou kolóny Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), mobilná fáza bola 0,1 % kyselina mravčia (A): Acetonitril (B), podmienky gradientovej elúcie boli 0–3 minúty (99,8 percent → 98 percent A), 3–5 minút (98 percent → 95 percent A), 5–8 minút (95 percent → 90 percent A), 8 –12 minút (90 percent → 85 percent A), 12–17 minút (85 percent → 70 percent A), 17–22 minút (70 percent → 60 percent A), 22–23 minút (60 percent → 58 percent A) , 23–25 minút (58 percent A), 25–32 minút (58 percent → 45 percent A) a 32–37 minút (45 percent → 35 percent A), prietok 0,4 ml min-1. Teplota kolóny a vzorkovacej miestnosti bola nastavená na 40 stupňov a 8 stupňov. Boli použité vyššie uvedené podmienky hmotnostnej spektrometrie.

Stratégia systematickej analýzy metabolitov v biologických vzorkách

Na spracovanie údajov bol použitý softvér UNIFI (1.8.2). Na identifikáciu účinných metabolitov bola použitá funkcia Binary Compare. Vyhodnotené metabolity sa nenachádzali v ekvivalentnej kontrolnej vzorke alebo existujú s nízkou intenzitou iónov. Prah relatívnej intenzity bol nastavený na 3 alebo 5 ametabolityktoré splnili podčiarknuté kritériá. Bežné a predvídateľnémetabolityboli potom určené EIC. Na vyhľadávanie dvojfázových metabolitov bola použitá funkcia NLF. Napríklad v softvéri UNIFI je možné nastaviť parametre na 176,0321 na vyhľadávanie možných konjugátov kyseliny glukurónovej. Po spracovaní môže byť v metóde nastavená alebo identifikovaná neutrálna strata. MassFragment sa použil na určenie alebo charakterizáciu detegovanéhometabolity' štruktúra, funkcia spektrálnej interpretácie UNIFI je hlavnou funkciou používanou na analýzu sekundárnej fragmentácie rodičovských komponentov. Túto funkciu možno použiť na rýchle overenie cesty fragmentácie, či je to rozumné.

vlastnosti chemických profilov a metabolitov

Výsledky

Pravidlo hmotnostnej fragmentácie fenyletanoidových glykozidov a iridoidov

Hlavné sú fenyletanoidové glykozidychemickýzložky CD. Odobrali sa štandardné roztoky izoakteozidu, cistanozidu F, tubulozidu A, echinakozidu, akteozidu a 2'-aktylakteozidu, po ktorých nasledovalo poskytnutie inej úrovne kolíziových energií (tabuľka 1) a potom sa získali zodpovedajúce mapy MS2 (obr. 1). .

Obr. 1 Hmotnostný spektrogram a štiepna dráha fenyletanoidových glykozidov. A izoakteozid; B cistanozid F; C tubulozid A; D echinacteozid; E akteozid; F 2'-aktylakteozid

Tabuľka 1 Energia zrážky pre štandardné látky

Hmotnostná spektrometrická analýza odhalila, že fenyletanoidové glykozidy majú podobné vzorce fragmentácie hmotnostného spektra, štiepne dráhy v režime negatívnych iónov zahŕňajú hlavne: (1) Štiepenie esterovej väzby: strata neutrálnej kafeoylovej skupiny (C9H3O6, 162,03) a neutrálnej acetylovej skupiny (C2H2O , 42.{10}}); (2) Glykozidové štiepenie: strata neutrálnych zvyškov ramnózy (C6H10O4, 146,05) a neutrálneho glukózového zvyšku (C6H10O5, 162,05). Z hmotnostnej spektrometrie s vysokým rozlíšením bolo možné rozlíšiť caffeoylový (162,03) a glukózový zvyšok (162,05).

Odobrali sa štandardné roztoky iridoidov ajugol, katalpol, kyselina geniposidová, geniposid a kyselina 8-epideoxyloganová, potom sa poskytli rôzne kolízne energie a získali sa zodpovedajúce mapy MS2 (obr. 2).

