Klonovanie, funkčná identifikácia a analýza expresie chalconsyntázy z Cistanche Tubulosa

Abstrakt: Cieľ

Na štúdium funkciechalkónová syntáza z Cistanche tubulosaa vzor expresie génu CtCHS v bielych, červených a fialových kvetoch.

MetódyGén CtCHS bol klonovaný pomocou RT-PCR a bola vykonaná bioinformatická analýza. Plazmid pET-28a-CtCHS sa preniesol do Escherichia coli, aby sa indukovala expresia proteínu pomocou IPTG. Rekombinantný proteín CtCHS sa inkuboval so substrátmi p-kumaroyl CoA a malonyl CoA a produkty sa detegovali pomocou HPLC a MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS sa preniesol do protoplastu Arabidopsis thaliana, aby sa pozorovala subcelulárna lokalizácia proteínu CtCHS. Vzor expresie génu CtCHS v kvetoch C. tubulosa s tromi farbami bol detekovaný pomocou qRT-PCR.

VýsledkyKlonoval sa gén CtCHS. Dĺžka otvoreného čítacieho rámca (ORF) bola 1173 bp, kódovala 390 aminokyselín a molekulová hmotnosť proteínu bola 42 8000.

BIO EXTRAKT CISTANCHE S 30 % ECHINAKOZIDU A 12 % AKTEOZIDU

CtCHS obsahoval katalytické zvyšky Cys164, His303, Asn336, ktoré boli konzervované v chalkónsyntáze. Proteín CtCHS bol exprimovaný v E. coli a purifikovaný, aby sa získal rekombinantný proteín. Proteín CtCHS by mohol katalyzovať p-kumaroyl CoA a malonyl CoA za vzniku naringenínového chalkónu. Proteín CtCHS bol lokalizovaný hlavne v cytoplazme. Gén CtCHS bol vysoko exprimovaný vo fialových a červených kvetoch a relatívne hladiny expresie boli 8, 44-krát a 3, 21-krát vyššie ako v kvetoch w hite.

Záver CtCHS gén bol klonovaný z kvetu C. tubulosa a bol exprimovaný proteín. Proteín CtCHS má funkciu chalkónsyntázy a expresia génu CtCHS je vyššia v tmavších kvetoch, čo naznačuje, že gén CtCHS môže regulovať farbu kvetov C. tubulosa, čo je základ pre ďalší výskum mechanizmu regulácie farby kvetov C. tubulóza.

Kľúčové slová: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalkón syntáza; analýza aktivity enzýmov; subcelulárna lokalizácia; analýza expresie

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT je rod Pyreal plant, ktorý sa prirodzene vyskytuje v južnom Xinjiang [1] v oblasti Hetian v Xinjiang [2]. Kvety fajky majú vysokú liečivú hodnotu. Jeho mäsové stonky sú jedným zo zdrojov verzie 2020 „Čínsky liekopis". [3] Výskum fajkových kvetov kordónových mäsových stoniek sa zvýšil, ale biologických výskumov jeho kvetov je pomerne málo. Doba kvitnutia fajkových kvetov je od apríla do mája [4], hlavne Existujú tri farby bielej , červené a fialové Kvety fajky sú bohaté na farbu, ale mechanizmus ich regulácie farby kvetov nebol zaznamenaný a genetické faktory [5] Pigment v rastlinných kvetoch zahŕňa najmä tri kategórie: flavonoidy, karotén, a beetín, najrozšírenejšia Veľká farebná škála [7] ako tri odrody Paeonia Lactiflora Pall.

