Klonovanie, funkčná identifikácia a analýza expresie chalconsyntázy z Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Výsledky a analýza

3.1 Klonovanie génu CtCHS

Štyri sekvencie označené ako "chalkónová syntáza" sa vytriedili pomocou transkriptómových údajov kvetov Cistanches tubulosa. Prostredníctvom porovnania NCBI Blast sa zistilo, že iba jedna sekvencia mala celú dĺžku génu CHS a mala FPKM väčšiu ako 10. Na základe tejto sekvencie boli navrhnuté špecifické priméry a fragment s veľkosťou približne 1200 bp sa získal pomocou PCR amplifikácie s použitím cDNA kvetu cistanches tubulosa ako templát (obrázok 1). Produkt PCR sa získal z gélu a spojil sa s vektorom pCE2TA/Blunt-Zero. Výsledky sekvenovania boli v súlade s analýzou transkriptómu. Gén dostal názov CtCHS. Dĺžka sekvencie je 1173 bp a kóduje 390 aminokyselín.

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Bioinformatická analýza CtCHS

3.2.1 Fyzikálne a chemické vlastnosti CtCHS a analýza transmembránových domén

Na analýzu fyzikálnych a chemických vlastností proteínu kódovaného génom CtCHS bol použitý online softvér ProtParam. CtCHS kóduje 390 aminokyselín, molekulový vzorec je C1908H3041N511O562S22, relatívna molekulová hmotnosť je 42 836,54, teoretický izoelektrický bod je 5,85 a je nestabilný. Koeficient II je 43,24, čo je nestabilný proteín, a celková priemerná hydrofilita (GRAVY) je -0,052, čo je hydrofilný proteín. Online nástroj Prot Scale sa ďalej použil na analýzu hydrofilnosti/hydrofóbnosti proteínu. Výsledky analýzy ukázali, že maximálna hodnota hydrofilnosti/hydrofóbnosti proteínu CtCHS bola 2,422 (342) a minimálna hodnota bola -2,489 (119). Aminokyselinový peptidový reťazec kódovaný génom CtCHS má viac hydrofilných aminokyselinových zvyškov ako hydrofóbnych aminokyselinových zvyškov, ide teda o hydrofilný proteín. Na predpovedanie transmembránovej štruktúry proteínu sa použil online softvér TMHMM. Proteín CtCHS nemá žiadnu transmembránovú doménu.

Obr. 1 PCR amplifikácia génu CtCHS

3.2.2 Predikcia sekundárnej štruktúry a terciárnej štruktúry proteínu CtCHS

Na predpovedanie sekundárnej štruktúry proteínu sa použil online nástroj SOPMA. Výsledky sú znázornené na obrázku 2-A. 44,87 % -helixov, 31,03 % náhodných zvitkov, 15,64 % predĺžených reťazcov a 8,46 % -listov tvorí sekundárnu štruktúru proteínu CtCHS. štruktúra úrovne. Online analytický softvér SWISS-MODEL sa použil na predpovedanie terciárnej štruktúry proteínu a kryštálová štruktúra CHS1 ryže sa použila ako templát na predpovedanie trojrozmernej štruktúry proteínu CtCHS. Výsledky sú znázornené na obrázku 2-B. Konzistencia medzi Cistanche tubulosa CtCHS a ryžou CHS1 je 83,55 %.

3.2.3 Porovnanie sekvencií a analýza a aplikácia fylogenetického stromu

Softvér DNAMAN vykonáva porovnanie homológie medzi CtCHS a CHS aminokyselinovými sekvenciami iných druhov. Výsledky sú znázornené na obrázku 3-C. Aminokyselinová sekvencia CtCHS je konzistentná s Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) a Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) a Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Aminokyselinové sekvencie CHS sú veľmi podobné, pričom podobnosť je 90,93 %, 90,68 %, 90,18 %, 89,42 %, 89,42 % a 81,61 %.

PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 30 % ECHINAKOZIDU A 12 % AKTEOZIDU

Okrem toho viacnásobné zarovnanie sekvencií tiež ukázalo, že CtCHS má konzervované katalytické zvyšky Cys164, His303 a Asn336. Aby sme ďalej pochopili evolučnú pozíciu CtCHS Cistanche tubulosa v rastlinnej rodine CHS, softvér MEGA-X sa použil na konštrukciu fylogenetického stromu medzi proteínmi CtCHS a CHS iných rastlín. Výsledky sú znázornené na obrázku 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS úzko súvisí.

