Klonovanie, funkčná identifikácia a analýza expresie chalconsyntázy z Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Abstrakt: Cieľ Štúdium funkcie chalkónsyntázy z Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) a vzor expresie génu CtCHS v bielych, červených a fialových kvetoch.
Metódy Gén CtCHS bol klonovaný pomocou RT-PCR a bola uskutočnená bioinformatická analýza. Plazmid pET-28a-CtCHS sa preniesol do Escherichia coli, aby sa indukovala expresia proteínu pomocou IPTG. Rekombinantný proteín CtCHS sa inkuboval so substrátmi p-kumaroyl CoA a malonyl CoA a produkty sa detegovali pomocou HPLC a MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS sa preniesol do protoplastu Arabidopsis thaliana, aby sa pozorovala subcelulárna lokalizácia proteínu CtCHS. Vzor expresie CtCHSgénu v kvetochC. tubulosas tromi farbami bola detegovaná pomocou qRT-PCR.
Výsledky Bol klonovaný gén CtCHS. Dĺžka otvoreného čítacieho rámca (ORF) bola 1173 bp, kódovala 390 aminokyselín a molekulová hmotnosť proteínu bola 42 8000. CtCHS obsahoval katalytické zvyšky Cys164, His303, Asn336, ktoré boli konzervované v chalkónsyntáze. Proteín CtCHS bol exprimovaný v E. coli a purifikovaný, aby sa získal rekombinantný proteín. Proteín CtCHS by mohol katalyzovať p-kumaroyl CoA a malonyl CoA za vzniku naringenínového chalkónu. Proteín CtCHS bol lokalizovaný hlavne v cytoplazme. Gén CtCHS sa výrazne exprimoval vo fialových a červených kvetoch a relatívne hladiny expresie boli 8, 44-krát a 3, 21-krát vyššie ako v kvetoch w hiteflowers.
Záver CtCHS gén bol klonovaný z kvetuC. tubulosaa proteín bol exprimovaný. Proteín CtCHS má funkciu chalkónsyntázy a expresia génu CtCHS je vyššia v tmavších kvetoch, čo naznačuje, že gén CtCHS môže regulovať farbu kvetov C. tubulosa, čo predstavuje základ pre ďalší výskummechanizmus regulácie farby kvetov C. tubulosa.
Kľúčové slová:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalkón syntáza; analýza aktivity enzýmov; subcelulárna lokalizácia; expresia analýzy
KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 30 % ECHINAKOZIDU A 12 % AKTEOZIDU
Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Biosyntetickýcesta flavonoidovzačína fenylpropanoidovou dráhou.fenylalanínsa najprv premení na kyselinu škoricovú podpôsobenie fenylalanín amonialyázy(PAL) a kyselina škoricová je 4-hydroxylovaná kyselinou škoricovou. Enzým (kyselina škoricová-4-hydroxyláza, C4H) a 4-kumarátkoenzým A ligáza (4-kumarátkoenzým A ligáza, 4CL) katalyzujú reakciu za vzniku 4-kumaroyl-CoA [11 ]. Jedna molekula 4-kumaroyl-CoA a tri molekuly malonyl-CoA sú katalyzované chalkónsyntázou (CHS) za vzniku naringenínového chalkónu, ktorý obsahuje flavonoidné zlúčeniny. Základná kostra chalkónizomerázy, flavanón{12}}hydroxylázy, dihydroflavonol 4-reduktáza atď. vytvára rôzne flavonoidy, ako sú izoflavóny, flavonoly, antokyány atď. [12]. CHS ako kľúčový enzým v biosyntetickej dráhe flavonoidov reguluje obsah flavonoidov v rastlinách a tiež hrá dôležitú úlohu pri regulácii farby kvetov rastlín [13]. Napríklad post-transkripčné umlčanie génov Gentiana scabra Bunge CHS môže inhibovať biosyntézu antokyanov a spôsobiť špecifické bielenie korunných lalokov [14]. Umlčanie génu CHS Actinidia erianthaBenth. CHS znižuje obsah antokyanov v okvetných lístkoch a robí okvetné lístky červenými. Okvetné lístky sú svetlejšie[15]. Preto sa v tejto štúdii gén CtCHS klonoval z kvetov Cistanche tubulosa a vykonala sa na ňom bioinformatická analýza, prokaryotická expresia a purifikácia, analýza aktivity enzýmov, analýza subcelulárnej lokalizácie a analýza expresie v troch farbách kvetov, aby sa preskúmala funkcia CtCHS. proteín a expresný vzor génu CtCHS sa použili na predbežné preskúmanie vzťahu medzi CtCHS a farbou kvetov Cistanche tubulosa, čo položilo základ pre štúdium regulačného mechanizmuFarba kvetu Cistanche tubulosa.