Obr. 2 Hmotnostný spektrogram a štiepna dráha iridoidných glykozidov. A Ajugol, B katalpol, C kyselina geniposidová, D genipozid, E 8-kyselina epideoxylogánová

Iridoidné glykozidy majú podobné vzorce fragmentácie hmotnostného spektra, štiepne dráhy v režime negatívnych iónov zahŕňajú hlavne (1) Glykozidové štiepenie: Strata neutrálneho glukózového zvyšku (C6H10O5, 162,05); (2) Strata neutrálneho CO2 (43,99) a H2O (18,01).

Identifikácia zlúčenín v CD, CD-NP a CD-HP extraktoch

UPLC-QTOF-MS E analýza

Uskutočnila sa optimalizácia chromatografických podmienok. Ďalej zlúčeniny zCistancheHerba boli hodnotené v negatívnych aj pozitívnych iónových režimoch s vysokými aj nízkymi CE. Získané výsledky ukázali, že kompatibilita negatívneho módu bola vyššia v porovnaní s pozitívnym módom pre tieto zlúčeniny. Obrázok 3 ukazuje MS chromatogram základného piku iónov (BPI) s očíslovanými píkmi. Intenzita každého detegovaného iónu v UPLC-Q-TOF-MSE analýze bola normalizovaná vzhľadom na celkový počet iónov na vytvorenie dátovej matice, ktorá pozostávala z hodnoty m/z, normalizovanej plochy píku a retenčného času.

Obr. 3 Základná vrcholová intenzita (BPI) vzoriek. 1.CD, 2. CD-NP, 3. CD-HP

Hodnotenie komponentov z CD a ním spracovaných produktov na platforme UNIFI

Celkom 97 zlúčenín bolo identifikovaných s -SEM (n = 6) módom z CD a jeho spracovaného produktu (tabuľka 2), vrátane fenyletanoidných glykozidov (PhGs), iridoidov, lignanov a oligosacharidov. Komponenty 95, 91 a 94 boli detegované v CD, CD-NP a CD-HP. Z nich bolo 64 fenyletanoidov, 13 iridoidov a 20 iných druhov zlúčenín bolo určených. Bola tam podobnosť vchemickýZistilo sa však, že množstvo zložiek sa medzi CD a ním spracovaným produktom líši.

Tabuľka 2 Vyhodnotenie zlúčenín získaných z CD a jeho spracovaných produktov pomocou UPLC-Q-TOF-MSE

Variácie vchemickýzložky spracovaných produktov

Na analýzu multivariačnej matice údajov sa použil softvér Simca-P 13.{2}}. Pred PCA boli všetky premenné centrované na stred a pareto-škálované, po čom nasledovala identifikácia potenciálnych diskriminačných premenných. V grafe skóre PCA každý bod ukázal individuálnu vzorku. Vzorky, ktoré vykazovali podobnosť v ichchemickýzložky boli rozptýlené vedľa seba, zatiaľ čo tie, ktoré vykazovali odchýlky vo svojich zložkách, boli rozdelené. Ako je vidieť na PCA (obr. 4), skupina CD-HP bola oddelená od skupín CD a CD-NP.

Obr. 4 PCA CD a jeho rôzne spracované produkty

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs. 5, 6, 7) The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP >1 a P< 0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Obr. 5 OPLS-DA/permutačný test/S-graf/tepelná mapa označujúca intenzity potenciálnych biomarkerov medzi CD-NP a CD-HP zlúčeninami 9, 10, 14, 32, 59, 60, 68, 70, 74, Obr. 75, 80, 81, 82 a 84 sú diferenciálne zložky CD-NP, zatiaľ čo zlúčeniny 11, 15, 16, 45, 48, 66 a 72 sú diferenciálne zložky CD-HP.

Obr. 6 OPLS-DA /permutačný test/ S-graf/teplotné mapy označujúce intenzity účinných biomarkerov medzi CD a CD-NP zlúčeninami 13, 15, 16, 37, 49, 63, 66, 72, 74, 75 a 85 sú diferenciálne zložky CD, zatiaľ čo zlúčeniny 10, 11, 32, 59, 60, 68, 70, 71, 80, 81 a 82 sú diferenciálne zložky CD-NP.

