Diétna cistanche zmiernila akútne poškodenie ilea kačice

Abstrakt: Aflatoxín B1 (AFB1) je stabilný toxický metabolit ohrozujúci zdravie ľudí a zvierat a široko kontaminované krmivo pre zvieratá a potraviny. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať účinkydiétne cistanchena poranenie ilea u kačíc vyvolané podávaním AFB1 a preskúmať jeho základné mechanizmy. Kačice (N=450, jednodňový samec) s podobnou hmotnosťou boli náhodne rozdelené do 3 skupín obsahujúcich kontrolnú skupinu, skupinu AFB1 (60 µg AFB1 kg-1 telesnej hmotnosti) a cistanche (500 mg cistanche kg−1 diéta) plus skupina AFB1. Podávanie AFB1 výrazne zvýšilo poškodenie ilea, adukty AFB1-DNA v plazme a oxidačný stres a zápal. Pridanie cistanche do stravy chránilo ileum pred morfologickým poškodením vyvolaným podávaním AFB1, znížilo adukty AFB1-DNA v plazme a eliminovalo oxidačný stres a zápal v ileu kačíc.Antioxidáciaaprotizápalové účinky cistancheby mohli chrániť ileum pred akútnym poškodením aktiváciou signálnej dráhy Nrf2-ARE a inhibíciou signálnej dráhy NF-κB. presvedčivo,cistanchebol diétnyantioxidačnéaprotizápalovéprostredníctvom aktivácie signálnej dráhy Nrf{0}}ARE a inhibície akútneho poškodenia signálnej dráhy NF-KB vyvolaného podávaním AFB1.

Kľúčové slová:cistanche; akútne ileum; AFB1-adukty DNA; Nrf2-SÚ;

Kliknite sem pre produkty Cistanche proti starnutiu

Požiadajte o viac:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950

1. Úvod

Mäso je dôležitým zdrojom vysoko kvalitných bielkovín pre ľudskú výživu. Kačacie mäso sa hojne konzumuje na celom svete, najmä v Ázii, kvôli jeho žiaducim nutričným vlastnostiam [1]. Preto chov kačíc vzbudil pozornosť ľudí. Pre kačice existujú v procese chovu rôzne nevýhody, ako napríklad AFB1, ktoré ohrozujú zdravie kačíc. Aflatoxín B1 (AFB1) je jedným zo stolových toxických metabolitov produkovaných druhmi Aspergillus. AFB1 je uznávaný ako najtoxickejší medzi skupinami aflatoxínov (AF) spolu s celým radom toxických účinkov ohrozujúcich zdravie ľudí a zvierat [2].

Pre ľudí alebo zvieratá je jedlo alebo krmivo bežným a dôležitým spôsobom expozície AFB1, ale inhalácia a priamy kontakt s pokožkou alebo sliznicou sa tiež počítajú a neignorujú [3]. Predchádzajúce štúdie preukázali, že AFB1 vykazuje silnú toxicitu, ktorá je veľmi komplexná a silná, čo vedie k spomaleniu rastu, biologickým malformáciám, toxicite pečene, poruchám tráviaceho traktu a dokonca rakovine [4,5]. AFB1 získaný z kontaktu s jedlom alebo sliznicou mal negatívne účinky na dýchací systém, tráviaci systém a tkanivá a rastovú výkonnosť [3,6,7]. Poškodenie tkanív a orgánov vyvolané podávaním AFB1 súvisiace s oxidačným stresom a zápalom. Podávanie AFB1 zaznamenalo zvýšený obsah aduktov AFB1-DNA v poranenom orgáne [8]. K absorpcii a premene živín a toxínov došlo v žalúdku a tenkom čreve, teda v tenkom

Imunitný systém črevnej sliznice je prvou líniou na ochranu tela pred poranením [9]. Funkčnosť a morfológiu zdravého gastrointestinálneho traktu môžu zničiť nepriaznivé faktory, ako sú toxické látky, baktérie a vírusy [10,11]. AFB1 indukoval deštrukciu črevnej štruktúry, ktorá sa prejavila vylučovaním epitelových buniek v jejunálnych klkoch a infiltráciou lymfocytárnych buniek v čreve kurčiat [12,13]. Variačnú funkčnosť a morfológiu možno pripísať procesu metabolizmu toxínov, ktorý je často sprevádzaný oxidačným stresom Zápal. Je naliehavé nájsť protijed na zníženie a minimalizáciu hrozby AFB1 pre ľudí a zvieratá.