3.3 Prokaryotická expresia a purifikácia CtCHS

Plazmid pET{0}}a-CtCHS sa transformoval do expresného kmeňa E. coli BL21 (DE3) a expresia proteínu sa indukovala pomocou IPTG pri nízkej teplote. Proteín sa purifikoval s použitím nikel-iónovej afinitnej chromatografickej kolóny a purifikovaný proteín sa detegoval pomocou 10 % SDSPAGE. Výsledky sú znázornené na obrázku 3. Proteínový pás CtCHS sa objavil blízko 40, 000, čo je v súlade s relatívnou molekulovou hmotnosťou proteínu CtCHS 42 800.

3.4 Analýza aktivity enzýmu CtCHS

Na identifikáciu funkcie CtCHS sa purifikovaný proteín CtCHS inkuboval s malonyl-CoA, 4-kumaroyl-CoA a produkty sa detegovali pomocou HPLC a MS. V prirodzených podmienkach je naringenín-chalkón nestabilný v roztoku a ľahko sa cyklizuje na naringenín. Preto boli ako štandardné kontroly vybrané naringenín-chalkón a naringenín.

Výsledky testu HPLC sú znázornené na obrázku 4-A a B. Retenčný čas produktu enzýmovej reakcie je podobný ako pri naringenínovom štandarde. Obidva majú maximálnu absorpciu pri 289 nm v UV absorpčnom spektre, ktoré sa líši od retenčného času naringenínu-chalkónu. Časové a UV absorpčné spektrá boli rôzne, ale ako negatívna kontrola produkt po inkubácii vysokoteplotne inaktivovaného proteínu CtCHS so substrátom neobsahoval naringenín, chalkón a naringenín. Ďalšia detekcia pomocou hmotnostnej spektrometrie, hmotnostné spektrum prvej úrovne (obrázok 4-C, D) ukázalo, že produkt enzýmovej reakcie má [MH]-pík m/z271.060 97, zatiaľ čo naringenín má [MH] ]-vrchol m/z 271.{13}}.

Pri porovnaní MS2 spektier (obrázok 5-E, F) majú produkt enzýmovej reakcie CtCHS a naringenín charakteristické vrcholy fragmentov pri m/z 107, 151 a 177, čo je v súlade so správou z literatúry [19], čo naznačuje, že CtCHS má chalkónový komplex. Enzymatická aktivita, môže katalyzovať reakciu malonyl-CoA a 4-kumaroyl-CoA na naringenín-chalkón.

3.5 Analýza subcelulárnej lokalizácie

Aby bolo možné študovať úlohu proteínu CtCHS v bunkách, skonštruoval sa plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a transformoval sa do protoplastov Arabidopsis thaliana, aby sa pozorovala jeho subcelulárna lokalizácia. Výsledky sú znázornené na obrázku 5. Ako kontrola bol proteín pCAMBIA1300-35S-GFP distribuovaný v jadre a cytoplazme, zatiaľ čo fúzny proteín pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS bol distribuovaný najmä v cytoplazme, čo naznačuje, že proteín CtCHS môže fungovať v cytoplazme rastlinných buniek. Funkcia.

3.6 Analýza vzoru expresie CtCHS

qRT-PCR sa použila na detekciu relatívnej expresie CtCHS v kvetoch Cistanche deserticola s tromi farbami: bielou, fialovou a červenou. Výsledky sú znázornené na obrázku 6. Expresia CtCHS vo fialových a červených kvetoch bola výrazne vyššia ako v bielych kvetoch. množstvo. V porovnaní s bielymi kvetmi je úroveň expresie CtCHS vo fialových kvetoch 8,44-krát vyššia a úroveň expresie CtCHS v červených kvetoch je 3,21-krát vyššia. Tieto výsledky naznačujú, že zmeny hladín expresie CtCHS môžu súvisieť s rozdielom vo farbe kvetov Cistanche deserticola. Čím vyššia je úroveň výrazu, tým je farba kvetov tmavšia. , čím nižšia je úroveň výrazu, tým je farba kvetov svetlejšia.