Obr. 7 OPLS-DA/permutačný test/S-graf/teplotné mapy odhaľujúce intenzity účinných biomarkerov medzi CD a CD-HP zlúčeninami 9, 14, 16, 59, 63, 66, 72, 74, 75, 80, 82 84, 85 a 94 sú diferenciálne zložky CD a 11, 15, 45, 49, 50, 60 a 71 sú diferenciálne zložky CD-HP.

Z obr. 8 sme zistili intenzitu akteozidu (54), cistanozidu C (74), kamneozidu II (43), osmanthuzidu (75) a 2'-aktylakteozidu (80) s 4'-O-kafeoylovou skupinou v časť 8-O- -D-glukopyranozylu (pozri obr. 9) sa po spracovaní ryžovým vínom znížila, kým intenzita izoacetozidu (60), izocistanozidu (71), izokampneozidu I (69) izomartynozid (86), ktorý má 6'-0-kafeoylovú skupinu (pozri obr. 9), zvýšený, najmä pre skupinu CD-NP. Hoci tubulozid B (72) má 6'-0-kafeoylovú skupinu, rovnako ako izoakteozid, intenzita sa znížila kvôli jeho 2'-aktylovej skupine. Intenzita echinakozidu (38) a cistanozidu B s 6'-O- -D-glukopyranozylovými skupinami sa zvýšila, ale intenzita tubulozidu A (55) sa znížila aj kvôli jeho 2'-aktylovej skupine.

Obr. 8 Intenzita hlavne PhG v CD a jeho spracovaných produktoch

Obr. 9ChemickýŠtruktúry hlavne PhG v CD a jeho spracovaných produktoch.

Náš výskumný tím tiež študoval tepelnú stabilitu akteozidu a izoakteozidu a zistil, že akteozid bol nestabilný vo vode, metanole a roztoku žltého ryžového vína a mohol sa čiastočne premeniť na izoakteozid za podmienok zahrievania. Ale termostabilita izoakteozidu bola lepšia, najmä v roztoku žltého ryžového vína. Obrázok 10 ukazuje možné zmeny PhG v CD počas spracovania:

Obr. 10 Možná reakcia na PhGs počas spracovania

Identifikácia metabolitov u potkanov

Z údajov hmotnostnej spektrometrie s vysokým rozlíšením je presná molekulová hmotnosť a elementárne zloženiemetabolitya protomolekulové zlúčeniny sa analyzovali a porovnávali. Keďže rovnaké druhy zlúčenín v TCM vykazovali podobnosť v metabolických modifikáciách, korelácie fytochemických zložiek in vitro sa môžu rozšíriť na ich metabolity in vivo. Medzitým sa na základe konvenčných biotransformačných dráh odvodila primeraná zmena molekulovej hmotnosti. Nakoniec,metabolityboli identifikované analýzou MSE hmotnostných spektier metabolitov a dráhy fragmentácie proto-zlúčenín v hmotnostnom spektre [21, 22]. V porovnaní so slepou vzorkou boli jej zložky identifikované in vivo na základe informácií poskytnutých hmotnostným spektrom chromatogramu, možnosťou metabolickej reakcie, charakteristikami štruktúry zlúčeniny a pravidlom fragmentácie jej hmotnostného spektra. Pozri tabuľku 3.

Tabuľka 3 IdentifikovanéMetabolityv plazme, moči a výkaloch vodného extraktu v CD a jeho spracovaných produktoch

Identifikácia metabolitov súvisiacich s fenyletanolglykozidmi

Na spracovanie bola použitá platforma UNIFI. Obrázok 11 ukazuje TIC chromatograf moču, výkalov a plazmy pre CD a jeho spracované produkty. V porovnaní so slepými vzorkami bolo u potkanov identifikovaných celkovo 54 metabolitov, vrátane 10 prototypových komponentov a 44metabolity, v ktorých 24, 49 a 6 bolo vo výkaloch, moči a plazme.