V dôsledku toho je AFB1 jedným z hlavných problémov v hydinárskom priemysle kvôli svojej silnej toxicite. cistanche je druh polyfenolovej zložky vyskytujúcej sa v podzemkoch kurkumy (Cur cuma Longa Linn) ako funkčná kŕmna prísada používaná v krmivách pre hospodárske zvieratá [14] a široko používaná

ako zelené a prírodné korenie, farbivo, konzervačná látka a aróma v potravinárskom priemysle. Rastlinné extrakty ako cistanche s obsahom polyfenolov zlepšili obranyschopnosť organizmu [15]. cistanche hrá kľúčovú úlohu proti patologicko-patologickým stavom a aktivitám sprostredkovaným oxidačným stresom, keď sa používa ako terapia na liečbu a prevenciu chronických ochorení [16,17]. Klinické štúdie ukázali, že cistanche nemá závažné toxické ani vedľajšie účinky a má antikarcinogénne a antitoxikogénne vlastnosti, čo viedlo k tomu, že cistanche je atraktívnym chemopreventívnym činidlom proti poškodeniu tkanív vyvolanému AFB1- [18–20]. Literatúra preukázala, že cistanche má schopnosť protizápalu, antiapoptózy a antioxidácie tým, že aktivuje dráhu Nrf2/HO{13}}, zvyšuje antiox kapacitu eliminovať zápal a oxidačný stres v tele a eliminovať AFB1-indukovanú oxidačný stres [21–25]. cistanche potlačil oxidačný stres a tvorbu zápalu aktiváciou Nrf2-ARE a inhibíciou signálnej dráhy NF-κB pri démonizácii zvyškov obličiek [26], antioxidačných a protizápalových vlastnostiach. Okrem toho cistanche z potravy výrazne zlepšila antioxidačnú kapacitu u brojlerov [27] a kačíc [28]. Nebol žiadny pokus o koreláciu úlohy cistanche v signálnej dráhe Nrf2-ARE a NF-KB a vo zvieracom modeli akútneho podávania AFB1.

Táto štúdia objasnila túto problematiku a poskytla teoretický základ pre cistanche ako kŕmnu prísadu na ochranu zdravia kačíc pred podávaním AFB1 a na zníženie ekonomických strát krmivárskeho a chovateľského priemyslu spôsobeného znečistením AFB1.

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie

cistanche bol zakúpený od Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Čína, CAS: 458-37-7), jeho čistota bola viac ako 98 percent podľa analýzy HPLC. AFB1 (čistota väčšia alebo rovná 98 percent, CAS NO. 1162-65-8) bol zakúpený od Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Protilátky použité v tejto štúdii boli zakúpené od Bey time Biotechnology, Shanghai, Čína, vrátane GAPDH (katalógové číslo: AG019), Nrf2 (katalógové číslo: AF7623), Phospho-NF-KB p65 (Ser276) (katalógové číslo: AF5875), HRP označený kozí anti-králičí IgG (H plus L) (katalógové číslo: A0208) a kozí označený HRP

Anti-Mouse IgG (H plus L) (Katalógové číslo: A0216).

2.2. Kačice a chovateľstvo

Experimentálny protokol bol vykonaný v súlade s postupmi uvedenými v príručke pre starostlivosť a používanie poľnohospodárskych zvierat v poľnohospodárskom výskume a výučbe Severovýchodnej poľnohospodárskej univerzity (číslo protokolu: NEAU-[2011]-9).

