Diferenciácia, obličky, nefrogenéza, progenitory nefrónov,

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ABSTRAKT

Nefrón, definovaný počas fetálneho obdobia, určuje zdravie obličiek a súvisiace kardiovaskulárne zdravie počas celého života. Tu ukazujeme, že napriek jeho negatívnym účinkom narast obličiekgenetické zvýšenie GDNF predlžuje nefrogénny program nad jeho normálne zastavenie. Viacstupňová mechanická analýza odhalila, že nadbytok GDNF udržuje progenitory nefrónov a nefrogenézu prostredníctvom zvýšenej expresie jeho sekretovaných cieľov a rozšírenej signalizácie WNT, čo vedie k dvojdielnemu účinku na udržiavanie progenitorov nefrónov. Abnormálne vysoký GDNF in embryonálne obličky upregulujejeho známe ciele, ale aj Wnt9b a Axin2, so súčasným spomalením proliferácie progenitorov nefrónov. Pokles hladín GDNF v postnatálnom obdobíobličky sa normalizujúureterický pupeň a vytvára permisívne prostredie pre pokračovanie nefrogénneho programu, čo dokazuje morfologicky a molekulárne normálna postnatálna samoobnova a diferenciácia progenitorov nefrónu. Tieto výsledky potvrdzujú, že nadbytok GDNF má dvojfázový účinok na progenitory nefrónov u myší, ktoré môžu verne reagovať na manipuláciu s dávkou GDNF počas fetálneho a postnatálneho obdobia. Naše výsledky naznačujú, že snímanie úrovne signalizačnej aktivity je dôležitým mechanizmom, prostredníctvom ktorého GDNF a ďalšie molekuly prispievajú k špecifikácii životnosti progenitorov nefrónov.

doplnok cistanche tubulosa vs dezerticolaprevýživa obličiek

ÚVOD

Oblička cicavcov je neregeneračný orgán na filtráciu krvi so základnými funkciami detoxikácie a rovnováhy elektrolytov.