Obr. 11 Chromatograf TIC. Vzorka moču v skupine BC; B Vzorka moču v skupine CD; C Vzorka moču v skupine CD-NP; D Vzorka moču v skupine CD-HP; E Vzorka výkalov v skupine BC; F Vzorka fekálií v skupine CD; G Vzorka výkalov v skupine CD-NP; H Vzorka výkalov v skupine CD-HP; I Vzorka plazmy v BC skupine; J Vzorka plazmy v skupine CD; K vzorka plazmy v skupine CD-NP; M Vzorka plazmy v skupine CD-HP

Na základe presnej hmotnosti, fragmentačnej kaskády a predvídateľných neutrálnych strát biotransformáciou, celkovo 35 fenyletanoidových glykozidov spojenýchmetabolityboli predbežne vyhodnotené. Príbuzné metabolity fenyletanoidných glykozidov majú podobné vzorce fragmentácie hmotnostného spektra, ako typický dekafeoylový fragment m/z 461,1605, potom sa ďalej hydrolyzujú glykozidovými a esterovými väzbami in vivo a metabolizujú na hydroxytyrozol (HT) (m/ z 153,0504, C8H1003, 4,73 min) a kyselina kávová (CA) (m/z 179,0389, C9H704, 0,77 min), pozri obr. 12A.

M11 indikovala [M–H]- pri m/z 153,0504 so vzorcom tj C8H10O3 a identifikovala sa ako HT. M16 predstavoval [M–H]- pri m/z 329,0851, čo bolo o 176 Da zvýšené ako pri HT, čo ukazuje, že by mohlo ísť o glukuronidovaný metabolit HT. [M–H]- M26 bola m/z 343,1037, o 14 Da vyššia ako hodnota HT-glukuronidu. Preto bol M26 identifikovaný ako HT-metylovaný glukuronid. M17 bol identifikovaný ako HT-sulfát na základe jeho [M–H]- pri m/z 233,0112, 80 Da cez HT, ktorý mohol byť ďalej metylovaný, potom produkoval M22, ktorý ukázal m/z 247,0278, čo naznačuje, že bol HT-metylovaný sulfátmetabolit. M7 (m/z 167,0335) a M5 (m/z 167,0762) sa považovali za oxidačné produkty a metylovaný HT (obr. 12B).

M1 indikoval [M–H]- pri m/z 179,0389, objasnený molekulový vzorec bol C9H7O4 a identifikovaný ako kyselina kávová (CA). M25 odhalila [M–H]- pri m/z 355,0704, ktoré boli o 176 Da zvýšené ako CA, ukazuje, že by mohlo ísť o glukuronidovanýmetabolitz CA. M27 mal m/z 258,994, čo bolo o 80 Da vyššie ako CA, takže sme ho objasnili ako CA sulfát a mohol produkovať M35 (m/z 273,0064). Keďže M4 dáva [M–H]- pri m/z 193,0524, o 14 Da vyššie ako CA, bol identifikovaný ako metylovaný metabolit CA. M39 bola dehydroxylácia CAmetabolits m/z 163,04 a mohol byť sulfátovaný na M32 (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181, C10H1204, 0,93 min). M33 môže byť dehydroxydovaný na M43, to znamená 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) a M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) a M29,65S,950122 8,52 min) boli glukuronidované a sulfátované produkty (obr. 12C).

Pre fenyletanoidné glykozidy spojenémetabolityKľúčovými metabolickými kaskádami boli metabolické reakcie fázy II, tj glukuronidácia, metylácia a sulfatácia. Navrhované metabolické kaskády fenyletanoidov sú znázornené na obr.