1 Materiály a nástroje
1.1 Materiály
Kvety Cistanche tubulosa boli zozbierané z okresu Yutian, prefektúra Hotan, Xinjiang v máji 2018. Pri odbere vzoriek bol dodržaný náhodný princíp a boli vybrané kvety Cistanche tubulosa s dobrým fyziologickým stavom a konzistentnou výškou rastlín. Tri kmene Cistanche tubulosa s tromi farbami kvetov bielej, červenej a fialovej boli odobraté a identifikované ako Cistanche tubulosa (Schenk) Wight profesorom Tu Pengfei z Pekingskej univerzity farmácie. Boli rýchlo zmrazené v tekutom dusíku a potom prepravené do Pekingu v sklade suchého ľadu. Chemicky kompetentné bunky E. coli DH5 boli zakúpené od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. a chemicky kompetentné bunky E. coli BL21 (DE3) boli zakúpené od spoločnosti Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor bol zakúpený od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA bol zakúpený od Sigma Company, 4-kumaroyl-CoA, naringenín -chalcon boli zakúpené od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. a naringenín bol zakúpený od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Nástroje
spektrofotometer Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, USA); gradientový PCR prístroj (Eppendorf Company, Nemecko); CFX 96 fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj, UVP gélový zobrazovač, prístroj na gélovú elektroforézu, prístroj na proteínovú elektroforézu (BioRad Company, USA); EnSpire
Čítačka mikrodoštičiek (PerkinElmer Company, USA); inkubátor s konštantnou teplotou (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D veľkokapacitný plnoteplotný oscilátor (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilátor konštantnej teploty vodného kúpeľa (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Ultra čistý pracovný stôl AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); vysokotlakový parný sterilizátor (TOMY Company, Japonsko); prístroj na čistú vodu Milli Q (Millipore, Spojené štáty americké); LC-20vysokoúčinný kvapalinový fázový chromatograf (Shimadzu Company, Japonsko); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (Thermo Fisher Company, USA); Laserový konfokálny mikroskop FV1200 (Olympus Company, Japonsko).
2 Experimentálne metódy
2.1 Extrakcia RNA a syntéza cDNA.
Kvety Cistanche tubulosa boli rozomleté v tekutom dusíku a potom podrobené testu extrakcie RNA.
Celková RNA sa extrahovala pomocou súpravy (Norgen, Cat 17200), koncentrácia a kvalita RNA sa detegovali pomocou NanoDrop 2000C a vzorky RNA s pomerom A260/A280 medzi 1,8 a 2,1 sa vybrali na reverznú transkripciu, aby sa syntetizovala cDNA. Reverzná transkriptáza M-MLV (Promega, M170B) sa použila na reverznú transkripciu kvalifikovanej celkovej RNA do cDNA. Experimentálne operácie boli vykonané podľa pokynov.