Nefróny vykonávajúce tieto funkcie sa rodia počas fetálneho obdobia, pretože dospelá oblička vykazuje iba obmedzenú reparačnú kapacitu alebo kompenzačné glomerulárne zväčšenie (hypertrofiu) (Cawla a Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). Vrodená nízka hmota nefrónov je široko akceptovaným rizikovým faktorom pre hypertenziu, proteinúriu, glomerulosklerózu a konečné štádium ochorenia obličiek (Bertram a kol., 2011; Hoy a kol., 2008), a tak výrazne ovplyvňuje zdravie obličiek počas celého života. Nefrogénny program končí medzi gestačnými týždňami 35-37 u ľudí a postnatálnym dňom (P) 3 u myší (Hartman a kol., 2007; Hinchliffe a kol., 1991; Ryan a kol., 2018), ale mechanizmy prispievajúce k zastaveniu sú zle pochopené. Predpokladalo sa, že sú zahrnuté zmeny v rastových vzorcoch špecifické pre štádium (Cebrián a kol., 2004) a vnútorné mechanizmy snímania veku buniek (Chen a kol., 2015a). Molekulárne sa na stanovení nefrogénnych trvanie programu. Plasticita nefrogénneho programu však nebola úplne preskúmaná. Nefróny sa odlišujú od skupiny progenitorov nefrónov (NP), známej tiež ako metanefrický alebo čiapočkový mezenchým. NP exprimujúce jedinečný repertoár markerov vrátane SIX2, neurotrofického faktora odvodeného od gliálnej bunkovej línie (GDNF) a CITED1 sú prítomné iba v embryonálnej obličke, kde obklopujú každý hrot ureterického pupenu (UB) od jeho založenia (Boyle et al., 2008; Self a kol., 2006). Proces nefrogenézy je synchronizovaný s vetvením UB, ktoré súčasne udržiava samoobnovu v nediferencovanej populácii NP a indukuje podskupinu NP, aby podstúpila postupný prechod mezenchýmu na epitel prostredníctvom dobre definovaných prekurzorových štádií (pretubulárne agregáty, PA; obličkové vezikuly , RV; telieska v tvare čiarky, CSB; telieska v tvare písmena S, SSB), ktoré sa nakoniec diferencujú na funkčné nefróny (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). Rovnováha v samoobnovení versus diferenciácia v rámci populácie NP závisí od signálov sprostredkujúcich vzájomné interakcie induktívneho tkaniva, ktoré prebiehajú medzi UB a susedným mezenchýmom. Metanefrický mezenchým a signály odvodené od NP, ako sú GDNF a fibroblastové rastové faktory (FGF), regulujú morfogenézu UB, prostredníctvom ktorej embryonálna oblička rastie vo veľkosti, dosahuje svoj tvar a vytvára systém zberných kanálikov (Costantini a Kopan, 2010). GDNF-aktivovaná RET signalizácia v UB hrotoch reguluje transkripčný profil zodpovedný za kontrolu zberu progenitorov kanálikov a morfogenézu UB (Kurtzeborn a kol., 2018; Li a kol., 2019; Lu a kol., 2009; Ola a kol. , 2011; Riccio a kol., 2016). GDNF-regulované transkripty tiež obsahujú vylučované proteíny, ako sú WNT11 a CRLF1, s preukázaným potenciálom regulovať nefrogénny program (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). Ďalšími regulátormi nefrogenézy odvodenými od UB sú WNT9b a FGF-ligandy ovplyvňujúce udržiavanie a diferenciáciu NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). Už sme predtým uviedli, že genetické narušenie Gdnf 3′ nepreloženej oblasti spôsobuje 3- až 6-násobne zvýšenú expresiu endogénneho GDNF a vedie k renálnej hypoplázii v dôsledku defektu vetvenia UB (Kumar et al., 2015). Na rozdiel od novorodeneckej letality pri knockoutoch Gdnf, myši Gdnfhyper/hyper prežijú až 3 týždne a odhalili zásadnú úlohu GDNF pri zbieraní progenitorov kanálov pri samoobnovení (Costantini, 2012; Kumar a kol., 2015; Li a kol., 2019). Tu demonštrujeme, že nadbytok GDNF, napriek jeho negatívnemu účinku na celkový rast obličiek, môže predĺžiť životnosť NP, čím ďalej posilní novo rozpoznanú plasticitu obličiek cicavcov.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ:Diferenciácia, obličky, nefrogenéza, progenitory nefrónov, myš

VÝSLEDKY

Embryonálny nefrogénny program závisí od GDNF

Priestorové usporiadanie ŠESTI2-pozitívnych NP v embryonálnom a skorom postnatálnom obdobíobličkysleduje stereotypný, dobre opísaný vzor, ​​v ktorom sa počiatočné viacbunkové vrstvené tkanivo časom stenčuje bez veľkého vplyvu na celkovú organizáciu výklenku (Short et al., 2014). NP v Gdnfhyper/hyper obličkách boli distribuované okolo abnormálne širokého UB ako tenšia vrstva (obr. 1A-F; obr. S1A,B). Kvantifikácia NP pri E11.5 odhalila počiatočný nárast, ktorý bol prechodne normalizovaný pri E12.5, ale výrazne sa znížil pri E14.5 v Gdnfhyper/hyper obličkách (obr. 1E-G; obr. S1C-F). Analýza mitózy ukázala, že ako endogénne zvýšený, tak aj exogénne doplnený GDNF spôsobuje významné zníženie pHH3 plus NPC (obr. 1H; obr. S1G). Súhrnne údaje ukazujú, že nadbytok GDNF, ktorý primárne funguje v UB, kde sú exprimované jeho receptory (Pachnis et al., 1993), vyvoláva rýchly pokles proliferácie NP buniek počas skorého vývoja obličiek.