Vyzerá ako biela a hlavná farba farby obsahuje farbu červenej a krásna kompetencia robí kvety prítomné ako fialovo-červené [8]. Farba kvetov je dôležitou črtou mnohých okrasných rastlín a je tiež kľúčovým faktorom, ktorý priťahuje ružový hmyz [9]. Štúdie ukázali, že sa prenáša. Najvyššiu frekvenciu návštev hmyzu má tmavofialová rastlina cistanche [10]. Pre biologický výskum syntetického genetického výskumu cistanoidov v kvetoch cistanosaura tubusového kvetu je vhodné objasniť mechanizmus kontroly sfarbenia kordónového kvetu, ktorý poskytuje teoretický základ pre zlepšenie farby technológie genetického inžinierstva, podporuje jej sýtejšie farby, zvyšuje sledovanosť, rozšírenie rozsahu aplikácií.

Biosyntetická dráhaflavonoidyzačína sfenylpropanoidová dráha. Fenylalanín sa najprv premení na kyselinu škoricovú pôsobením fenylalanín amoniázy (PAL) a kyselina škoricová sa 4-hydroxyluje kyselinou škoricovou. Enzým (kyselina škoricová-4-hydroxyláza, C4H) a 4-kumarát koenzým A ligáza (4-kumarát koenzým A ligáza, 4CL) katalyzujú reakciu za vzniku 4-kumaroyl-CoA [11]. Jedna molekula 4-kumaroyl-CoA a tri molekuly malonyl-CoA sú katalyzované chalkónsyntázou (CHS) za vzniku naringenínchalkónu, ktorý mázlúčeniny flavonoidov.Základný skelet chalkonizomerázy, flavanón-3-hydroxylázy, dihydroflavonol 4-reduktázy atď. vytvára rôzne flavonoidy, ako sú izoflavóny, flavonoly, antokyány atď. [12]. CHS ako kľúčový enzým v biosyntetickej dráhe flavonoidov reguluje obsah flavonoidov v rastlinách a tiež hrá dôležitú úlohu pri regulácii farby kvetov rastlín [13]. Napríklad post-transkripčné umlčanie génov Gentiana scabra Bunge CHS môže inhibovať biosyntézu antokyanov a spôsobiť špecifické bielenie korunných lalokov [14]. Umlčanie génu CHS Actinidia eriantha Benth. CHS znižuje obsah antokyanov v okvetných lístkoch a spôsobuje Farba červených okvetných lístkov sa stáva svetlejšou [15]. Preto sa v tejto štúdii gén CtCHS klonoval z kvetov Cistanche deserticola a vykonala sa na ňom bioinformatická analýza, prokaryotická expresia a purifikácia, analýza aktivity enzýmov, analýza subcelulárnej lokalizácie a analýza expresie v troch farbách kvetov, aby sa preskúmala funkcia CtCHS. proteín a expresný vzor génu CtCHS sa použili na predbežné preskúmanie vzťahu medzi CtCHS a farbou kvetov Cistanche deserticola, čo položilo základ pre štúdium regulačného mechanizmu farby kvetov Cistanche deserticola.

1 Materiály a nástroje

1.1 Materiály

Kvety Cistanche tuberosa boli zozbierané z okresu Yutian, prefektúra Hotan, Xinjiang v máji 2018. Pri odbere vzoriek bol dodržaný náhodný princíp a boli vybrané kvety Cistanche tuberosa s dobrým fyziologickým stavom a konzistentnou výškou rastlín. Tri kmene Cistanche deserticola s tromi farbami kvetov bielej, červenej a fialovej boli odobraté a identifikované ako Cistanche tubulosa (Schenk) Wight profesorom Tu Pengfeiom z Lekárskej fakulty Pekingskej univerzity. Rýchlo ich zmrazili v tekutom dusíku, uskladnili na suchom ľade a previezli do Pekingu. Chemicky kompetentné bunky E. coli DH5 boli zakúpené od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. a chemicky kompetentné bunky E. coli BL21 (DE3) boli zakúpené od spoločnosti Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor bol zakúpený od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA bol zakúpený od Sigma Company, 4-kumaroyl-CoA, naringenín -chalcon boli zakúpené od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. a naringenín bol zakúpený od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Nástroje

spektrofotometer Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, USA); gradientový PCR prístroj (Eppendorf Company, Nemecko); CFX 96 fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj, UVP gélový zobrazovač, prístroj na gélovú elektroforézu, prístroj na proteínovú elektroforézu (BioRad Company, USA); EnSpire