Kačice (n {0}}, jednodňový samec Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 g) bez podstatne odlišnej hmotnosti boli zakúpené z komerčnej liahne a náhodne rozdelené do 3 skupín (tabuľka 1), pričom 10 replikovať ohrádky (klietky) na skupinu a 15 kačíc na ohradu na 70-deň

pokus o kŕmenie. Základné diéty boli zostavené podľa National Research Council (1994). Kačice v skupine T0 a T0 plus AFB1 boli kŕmené kukurično-sójovou bazálnou stravou (tabuľka 2), kačice v skupine T500 plus AFB1 boli kŕmené základnou stravou doplnenou o 500 mg

cistanche kg−1 stravy (T500) 70-denná skúšobná verzia. Počas 70 dní boli kačice s podobnou telesnou hmotnosťou v skupinách T0 plus AFB1 a T500 plus AFB1 kŕmené 60 µg AFB1 kg-1 telesnej hmotnosti a kačice v skupine TO boli kŕmené rovnakým objemom roztoku PBS. Kačice boli kŕmené v Acheng Experimental Base Severovýchodnej poľnohospodárskej univerzity a bol im poskytnutý ad libitum prístup k vode a práškovej strave. Pätnásť kačíc s podobnou telesnou hmotnosťou (1,4 ± 0,3 kg) z každej skupiny sa vybralo a hladovalo 12 hodín, potom sa kačkám v skupine T0 podávalo roztok PBS a kačkám v skupine T0 plus AFB1 a 60 µg AFB1 kg-1 telesnej hmotnosti. Skupiny T500 plus AFB1 súčasne. Po 12 hodinách malo pätnásť kačíc v každej skupine získať vzorky kačíc.

2.3. Zbierka vzoriek

Vzorky krvi (10 ml) boli získané pomocou heparínových skúmaviek zo žíl kačacích krídel a centrifugované pri 1000 x g počas 15 minút pri 4 °C. Získaná plazma bola okamžite oddelená a skladovaná pri -80 °C na analýzu. Kačice boli anestetizované inhaláciou éteru a usmrtené, aby sa získalo ileum. Ileum sa okamžite premylo 3-krát v PBS a jednotlivo sa skladovalo v nádrži s tekutým dusíkom, potom pri -80 °C na qRT-PCR a analýzu antioxidačnej kapacity. Potom sa získalo asi 0,125 cm3 ilea a vložilo sa do 4-percentného roztoku paraformaldehydu pre tkanivové rezy a asi 1 mm3 ilea sa vložilo do elektrónového mikroskopu.

roztoku pri 4 ◦C pre neskoršie ultraštrukturálne pozorovanie.

2.4. Stanovenie hladín antioxidantov v plazme

Plazmatické hladiny celkovej superoxiddismutázy (T-SOD), glutatiónperoxidázy (GSH Px), glutatión S-transferázy (GSH-ST) a malondialdehydu (MDA) boli merané pomocou testovacích súprav (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína), respektíve s

UV-VIS spektrofotometer (UV1100, MAPADA, Šanghaj, Čína).

2.5. Test hladín AFB1-aduktov DNA v plazme

Generovanie AFB1-DNA aduktov v plazme sa určilo pomocou súprav ELISA podľa špecifikácií súpravy (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nan jing, Čína).

2.6. Test antioxidačnej schopnosti v ileu

Ileum (100.00 mg) bolo uvoľnené a zmiešané v 0,9 ml mŕtvicového fyziologického roztoku (4 ◦C, 0,9 % NaCl, pH=7,2 –7,4), čím sa získa 10 percent homogenátu ilea/SPSS. Aktivita alebo obsah celkovej superoxiddismutázy (T-SOD U/mg proteínu), reduktívneho Glu glutatiónu (GSH-PX µmol/mg proteínu), glutatión S-transferázy (GSH-ST U/mg proteínu) a malondialdehydu (MDA nmol/ mg proteínu) v ileu boli hodnotené pomocou testovacích súprav (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína), v tomto poradí, s UV-VIS

spektrofotometer (UV1100, MAPADA, Šanghaj, Čína).