Je známe, že predčasná alebo zrýchlená diferenciácia NP môže spôsobiť pokles NP buniek v ich výklenku (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). Aby sa to vyhodnotilo, nefrogenéza sa skúmala farbením LEF1 a cyklínom D1, ktoré označujú najskoršie bunky viazané na diferenciáciu a nefróny, ktoré prechádzajú úplnou epitelizáciou (Lindström et al., 2015). To ukázalo všeobecný pokles počtu skorých prekurzorov nefrónov a indikovalo zníženú diferenciáciu nefrónov v embryonálnych Gdnfhyper/hyperobličky(obr. 2). Hodnotenie glomerulárnej hustoty to ďalej podporilo a preukázalo nižšie celkové hustoty v hypodysplastických Gdnfhyper/hyper obličkách ako v obličkách divokého typu (WT) (obr. S1G). Je zaujímavé, že analýza kortikálnych glomerulov v rámci celkovej meranej plochy a najmä pomery kortikálnych glomerulov k celkovým glomerulom odhalili mierne vyššie pomery ako WT v Gdnfhyper/hyper (tabuľka 1; 17 percent v Gdnfhyper/hyper, 12 percent vo WT). To naznačuje, že napriek skorému spomaleniu samoobnovy a diferenciácie NP, obličky, ktoré čelia prebytku GDNF počas organogenézy, majú pokračujúcu postnatálnu nefrogenézu s malým zvýšením počtu najnovších narodených nefrónov, ktoré sú najviac kortikálne umiestnené (Rumballe et al., 2011; Short a kol., 2014).

Nadbytok GDNF predlžuje životnosť postnatálneho fondu NPMnoho myších modelov s nedostatkom vrast obličiek, buď v dôsledku morfogenézy UB a / alebo diferenciácie nefrónov, zomierajú ihneď po narodení (Kuure a Sariola, 2020). Napriek významnej hypoplázii, abnormalitám v morfológii UB a vážne narušenej embryonálnej nefrogenéze (obr. 2), myši Gdnfhyper/hyper prežívajú až 3 týždne po narodení (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), čo poskytuje možnosť na vyšetrenie postnatálnej nefrogenézy.

Ako sa zistilo (O'Brien, 2018), naša analýza populácií NP na P1-P10 odhalila dramatickú stratu v obličkách WT na P3, v ktorých sa SIX2-pozitivita zistila hlavne v

diferenciačné prekurzory nefrónov a iba 10 percent analyzovaných UB hrotov (výklenkov) bolo pokrytých progenitorovými bunkami nefrónov (NPC) (obr. 3A, n=2 obličiek). ŠESŤ2- pozitívnych NP však bolo zistených v 59 percentách Gdnfhyper/hyper výklenkov na P3 (obr. 3B, n=2 obličiek). Podobne boli PAX2-pozitívne NP detegované v NP výklenkoch Gdnfhyper/hyper obličiek na P3, ale PAX{10}}pozitívne bunky sa lokalizovali výlučne v diferencujúcich sa prekurzoroch nefrónov vo WTobličky(Obr. 3C, D).

Nefrogenéza v postnatálnej Gdnfhyper/hyperobličkypreukázali významné zlepšenie v porovnaní s embryonálnymi obličkami, čo dokazujú podobné vzory prekurzorov nefrónov vo WT a Gdnfhyper/hyper obličkách (obr. 3E-H; porovnaj s obr. 2). nakoniec

zistili sme, že ∼18 percent NP výklenkov si udržalo ŠESŤ2-pozitívnych NPC na P4 a angažované NPC boli prítomné v Gdnfhyper/hyperobličkydo P6, zatiaľ čo spáchané NPC boli zistené vo WT

obličkylen do P4 (obr. 4; obr. S1H). To ukazuje, že životnosť NP in vivo nie je vopred stanovená a naznačuje, že modulácia hladín rastového faktora, konkrétne GDNF, prispieva k načasovaniu konečnej vlny diferenciácie nefrónov.