2.2 Klonovanie génu CtCHS
Na základe údajov o transkriptóme kvetu Cistanche tubulosa našej výskumnej skupiny [16] bol skrínovaný CtCHS s úplným otvoreným čítacím rámcom a softvér SnapGene bol použitý na navrhnutie špecifických primérov na základe génovej sekvencie (tabuľka 1). PCR amplifikácia sa uskutočnila s použitím cDNA kvetu Cistanche tubulosa ako templátu. Amplifikačný systém bol 2×Phanta Max Buffer 25 μl, dNTPMix (10 mmol/l) 1 μl, upstream a downstream primery (10 μmol/l), každý 2 μl, cDNA 2 μl, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μl, ddH20 17 ul. Reakčné podmienky boli: preddenaturácia pri 95 stupňoch počas 3 minút; 25 cyklov denaturácie pri 95 stupňoch počas 15 s, žíhanie pri 55 stupňoch počas 15 s a predlžovanie pri 72 stupňoch počas 1 minúty; predĺženie reakcie pri 72 stupňoch počas 5 minút. Produkt PCR sa detegoval elektroforézou na 1 % agarózovom géli a na získanie gélu sa použila súprava na čistenie DNA (Novizan, Cat DC301-01) a potom sa získaná DNA purifikovala pomocou súpravy na rýchle klonovanie (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNA sa ligoval s vektorom pCE2TA/Blunt-Zero, transformoval sa do kompetentných buniek Escherichia coli DH5 a po kultivácii cez noc pri 37 °C sa vybrali jednotlivé klonové kmene a poslali sa spoločnosti na sekvenovanie.
Tabuľka 1 Sekvencie primérov
2.3 Bioinformatická analýza
Použite online softvér ProtParam na analýzu fyzikálnych a chemických vlastností proteínov; použite online nástroj Prot Scale na analýzu hydrofilnosti/hydrofóbnosti proteínov; použiť online nástroj SOPMA na predpovedanie sekundárnej štruktúry proteínu; používať online analytický softvér SWISS-MODEL na predpovedanie terciárnej štruktúry proteínov; použite online softvér TMHMM Predpovedajte transmembránovú štruktúru proteínu; použiť softvér DNAMAN na porovnanie homológie CtCHS s aminokyselinovými sekvenciami CHS iných druhov; pomocou softvéru MEGA-X zostrojte fylogenetický strom pomocou spájania susedov (NJ) a Poissonovej korekcie. Evolučná vzdialenosť je vypočítaná pomocou metódy Bootstrap a počet opakovaní Bootstrapu je 1000-krát.
2.4 Prokaryotická expresia a purifikácia CtCHS
Navrhnite priméry s reštrikčnými miestami BamHⅠ a XhoⅠ na základe sekvencie CtCHS a PCR amplifikujte zodpovedajúce cieľové fragmenty. Vektor pET{0}}a a cieľový fragment sa štiepili pomocou endonukleáz BamHI a klonovaný kmeň sa sekvenoval a plazmid sa extrahoval po správnom sekvenovaní. Plazmid pET-28a-CtCHS overený sekvenovaním sa preniesol do kompetentných buniek Escherichia coli BL21 (DE3). Pozri metódu Ding Ning et al. [17] s izopropylom
-D-tiogalaktopyranozid (IPTG) sa použil na vyvolanie expresie proteínu pri nízkej teplote a čistil sa cez Ni2+ afinitnú chromatografickú kolónu (Cytiva, kat. 17531901). Proteín sa skoncentroval centrifugáciou v ultrafiltračnej skúmavke (Millipore, 30 000) a odsolil. Uchovávajte v 20 mmol/l KPB pufru (pH 8,0, s obsahom 1 mmol/LEDTA) a uchovávajte v chladničke pri teplote -80 stupňov na dlhodobé skladovanie.
2.5 Analýza aktivity enzýmu CtCHS
CtCHS enzýmový reakčný systém: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantný proteín 20 ul, v Po reakcii vo vodnom kúpeli pri 37 stupňoch počas 12 hodín sa zmes trikrát extrahovala 800 ul etylacetátu, vysušila sa prúdom dusíka a potom sa rozpustila v 100 ul metanolu. Na detekciu produktu použite vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu. Podmienky sú kolóna Ultimate LP-C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), teplota kolóny 30 stupňov, objem vzorky 10 μl a voda (A) a acetonitril (B) ako prietok. Fáza, elučný gradient: 0~10
min, 30 % B; 10-20 min, 30%-60% B; 20-25 min, 60%-70% B; 25-30 min, 70%-80% B; 30-35 min, 80%-100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30 % B. Objemový prietok je 1 ml/min a detekcia je pri vlnovej dĺžke 290 nm.