12 Hmotnostné spektrum niektorých Obrmetabolityna CD

Obr. 13 Možná metabolická dráha fenyletanoidov

Identifikácia metabolitov súvisiacich s iridoidmi

Analýzou elementárneho zloženiametabolity, fragmentácii MSE a súvisiacej literatúre bolo predbežne vyhodnotených celkovo 19 metabolitov spojených s iridoidmi. Iridoidné glykozidy boli hydrolyzované glykozidickými väzbami za vzniku ich zodpovedajúcich aglykónov. m/z 185,117 bolo pre M8, 162 Da menej ako ajugol, čo bolo získané stratou glukózového zvyšku.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) bol deglykozylovaný produkt katalpolu. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) bola nižšia ako 30 Da ako pre katalpol deglykozylovanýmetabolita bol identifikovaný ako odstránenie molekuly metabolitu CH2O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), bola ďalšia strata H2Ometabolit.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) bol deglykozylovaný metabolit geniposidu a M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) bola deglykozylácia kyseliny 8-epideoxylogánovej. Metabolické reakcie pre iridoidy by mohli byť odhalené ako metabolizmus fázy I deglykozylácie (obr. 12D).

Porovnanie metabolického profilovania v plazme, moči a výkaloch medzi CD a jeho spracovanými produktmi

Porovnali sa 2 prototypy v plazme, 7 v moči a 3 vo výkaloch. Bolo tam 7 prototypov absorbovaných v CD, 7 prototypov absorbovaných v CD-NP a 8 prototypov v CD-HP. M21 bol detegovaný len v skupine s výkalmi CD-NP a M38 a M51 boli detegované len v močových skupinách CD-HP. V porovnaní s metabolitmi identickémetabolityv plazme, moči a stolici bolo 4, 42 a 21, v uvedenom poradí. V skupine CD sa absorbovalo 34 metabolitov, 39 v skupine CD-NP a 40 v skupine CD-HP. M5, M7, M40 a M52 boli detegované iba v skupinách CD-NP, zatiaľ čo M24, M41 a M48 boli detegované len v skupinách CD-HP.

Boli pozorované variácie v absorpcii, ako aj metabolizme aktívnych zlúčenín v rôznych spracovaných produktoch CD. Z obr. 14 sme zistili, že intenzita konjugácie HT-sulfátu (M17) bola najvyššia v moči, nasledovala konjugácia 3-HPP sulfát (M29), konjugácia metylovaného HT sulfátu (M22), dehydroxylovaný CA sulfát konjugácia (M32) a konjugácia 3,4-dihydroxybenzénpropiónovej kyseliny so sulfátom (M19). Obsah produktov metabolizmu v spracovanej skupine bol vyšší ako v skupine CD, najmä u M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Ich prekurzorové zlúčeniny, ako je hydroxytyrozol, majú protinádorové, protizápalové, antibakteriálne, antivírusové a antifungálne vlastnosti [23]. Kyselina kávová má protizápalové, protirakovinové a antivírusové účinky [24]. Bolo to v súlade s klinickým používaním CD a jeho spracovaných produktov.

Diskusia

CD je TCM a jeho hlavné bioaktívne zložky vrátane PhG, iridoidov a polysacharidov boli zdokumentované rôznymi výskumnými štúdiami. V klinickej praxi TCM sa spracované produkty CD široko používajú v porovnaní so surovými. ThechemickýZloženie sa počas spracovania zmení, čo môže viesť k zmenám v liečivých účinkoch (obr. 14).

Obr. 14 Intenzita hlavnéhometabolityv moči

PhGs sú typom fenolovej zlúčeniny charakterizovanej štruktúrou -glukopyranozidu nesúcou hydroxyfenyletylovú skupinu ako aglykón. Tieto zlúčeniny často obsahujú kyselinu kávovú a ramnózu pripojenú k glukózovému zvyšku prostredníctvom esterových alebo glykozidických väzieb. V súčasnej štúdii sa vykonali kvalitatívne analýzy CD, CD-NP a CD-HP a celkovo sa identifikovalo 97 zlúčenín vrátane fenyletanoidových glykozidov (PhGs), iridoidov atď. Získané výsledky ukázali odchýlky vchemickýzloženie pred a po spracovaní. Intenzita PhGs, ktoré majú 4'-O-kafeoylovú skupinu v 8-O- -D-glukopyranozylovej časti, ako je akteozid, cistanozid C, kamneozid II, osmanthuzid, sa po spracovaní znížila, zatiaľ čo PhG so 6 '-O-kafeoylová skupina v 8-O- -D-glukopyranozylovej časti, ako je izoacetozid, izocistanozid, izokampneozid I, izomartynozid, zvýšená, najmä v skupine CD-NP. Zvýšila sa aj intenzita echinakozidu a cistanozidu B, ktorých štruktúra obsahuje 6'-0- -D-glukopyranozylovú skupinu. PhG, ktoré majú 2'-aktylovú skupinu, sa často zmenšujú v dôsledku hydroróznej reakcie počas procesu, ako je tubulozid B, 2-acetylakteozid.