Predpokladali sme, že perzistentné NPC v postnatálnych Gdnfhyper/hyper obličkách by mohli byť buď výsledkom všeobecných kompenzačných mechanizmov vyvolaných defektmi vetvenia UB vedúcimi k hypoplázii obličiek (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) alebo alternatívne odvodené od GDNF-špecifického účinky na populáciu NP. Na rozlíšenie medzi možnosťami sa postnatálne NP analyzovali v iných modeloch renálnej hypoplázie. Fgf9;20-nedostatočnýobličkyvykazujú podobné stenčovanie vrstiev embryonálnych NP buniek (Barak et al., 2012), ako bolo zistené v Gdnfhyper/hyperobličky, ale nepodarilo sa nám odhaliť SIX2- a/alebo PAX2-pozitívne bunky v ich postnatálnych NP výklenkoch (obr. S2). Aby sme to ďalej rozviedli, ďalej sme analyzovali Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 plus /− obličky (Ihermann-Hella et al., 2014), v ktorých je podobne ako u myší Gdnfhyper/hyper hypoplázia obličiek spôsobená poruchou vetvenia UB. Tomuto modelu tiež chýbali známky predĺženej nefrogenézy, ako sa zistilo na základe prítomnosti SIX{8}} a/alebo PAX{9}}pozitívnych buniek v ich postnatálnych NP výklenkoch (obr. S3), čo podporuje názor, že renálna hypoplázia ako to nestačí na udržanie postnatálnej nefrogenézy.

Publikované údaje tiež ukazujú, že samotná renálna hypoplázia nie je schopná podporovať postnatálnu údržbu NP (Kuure a Sariola, 2020), čo ďalej naznačuje aktívnu úlohu GDNF. Nemôžeme však úplne vylúčiť možnosť, že nadbytok rastových faktorov iných ako GDNF bude mať rovnaký účinok.

Pretrvávajúce postnatálne NP udržiavajú nefrogénny program po jeho normálnom ukončení

Pretrvávajúce postnatálne NP udržiavajú nefrogénny program po jeho normálnom ukončení

Ďalej, diferenciačný potenciál trvalých NP v postnatálnom Gdnfhyper/hyperobličkybol vyšetrený. Analýza Ki67 odhalila porovnateľné vzory postnatálnej proliferácie vo WT a Gdnfhyper/hyper obličkách až do P4 (obr. 5A, B). Od P5 sa Ki67-pozitívne bunky znižovali v kortikálnej diferenciačnej zóne WT obličiek (obr. 5C,E,G). Takýto pokles kortikálnej proliferácie nebol zistený v Gdnfhyper/hyper obličkách, ktoré vykazovali aktívne cyklovanie buniek v štruktúrach podobných prekurzorom nefrónu na P7 (obr. 5D, F,

H), ale už nie na P12 (obr. S4A,B).

Postnatálna analýza diferenciácie nefrónov preukázala nadmerné množstvo prekurzorov nefrónov v Gdnfhyper/hyperobličkydo P7, pričom tieto boli detegované v obličkách WT len do P4 (obr. 6; obr. S4C-F). Takáto perzistentná postnatálna nefrogenéza však nezvýšila glomerulárnu hustotu v porovnaní s neskorými embryonálnymi štádiami (obr. S5A-C; 6,4 ± 2,1 oproti 10,2 ± 1,2; priemer ± sem). Podiel kortikálnych glomerulov v Gdnfhyper/hyper obličkách na P7 (59 percent) je 1,5× vyšší

Obr. 1. Progenitory nefrónov sú vyčerpané v embryonálnom Gdnf hyper/hyperobličky. (A,B) Marker progenitoru nefrónu (NP) SIX2 (červený) sa lokalizuje na špičkách ureterických pupenov (UB) uzatvárajúcich mezenchým (kalbindín, zelená) vo WT (A; n=4 obličkách) a Gdnfhyper/hyper (B; n=5 obličky) obličky pri E11.5. (C,D) E12.5 WT (C) a Gdnfhyper/hyper (D) obličky kultivované in vitro počas 24 hodín a zafarbené na SIX2 (červená) na vizualizáciu populácie NP a kalbindínu (zelená) na UB (n{{9} } obličky/ liečba, tri nezávislé experimenty). (E,F) NP sú hojné v obličkách E14,5 WT (E; 42,6/tip), zatiaľ čo v Gdnfhyper/hyper obličky sú NP jasne znížené (F; šípky, 29,8/hrot) (n=207 pre WT a 431 pre Gdnfhyper/hyper hroty analyzované v deviatich obličkách/genotyp).