Na ďalšiu detekciu sa použil UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Podmienky kvapalnej fázy boli kolóna Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), teplota kolóny 40 stupeň, naringenín- kontroly chalkónu a naringenínu. Plniaci objem produktu je 4 ul a plniaci objem produktu enzýmovej reakcie je 7 ul. Ako mobilná fáza sa používa voda (A)-acetonitril (B). Elučný gradient je: 0 až 5 minút, 30 % B; 5 až 15 minút, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Objemový prietok je 0,3 ml/min. Podmienky hmotnostnej spektrometrie sú elektrosprejový iónový zdroj, dusík ako nosný plyn, tlak plášťového plynu 3,5 MPa, tlak pomocného plynu 1,0 MPa, tlak rozprašovania 3500 V, kapilárna teplota 350 stupňov, teplota pomocného ohrevu plynu 200 stupňov, kladné a záporné iónové režimy, skenovanie rozsah iónov m/z je 100-1500, plné rozlíšenie MS je 35 000, rozlíšenie dd-MS2 je 17 500, (N)
CE/stepted nce nastavené na 35, 60.
2.3 Bioinformatická analýza
Použite online softvér ProtParam na analýzu fyzikálnych a chemických vlastností proteínov; použite online nástroj Prot Scale na analýzu hydrofilnosti/hydrofóbnosti proteínov; použiť online nástroj SOPMA na predpovedanie sekundárnej štruktúry proteínu; používať online analytický softvér SWISS-MODEL na predpovedanie terciárnej štruktúry proteínov; použite online softvér TMHMM Predpovedajte transmembránovú štruktúru proteínu; použiť softvér DNAMAN na porovnanie homológie CtCHS s aminokyselinovými sekvenciami CHS iných druhov; pomocou softvéru MEGA-X zostrojte fylogenetický strom pomocou spájania susedov (NJ) a Poissonovej korekcie. Evolučná vzdialenosť je vypočítaná pomocou metódy Bootstrap a počet opakovaní Bootstrapu je 1000-krát.
2.4 Prokaryotická expresia a purifikácia CtCHS
Navrhnite priméry s reštrikčnými miestami BamHⅠ a XhoⅠ na základe sekvencie CtCHS a PCR amplifikujte zodpovedajúce cieľové fragmenty. Vektor pET{0}}a a cieľový fragment sa štiepili pomocou endonukleáz BamHI a klonovaný kmeň sa sekvenoval a plazmid sa extrahoval po správnom sekvenovaní. Plazmid pET-28a-CtCHS overený sekvenovaním sa preniesol do kompetentných buniek Escherichia coli BL21 (DE3). Pozri metódu Ding Ning et al. [17] s izopropylom
-D-tiogalaktopyranozid (IPTG) sa použil na vyvolanie expresie proteínu pri nízkej teplote a čistil sa cez Ni2+ afinitnú chromatografickú kolónu (Cytiva, kat. 17531901). Proteín sa skoncentroval centrifugáciou v ultrafiltračnej skúmavke (Millipore, 30 000) a odsolil. Uchovávajte v 20 mmol/l KPB pufru (pH 8,0, s obsahom 1 mmol/LEDTA) a uchovávajte v chladničke pri teplote -80 stupňov na dlhodobé skladovanie.