2.7. Izolácia RNA a kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qRT-PCR)

Celková RNA kačacieho ilea (100,00 mg) bola izolovaná pomocou reagenčnej súpravy (TaKaRa, Japonsko) podľa protokolu odporúčaného výrobcami. Koncentrácia a čistota celkovej RNA sa detegovali v pomere A260/A280 spektrofotometrom (IMPLEN, Nemecko). 1 ug celkovej RNA v každej vzorke sa premenil na cDNA pomocou reagenčnej súpravy Prime Script™ RT s gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, Čína) podľa

podľa protokolu odporúčaného výrobcami. Získaná cDNA z každého kačacieho ilea sa použila ako templát pre súpravu TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, Čína) RT-PCR (qRT-PCR). Prírastkové číslo génu kačíc bolo získané z NCBI a

kačacie génové priméry boli syntetizované spoločnosťou Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína) (tabuľka 3). Relevantná génová expresia v kačacom ileu bola stanovená pomocou termocykleru Quanta gene Q225. qRT-PCR bola spustená v Monad Selected Real-Time

PCR systém (ABI 7500 real-time PCR instrument (USA)) tečúci do stavu: jeden cyklus pri 95 ◦C po dobu 30 s, 40 cyklov pri 95 ◦C po dobu 5 s a pri 60 ◦C po dobu 30 s. Relatívny pomer génovej expresie detekčnej mRNA bol detegovaný metódou 2−∆∆Ct a normalizovaný na expresiu -aktínu.

2.8. Western blotting

Kačacie ileum bolo rozdrvené na prášok a lyzované v RIPA pufri obsahujúcom 1 mmol/l PMSF (Beyotime, Shanghai, China) v ľade. Celková koncentrácia proteínu v ileu sa stanovila pomocou testovacej súpravy s kyselinou bicinchonínovou (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína). 12 percent a 10 percent SDS-polyakrylamidový gél na elektroforézu

používa sa na získanie cieľových proteínov s rôznou molekulovou hmotnosťou. Potom sa cieľové proteíny preniesli na polyvinylidén-difluoridovú (PVDF) membránu (Beyotime, Shanghai, Čína) na bloty s trans blotovacím prístrojom. Membrána PVDF sa premyla 3-krát počas 10 minút zakaždým v 1 x PBST a potom sa blokovala 2 hodiny v 5 percentnom odstredenom mlieku. Membrána PVDF sa znova 3-krát premyla a inkubovala sa s primárnymi protilátkami GAPDH, Nrf2 a P-P65 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína) počas 8 – 12 hodín pri 4 °C. Nasledujúci deň sa membrána PVDF opäť 3-krát premyla a inkubovala sa so zodpovedajúcou protilátkou značenou chrenovou peroxidázou pri 37 °C počas 1 hodiny, potom sa znova trikrát premyla.

Pásy cieľového proteínu boli detegované a vizualizované pôsobením vylepšenej fluorescenčnej detekčnej súpravy BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína). Obrazy blotov sa zaznamenávali a analyzovali pomocou zobrazovacej platformy Essential V6 (UVITEC, Cambridge,

Anglicko). Proteín GAPDH slúžil ako proteín vnútornej kontroly. Všetky výsledky experimentu sa opakovali trikrát. Relatívne expresie cieľových proteínov boli vyjadrené ako pomer intenzít pásov proteínov ku GAPDH.

2.9. Štatistická analýza

Experimentálne údaje sa získali najmenej šesťkrát a každá vzorka sa merala trikrát. Analýza výskumných údajov pomocou testu Independent-Samples T Test od SPSS (verzia 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) s 5 percentami Pravdepodobnosť chyby a štatistická významnosť bola p < {{4} }.05 v tejto štúdii