Biele šípky ukazujú na bunky NP (červené).

(G) Analýza SIX2-kladných NP vo WT a Gdnfhyper/hyperobličkyukazuje porovnateľné počiatočné zásoby NP pri E12,5. Údaje sú prezentované ako priemerné množstvo SIX2-pozitívnych NP ± sem v porovnaní s počtom WT súrodencov, ktoré sú nastavené na 100 percent a odrážajú výsledky získané zo štyroch nezávislých vrhov (WT: 100±15,61 percent , n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124,74±33,89 percent, n=5; P=0,533, obojstranný t-test v SPSS). (H) Podiel proliferujúcich SIX2-pozitívnych NP v Gdnfhyper/hyper obličkách pri E12,5 vykazuje významný pokles v porovnaní s obličkami WT. Údaje sú prezentované ako priemerný podiel proliferujúcich SIX2-pozitívnych NP ± sem v porovnaní s tými WT súrodencami, ktoré sú nastavené na 100 percent a odrážajú výsledky získané z troch nezávislých vrhov (WT: 100±9,04 percent , n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56,94±12,67 percent , n=5;

*P=0.024, dvojstranný t-test v SPSS). Mierka: 100 um.

ako vo WTobličky(39 percent) (tabuľka 1), čo podporuje názor, že pretrvávajúci postnatálny fond NP v Gdnfhyper/hyper obličkách indukuje nové nefróny po normálnom zastavení nefrogenézy.

Myši Gdnfhyper/hyper s predĺženou nefrogenézou v ťažko hypodysplastických obličkách nevykazujú žiadne známky neoplázie alebo tumorigenézy počas ich krátkej životnosti (Kumar a kol., 2015; Turconi a kol., 2020).

Gdnfwt/hyper obličky vykazujú miernejší embryonálny pokles NPC ako Gdnfhyper/hyperobličky. Tieto myši žijú normálnu dĺžku života a nevykazujú nádoryobličkys a ďalšie orgány (Turconi et al., 2020) (obr. S6A-D, n=62). Dvojnásobné zvýšenie GDNF počas embryogenézy však nedokáže udržať populáciu NP v postnatálnych Gdnfwt/hyper obličkách (obr. S6E, F), čo naznačuje tesnosť

Obr. 2. Účinok prebytku GDNF na embryonálnu nefrogenézu. (A) LEF1 (červená), marker pretubulárnych agregátov, distálnych obličkových vezikúl a teliesok v tvare písmena S, v obličke WT E14.5. (B) E14.5 Gdnfhyper/hyper oblička vykazuje veľmi málo LEF1-pozitívnych diferencujúcich nefrónových prekurzorov a typické množstvo epitelu ureterických pupenov (UB), ako sa zistilo farbením kalbindínom (zelená).

(C) Cyklín D1 (červený) farbí všetky prekurzory diferencujúcich nefrónov (hviezdičky označujú pretubulárne agregáty a telieska v tvare čiarky, šípky ukazujú na telieska v tvare S), ktoré možno hojne pozorovať vedľa epitelu UB (zelená) v E14.5 WTobličky.

(D) V E14.5 Gdnfhyper/hyper sa zistilo podstatne menej diferencujúcich sa prekurzorov nefrónovobličky. (E,F) Cyklín D1 (červená) lokalizácia v E16.5 WT (E) a

Gdnfhyper/hyper (F) obličky. Calbindin (zelený)

farbenie vizualizuje UB epitel na všetkých obrázkoch. Pre každé farbenie v danom štádiu n=3 obličiek/genotyp. Mierka: 100 um.