Čítačka mikrodoštičiek (PerkinElmer Company, USA); inkubátor s konštantnou teplotou (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D veľkokapacitný plnoteplotný oscilátor (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilátor konštantnej teploty vodného kúpeľa (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Ultra čistý pracovný stôl AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); vysokotlakový parný sterilizátor (TOMY Company, Japonsko); prístroj na čistú vodu Milli Q (Millipore, Spojené štáty americké); LC-20vysokoúčinný kvapalinový fázový chromatograf (Shimadzu Company, Japonsko); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (Thermo Fisher Company, USA); Laserový konfokálny mikroskop FV1200 (Olympus Company, Japonsko).

2 Experimentálne metódy

2.1 Extrakcia RNA a syntéza cDNA. Kvety Cistanche deserticola sa rozomleli v tekutom dusíku a potom sa podrobili testu extrakcie RNA.

Celková RNA sa extrahovala pomocou súpravy (Norgen, Cat 17200), koncentrácia a kvalita RNA sa detegovala pomocou NanoDrop 2000C a vzorky RNA s pomerom A260/A280 medzi 1,8 a 2,1 sa vybrali na syntézu cDNA s reverznou transkripciou. Reverzná transkriptáza M-MLV (Promega, M170B) sa použila na reverznú transkripciu kvalifikovanej celkovej RNA do cDNA. Experimentálne operácie boli vykonané podľa pokynov.

2.2 Klonovanie génu CtCHS

Na základe údajov o transkriptóme kvetu Cistanche deserticola našej výskumnej skupiny [16] sa skrínoval CtCHS s úplným otvoreným čítacím rámcom a na navrhnutie špecifických primérov na základe génovej sekvencie sa použil softvér SnapGene (tabuľka 1). PCR amplifikácia sa uskutočnila s použitím cDNA kvetu Cistanche deserticola ako templátu. Amplifikačný systém bol 2×Phanta Max Buffer 25 μl, dNTP Mix (10 mmol/l) 1 μl, upstream a downstream primery (10 μmol/l), každý 2 μl, cDNA 2 μl, Phanta Max Super-Fidelity

DNA polymeráza 1 μL, ddH2O 17 μL. Reakčné podmienky boli: preddenaturácia pri 95 stupňoch počas 3 minút; 25 cyklov denaturácie pri 95 stupňoch počas 15 s, žíhanie pri 55 stupňoch počas 15 s a predlžovanie pri 72 stupňoch počas 1 minúty; a predĺženie reakcie pri 72 stupňoch počas 5 minút. Produkt PCR sa detegoval elektroforézou na 1 % agarózovom géli a na získanie gélu sa použila súprava na čistenie DNA (Novizan, Cat DC301-01) a potom sa získaná DNA purifikovala pomocou súpravy na rýchle klonovanie (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNA sa ligoval s vektorom pCE2 TA/Blunt-Zero, transformoval sa do kompetentných buniek Escherichia coli DH5 a po kultivácii cez noc pri 37 °C sa vybrali jednotlivé klonové kmene a poslali sa spoločnosti na sekvenovanie.

Tabuľka 1 Sekvencie primérov

2.3 Bioinformatická analýza

Použite online softvér ProtParam na analýzu fyzikálnych a chemických vlastností proteínov; použite online nástroj Prot Scale na analýzu hydrofilnosti/hydrofóbnosti proteínov; použiť online nástroj SOPMA na predpovedanie sekundárnej štruktúry proteínu; používať online analytický softvér SWISS-MODEL na predpovedanie terciárnej štruktúry proteínov; použite online softvér TMHMM Predpovedajte transmembránovú štruktúru proteínu; použiť softvér DNAMAN na porovnanie homológie CtCHS s aminokyselinovými sekvenciami CHS iných druhov; pomocou softvéru MEGA-X zostrojte fylogenetický strom pomocou spájania susedov (NJ) a Poissonovej korekcie. Evolučná vzdialenosť je vypočítaná pomocou metódy Bootstrap a počet opakovaní Bootstrapu je 1000-krát.