2.5 Analýza aktivity enzýmu CtCHS
CtCHS enzýmový reakčný systém: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantný proteín 20 ul, v Po reakcii vo vodnom kúpeli pri 37 stupňoch počas 12 hodín sa zmes trikrát extrahovala 800 ul etylacetátu, vysušila sa prúdom dusíka a potom sa rozpustila v 100 ul metanolu. Na detekciu produktu použite vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu. Podmienky sú kolóna Ultimate LP-C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), teplota kolóny 30 stupňov, objem vzorky 10 μl a voda (A) a acetonitril (B) ako prietok. Fáza, elučný gradient: 0~10
min, 30 % B; 10-20 min, 30%-60% B; 20-25 min, 60%-70% B; 25-30 min, 70%-80% B; 30-35 min, 80%-100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30 % B. Objemový prietok je 1 ml/min a detekcia je pri vlnovej dĺžke 290 nm.
Na ďalšiu detekciu sa použil UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Podmienky kvapalnej fázy boli kolóna Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), teplota kolóny 40 stupeň, naringenín- kontroly chalkónu a naringenínu. Plniaci objem produktu je 4 ul a plniaci objem produktu enzýmovej reakcie je 7 ul. Ako mobilná fáza sa používa voda (A)-acetonitril (B). Elučný gradient je: 0 až 5 minút, 30 % B; 5 až 15 minút, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Objemový prietok je 0,3 ml/min. Podmienky hmotnostnej spektrometrie sú elektrosprejový iónový zdroj, dusík ako nosný plyn, tlak plášťového plynu 3,5 MPa, tlak pomocného plynu 1,0 MPa, tlak rozprašovania 3500 V, kapilárna teplota 350 stupňov, teplota pomocného ohrevu plynu 200 stupňov, kladné a záporné iónové režimy, skenovanie rozsah iónov m/z je 100-1500, plné rozlíšenie MS je 35 000, rozlíšenie dd-MS2 je 17 500, (N)
CE/stepted nce nastavené na 35, 60.
2.6 Subcelulárna lokalizácia proteínu CtCHS
Na základe sekvencie CtCHS a princípu bezproblémového klonovania boli navrhnuté priméry s miestami rezania enzýmu KpnⅠ a BamHⅠ a zodpovedajúce cieľové fragmenty boli amplifikované pomocou PCR. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP sa štiepil reštrikčnými endonukleázami Kpn Ⅰ a BamH Ⅰ a cieľový fragment a vektor sa spojili pomocou bezproblémovej klonovacej súpravy (Novizan, Cat C115-01) a potom sa preniesli do E. coli DH5 kompetentných buniek. , vyberte jednotlivé klonové kmene na sekvenovanie a extrahujte plazmidy zo správnych kmeňov. Plazmidy pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a pCAMBIA 1300-35S-GFP sa transformovali do protoplastov Arabidopsis thaliana pomocou PEG4000 a kultivovali sa pri slabom osvetlení počas 8 až 10 hodín. Subcelulárna lokalizácia proteínu CtCHS bola pozorovaná pod laserovým konfokálnym mikroskopom.
2.7 Analýza vzoru expresie CtCHS
Fluorescenčné kvantitatívne priméry v reálnom čase boli navrhnuté pomocou DNAMAN na základe sekvencie CtCHS s F-boxom ako vnútorným referenčným génom. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1. Relatívna expresia CtCHS v kvetoch Cistanche tubulosa rôznych farieb bola detegovaná fluorescenčnou kvantitatívnou PCR v reálnom čase. Na meranie pomocou fluorescenčnej farbiacej metódy SYBRGreen použite TransStart Green qPCR SuperMix (plné zlato, AQ101-02). Reakčný systém: 2× TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μl, upstream a downstream primery (10 μmol/L) 0,2 μl každý, cDNA templát 0,5 μl, 4,1 μl vody bez nukleotidázy na reakciu s použitím dvojkrokovej metódy. Reakčný postup bol založený na metóde Dong Xianjuan et al. [18]. Každá vzorka obsahovala 3 biologické replikáty a experiment sa opakoval trikrát. Experimentálne dáta boli analyzované pomocou Excelu, relatívna expresia CtCHS bola vypočítaná pomocou 2-AACt metódy a GraphPadPrism 8 bol použitý na uskutočnenie analýzy významnosti a na vykreslenie histogramov.