Tabuľka 1. Kvantifikácia glomerulárnej hustoty v Gdnfhyper/hyper obličkách pri E18.5 a P7

Údaje predstavujú priemerné množstvo nefrónu na kubický mm±sem (n=4 obličiek/genotyp, priemerne osem sklíčok analyzovaných pre každú obličku s intervalmi 125 µm, aby sa predišlo opakovaniu rovnakých glomerulov). Podiel kortikálnych glomerulov v obličkách WT pri E18,5 je 12 percent, zatiaľ čo v obličkách Gdnfhyper/hyper je to 17 percent. Pri P7 sa podiel glomerulov v kortexe ďalej zvyšuje v Gdnfhyper/hyperobličky,čo naznačuje, že nefróny sa stále aktívne diferencujú.

prahová hranica schopnosti GDNF modulovať nefrogénny program.

Pretrvávajúca postnatálna nefrogenéza závisí od zmien v signalizácii indukovanej GDNF

Expresia Gdnf sa stráca z obličiek WT pomocou P2 (www.gudmap.org), zatiaľ čo jeho mRNA a proteín sú stále prítomné v Gdnfhyper/hyper

Pretrvávajúca postnatálna nefrogenéza závisí od zmien v signalizácii indukovanej GDNF

Výraz Gdnf sa z WT stratilobličkyod P2 (www.gudmap.org), zatiaľ čo jeho mRNA a proteín sú stále prítomné v Gdnfhyper/hyper

obličkyaž P7 (obr. 7A-D). Konzervatívny komplex GDNF receptorov je exprimovaný iba v epitelových UB hrotoch (Costantini, 2012;

Golden a kol., 1999). Vzhľadom na lokalizáciu receptora v tkanive susediacom s populáciou NPC sme mali podozrenie, že účinky zvýšeného endogénneho GDNF na nefrogenézu musia byť sprostredkované

prostredníctvom UB-odvodenej, secernovanej, GDNF-dependentnej molekuly (molekúl) (http:/www.signalpeptide.de/index.php) (Lu a kol., 2009; Ola a kol., 2011; Schmidt-Ott a kol., 2005) (tabuľka 2), alebo iné molekuly, ktorých expresia by sa mohla zmeniť v dôsledku predimenzovaného UB.

Analýza expresie UB-odvodených, secernovaných GDNF-cieľov odhalila významnú upreguláciu Crlf1, Srgn a Wnt11 v Gdnfhyper/hyper obličkách v E14.5 (obr. 7E). Výrazne sa zvýšila aj expresia Wnt9b (obr. 7E). Ďalšia analýza signálnych cieľov WNT/ - katenínu (Clevers a Nusse, 2012) v kontrole E14.5 a Gdnfhyper/hyper obličkách preukázala významnú upreguláciu kanonického cieľa Axin2 (P=0.003371), zatiaľ čo WNT exprimovaný NP ciele (Karner et al., 2011) ukázali trend downregulácie, ktorý pravdepodobne odráža znížený celkový počet NPC (obr. S7A). Spoločne to naznačuje, že nielen rozšírená signalizácia indukovaná GDNF, ale aj zvýšená signalizácia indukovaná Wnt9- a Wnt{21}}so známymi funkciami v regulácii NPC sa podieľa na sprostredkovaní recipročnej komunikácie z mutantnej UB do susednej skupiny NP pri E14.5 (Karner a kol., 2011; Kiefer a kol., 2012; Nagy a kol., 2016; O'Brien a kol., 2018).

Obr. 3. Diferenciácia nefrónov pri zastavení renálnej morfogenézy. (A) Oblička P3 WT stratila kortikálnych ŠESŤ{2}}pozitívnych nefrónových progenitorov (NP), ako ukazuje strata buniek v mezenchýme čiapky (šípka). Namiesto toho sa SIX2 lokalizuje do laterálneho mezenchýmu a skorých prekurzorov nefrónov (šípky).

Kvantifikácia 48 výklenkov NP (analyzované počty tipov) odhalila iba päť výklenkov s NP. (B) Cap mezenchým pozitívny na SIX2 je stále prítomný v Gdnfhyper/hyper obličke v P3 (šípky). Kvantifikácia 107 NP výklenkov (analyzované počty hrotov) odhalila 63 výklenkov s NP bunkami. Farbenie (C,D) PAX2 (červené) a kalbindínom (zelené) vo WT (C) a Gdnfhyper/hyper

(D) obličky v P3. Šípky ukazujú na pozíciu, kde sú NP bunky udržiavané v Gdnfhyper/hyperobličky.