Vyšetrovaniemetabolityabsorbovaný in vivo sa uskutočnil po perorálnom podaní CD a jeho spracovaných produktov. Metabolické procesy fázy II boli kľúčovými kaskádami a väčšina metabolitov boli sulfátové, glukuronidové a metylované konjugáty. Fenyletanolové glykozidy majú nízku perorálnu absorpciu a využitie. Ťažko sa absorbujú do krvi a pôsobia ako progenitori, ktorí zohrávajú svoju úlohu po metabolickej aktivácii in vivo. Fenyletanoidy produkované na fenyletanolaglykón, ako je hydroxytyrozín (HT) a kyselina kávová (CA) a jej derivát 3-kyselina hydroxyfenylpropiónová (3-HPP), tieto metabolity sa môžu ľahšie absorbovať do plazmy a majú lepšie liečivé účinky. účinok.

Väčšina zmetabolityboli nájdené v nižších koncentráciách alebo neboli zistené v plazme potkanov, avšak vyššie koncentrácie boli pozorované v moči, čo naznačuje, že metabolity by sa mohli ľahko eliminovať močom. Ako je znázornené v tabuľke 3, rovnaké zlúčeniny boli stanovené v rôznych skupinách, pričom sa zistili značné rozdiely v koncentráciáchmetabolityčo môže súvisieť s nerovnakou účinnosťou CD a jeho spracovaných produktov. HT-sulfátová konjugácia (M17) má najvyššiu intenzitu v moči, nasleduje 3-HPP sulfátová konjugácia (M29), metylovaná HT sulfátová konjugácia (M22), dehydroxylovaná CA sulfátová konjugácia (M32) a 3, {{ 7}} konjugácia so sulfátom kyseliny dihydroxybenzénpropiónovej (M19). Obsah produktov metabolizmu v spracovanej skupine bol vyšší ako v skupine CD, najmä u M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Vo všeobecnosti môžu byť účinné zložky s vysokou expozíciou v cieľových orgánoch. In vitro bolo hodnotené a stanovené dostatočné množstvo fenyletanoidov a ich derivátov. Charakteristickými zlúčeninami sú akteozid, ktorého obsah po spracovaní ryžovým vínom klesol a zodpovedajúcim spôsobom vzrástol obsah izoakteozidu, izocistanozidu C, izokampneozidu I. Produkty degradácie PhGs, ako sú deriváty CA a HT, by sa mohli hodnotiť v biologických vzorkách a spracovanie ryžového vína môže zvýšiť absorpciumetabolityin vivo.

Záver

V tejto štúdii bolo zistených 97 zlúčenín v extraktoch CD a jeho spracovanom produkte. Degradácia niekoľkých glykozidov nastala pri zvýšenej teplote a v dôsledku toho sa syntetizovali niektoré nové izoméry a komplexy. V štúdii in vivo boli prototypové komponenty (10) ametabolity(44) boli stanovené alebo predbežne vyhodnotené v plazme, výkaloch a moči potkanov. Metabolické procesy fázy II boli kľúčovými kaskádami, väčšina z nichmetabolityboli spojené s echinakozidom alebo akteozidom, ako je HT, CA a ich deriváty 3-kyselina hydroxyfenylpropiónová 3-HPP. Tieto metabolity sa môžu ľahšie absorbovať do plazmy a majú lepší liečebný účinok. Získané výsledky ukázali, žechemickýzloženie CD bolo odlišné a ovplyvnilo dispozíciu zlúčeniny in vitro a in vivo.

Dostupnosť údajov a materiálov

Súbory údajov použité a/alebo analyzované počas súčasnej štúdie sú k dispozícii od príslušného autora na primeranú žiadosť.