****P＜0.000 1Obr. 6 Relatívna úroveň expresie CtCHS v kvetoch s rôznymi farbami

4. Diskusia

CHS je akľúčový enzým v biosyntetickej dráhe flavonoidova súvisí s the regulácia farby kvetovv mnohých rastlinách. Napríklad farba kvetuDianthus chinensisL.[20] a Petúnie × hybrida Hort. exVilm.[22] všetci sú postihnutí CHS. ovládanie.Cistanches tubulosamá hlavne tri farby kvetov: bielu, červenú a fialovú, ale mechanizmus regulácie farby kvetov ešte nebol opísaný. V tejto štúdii bol gén CtCHS klonovaný pomocou RT-PCRanalýza transkriptómových údajov kvetov Cistanches tubulosa, a jeho

Bioinformatická analýzasa uskutočnilo a výsledky ukázali, že CtCHS má vysokú podobnosť a blízky genetický vzťah s aminokyselinovou sekvenciou ElCHS Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS je polyketidsyntáza typu III (PKSIII) a štúdie zistili, že CHS má konzervovanú Cys-His-Asn katalytickú triádu [23]. V tejto štúdii analýza zarovnania aminokyselinových sekvencií ukázala, že CtCHS má konzervované katalytické zvyšky Cys164, His303 a Asn336, čo naznačuje, že CtCHS môže mať typickú funkciu chalkónsyntázy.

schopný. Analýza aktivity enzýmu sa uskutočnila s použitím prokaryotickej expresie proteínu CtCHS v Escherichia coli a detegovala sa pomocou HPLC a MS. Zistilo sa, že proteín CtCHS môže katalyzovať 4-kumaroyl-CoA a malonyl-CoA za vzniku naringenínu-chalkónu.

CHS sa podieľa na syntéze flavonoidov v mnohých rastlinách, ale jeho subcelulárne umiestnenie je u rôznych druhov odlišné. Napríklad Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] sú všetky lokalizované v cytoplazme, zatiaľ čo Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], baklažán Solanum melongena L. SmCHS [28] sa nachádza v cytoplazme a jadre a v hrozne Vitis vinifera L. VvCHS sa nachádza v cytoplazme, jadre a bunkovej stene [29]. V tejto štúdii sa na transformáciu protoplastov Arabidopsis thaliana použil plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a zistilo sa, že proteín CtCHS bol lokalizovaný hlavne v cytoplazme a môže katalyzovať produkciu naringenín-chalkónu v cytoplazme. podporuje akumuláciu flavonoidov.

Fenylpropanoidová dráha sa vetví z 4-kumaroyl-CoA na dráhu syntézy flavonoidov a dráhu biosyntézy lignanov. CHS katalyzuje 4-kumaroyl-CoA a malonyl-CoA za vzniku naringenínu a chalkónu na spustenie flavonoidov. Biosyntetická dráha zlúčenín podobných zlúčeninám je prvým kľúčovým enzýmom v tejto dráhe [30]. Preto je vysoko exprimovaný CHS prospešný pre rastliny, aby akumulovali vyššie hladiny flavonoidov a produkovali tmavšie kvety. Napríklad úroveň expresie CHS v odrodách s fialovými kvetmi Hosta plantaginea (Lam.) Aschers je vyššia ako u odrôd s bielymi kvetmi. Hosta HpCHS sa transformuje na tabak, aby sa získal V porovnaní s tabakom divokého typu majú rastliny s nadmernou expresiou tmavšie okvetné lístky a vyšší celkový obsah antokyanínov [31].

V tejto štúdii úroveň expresie génu CtCHS súvisí s farbou kvetov Cistanches tubulosa. Je vysoko vyjadrený v tmavších fialových kvetoch a červených kvetoch a má nízky obsah svetlých bielych kvetov. Rozdiel v expresii CtCHS môže byť spôsobený rozdielom v kvetoch Cistanches tubulosa. Jeden z dôvodov, prečo mať rôzne obleky a farby. Stručne povedané, táto štúdia klonovala gén CtCHS z kvetov Cistanche deserticola a vykonala na ňom bioinformatickú analýzu. Rekombinantný proteín CtCHS sa získal exogénnou expresiou v Escherichia coli. Analýza aktivity enzýmu dokázala, že proteín CtCHS môže katalyzovať 4-kumaroylkoenzým. A a malonyl-koenzým A vytvárajú naringenín-chalkón. Zistilo sa, že gén CtCHS je vysoko exprimovaný vo fialových a červených kvetoch a málo v bielych kvetoch. Tieto výsledky naznačujú, že gén CtCHS môže regulovať produkciu rôznych farieb kvetov v Cistanche deserticola, čo je prospešné pre ďalší výskum regulačného mechanizmu farby kvetov Cistanche tubulosa a poskytuje referenciu pre následný výskum úlohy CtCHS pri regulácii farba kvetov v Cistanche deserticola.