Na ďalšiu detekciu sa použil UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Podmienky kvapalnej fázy boli kolóna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), teplota kolóny 40 stupeň, naringenín chalkón a naringenín. Plniaci objem kontrolnej látky je 4 μl a plniaci objem produktu enzýmovej reakcie je 7 μl. Ako mobilná fáza sa používa voda (A)-acetonitril (B). Elučný gradient je: 0 až 5 minút, 30 % B; 5 až 15 min. 30%-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100 % B; 25~31 min, 100%~30% B. Objemový prietok je 0,3 ml/min. Podmienky hmotnostnej spektrometrie sú elektrosprejový iónový zdroj, dusík ako nosný plyn, tlak plášťového plynu 3,5 MPa, tlak pomocného plynu 1,0 MPa, tlak rozprašovania 3500 V, kapilárna teplota 350 stupňov, teplota pomocného ohrevu plynu 200 stupňov, kladné a záporné iónové režimy, skenovanie rozsah iónov m/z je 100-1500, úplné rozlíšenie MS je 35 000, rozlíšenie dd-MS2 je 17 500, (N)

CE/stepted nce nastavené na 35, 60.

2.6 Subcelulárna lokalizácia proteínu CtCHS

Na základe sekvencie CtCHS a princípu bezproblémového klonovania boli navrhnuté priméry s miestami rezania enzýmu KpnⅠ a BamHⅠ a zodpovedajúce cieľové fragmenty boli amplifikované pomocou PCR. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP sa štiepil reštrikčnými endonukleázami Kpn Ⅰ a BamH Ⅰ a cieľový fragment a vektor sa spojili pomocou bezproblémovej klonovacej súpravy (Novizan, Cat C115-01) a potom sa preniesli do E. coli DH5 kompetentných buniek. , vyberte jednotlivé klonové kmene na sekvenovanie a extrahujte plazmidy zo správnych kmeňov. Plazmidy pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a pCAMBIA 1300-35S-GFP sa transformovali do protoplastov Arabidopsis thaliana pomocou PEG4000 a kultivovali sa pri slabom osvetlení počas 8 až 10 hodín. Subcelulárna lokalizácia proteínu CtCHS bola pozorovaná pod laserovým konfokálnym mikroskopom.

2.7 Analýza vzoru expresie CtCHS

Na základe sekvencie CtCHS sa DNAMAN použil na navrhnutie fluorescenčných kvantitatívnych primerov v reálnom čase s F-boxom ako vnútorným referenčným génom. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1. Relatívna expresia CtCHS v kvetoch Cistanche deserticola rôznych farieb bola detegovaná pomocou fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase. Použite TransStart Green qPCR SuperMix (plné zlato, AQ{4}}) na meranie pomocou fluorescenčnej farbiacej metódy SYBR Green, reakčný systém: 2× TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, upstream a downstream primery (10

μmol/L) {{0}},2 μl každý, cDNA templát 0,5 μl, voda bez nukleotidázy 4,1 μl, na reakciu bola použitá dvojkroková metóda a reakčný postup bol založený na metóde Dong Xianjuan a kol. [18]. Každá vzorka obsahovala 3 biologické replikáty a experiment sa opakoval trikrát. Experimentálne údaje boli analyzované pomocou programu Excel až 2

Relatívna expresia CtCHS sa vypočítala pomocou metódy −ΔACt a na vykonanie analýzy významnosti a na vykreslenie histogramov sa použil GraphPad Prism 8.