Skratky

PhGs: fenyletanoidové glykozidy

CD:Cistanche deserticola

CMM: Chinese Materia Medica

TČM: Tradičná čínska medicína

CD-NP:Cistanche deserticolaSpracované na pare s ryžovým vínom za normálneho tlaku

CD-HP:Cistanche deserticolaSpracované na pare s ryžovým vínom pod vysokým tlakom

UPLC-Q-TOF-MSE: Ultra vysokoúčinná kvapalinová chromatografia spojená s TOF-MSE

PCA: Analýza hlavných komponentov

VIP: Premenlivý význam pre projekciu

CA: Kyselina kávová

HA: Hydroxytyrozol

Štúdia pravdepodobnosti chemických profilov a metabolitov

Referencie

1. Komisia pre čínsky liekopis. Pharmacopeia of the People's Republic of China, zv. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. s. 140.

2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. HerbaCistanche(Rou Cong-Rong): jeden z najlepších farmaceutických darov tradičnej čínskej medicíny. Front Pharmacol. 2016;7:41.

3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Účinky rôznych metód spracovania sušenia pre FreshCistanche deserticolana obsah jeho komponentov. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.

4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimalizácia procesu vysokotlakového parenia pre Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.

5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. ÚčinkyCistanchesherba pred a po spracovaní na funkciu proti starnutiu a imunitnú funkciu starnúcich potkanov vyvolaných D-galaktózou. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.

6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Štúdia o laxatívnych zložkách v Cistanche deserticola YC Ma. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.

7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Štúdia o neuroendokrinno-imunitnej funkciiCistanche deserticolaa jeho produkty na pare z ryžového vína v modeli potkanov indukovaných glukokortikoidmi. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.

8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Zlepšenie povzbudzujúcej funkcie obličiek v myšom modeli pomocou Cistanches herba rýchlo sušené pri stredne vysokej teplote. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.

9. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Púštny ženšen": recenzia. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.

10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Prehľad jeho chémie, farmakológie a farmakokinetických vlastností. J Ethnopharmacol. 2018;219:233–47.

11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. HerbaCistanche(Rou Cong Rong): prehľad jeho fytochémie a farmakológie. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.

12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektívne účinky echinakozidu na myšom MPTP modeli Parkinsonovej choroby. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Ochranný účinok tubulozidu B na apoptózu indukovanú TNF alfa v neurónových bunkách. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.

14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Protizápalové iridoidy zo stoniekCistanche deserticolapestované v púšti Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.

15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Fenyletanoidové glykozidy s protizápalovými aktivitami zo stoniek Cistanche deserticola kultivovaných v púšti Tarim. Fitoterapia. 2013;89:167–74.

16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoidné a acyklické monoterpénové glykozidy, kankanozidy L, M, N, O a P zCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.

17. Li SL, Song JZ, Qiao CF a kol. Nová stratégia na rýchle preskúmanie potenciáluchemickýmarkery na rozlíšenie medzi surovým a spracovaným Radix Rehmanniae pomocou UHPLC-TOF-MS s viacrozmernou štatistickou analýzou. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.

18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Zmeny hladín fenyletanoidových glykozidov, antioxidačná aktivita a iné kvalitatívne znaky v r.Cistanche deserticolaplátky spracovaním parou. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.

19. Ma ZG, Tan YX. Zmeny obsahu šiestich fenyletanoidových glykozidov počas parenia sa prelínajú s vínom v Desertliving Cistanche. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.

20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Vplyv procesu parenia na kvalitu pozberucistanche deserticolana lekárske použitie pri sušení na slnku. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.

21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W.Metabolitydiétneho akteozidu: profily, izolácia, identifikácia a hepatoprotektívne kapacity. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Systematická charakteristikametabolityechinakozidu a akteozidu zCistanchetubulosa v plazme, žlči, moči a výkaloch potkanov na základe UPLC-ESI-Q-TOF-MS. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.

23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: prírodná zlúčenina so sľubnými farmakologickými aktivitami. J Biotechnol. 2020;309:29–33.

24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Kyselina kávová, všestranný farmakofór: prehľad. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.