(E,F) Porovnateľné množstvo cyklín D1-pozitívnych (červených) prekurzorov nefrónu v P3 WT (E) a Gdnfhyper/hyper

(F) obličky. (G,H) Vizualizácia LEF1-pozitívnych prekurzorov nefrónov (červená) a ureterického epitelu (zelená) odhaľuje podobnú prebiehajúcu nefrogenézu u WT

(G) a Gdnfhyper/hyper (H) obličky. Pre každé farbenie

n=3 obličiek/genotyp. Mierka: 100 um.

Molekulárna charakterizácia P5 Gdnfhyper/hyperobličkyukázali pretrvávajúcu upreguláciu Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 a Uncx4.1 (tiež známy ako Uncx), ale tiež odhalili zvýšenú expresiu potenciálneho nikového faktora Lama1 (Rayagiri et al., 2018), induktora diferenciácie nefrónov Wnt4 (Stark a kol. , 1994) a WNT signalizačného agonistu R-spondin 1 (Rspo1) (obr. 7F; obr. S7B). Takýto transkripčný profil naznačuje rozšírený účinok odvodený od UB na NP, u ktorých sa zdá, že podliehajú diferenciačnej vlne na základe zníženej expresie Fgf9 a Fgf20 a posunutej lokalizácie buniek SIX2 plus (obrázky 4C, D a 7F). Funkčne sme testovali, či najvýznamnejšie zvýšené expresie Crfl1, Wnt11 a Wnt9b môžu ovplyvniť nefrogénny program u myši. CRLF1 v komplexe so svojim fyziologickým ligandom cytokínom podobným kardiotrofínu indukuje diferenciáciu v izolovaných kultúrach mezenchýmu obličiek potkanov (Schmidt-Ott et al., 2005). Charakterizácia Crfl1-knockout obličiek odhalila porovnateľnú veľkosť obličiek a nefrogenézu s obličkami WT (obr. S6C-F), čo naznačuje postradateľné funkcie CRLF1 in vivo. Ďalej bol testovaný príspevok zvýšenej kanonickej WNT signalizácie k fenotypom spôsobeným nadbytkom GDNF. IWR1 inhibuje tankyrázy 1 a 2, ktoré sú nevyhnutné pre normálny vývoj obličiek (Chen a kol., 2009; Huang a kol., 2009; Karner a kol., 2010). Liečba IWR1 zmiernila počty a morfológiu hrotov UB v prítomnosti prebytku GDNF (obr. S8). Nakoniec sme sa opýtali, či významne zvýšená expresia Wnt11 v obličkách Gdnfhyper / hyper prispieva k predĺženému nefrogénnemu programu u myší Gdnfhyper / hyper prechodom Wnt11 knockout alely na pozadie Gdnfhyper. Toto nedokázalo vytvoriť dvojitého homozygota

Obr. 4. Progenitory nefrónov sú trvalo udržiavané v postnatálnych Gdnfhyper/hyper obličkách. (A, B) Lokalizácia markera progenitoru nefrónu (NP) SIX2 (červená) vo WT na P4 (A) a P6 (B) ukazuje stratu NP v obličkách WT, v ktorých sa SIX2 nachádza iba v slabo pozitívnych obličkových vezikulách (hviezdičky) . (C) V Gdnfhyper/hyper obličkách na P4 sa SIX2 lokalizuje aj na NP, ktoré uzatvárajú ureterické pupene (zelené) hroty (šípky) (n=315 hrotov vo WT a 245 v Gdnfhyper/hyper analyzovaných v štyroch obličkách/genotyp). (D) Lokalizácia SIX2 (červená) a kalbindínu (zelená) v P6 Gdnfhyper/hyper obličkách odhaľuje pretrvávanie odovzdaných NP buniek (13; * označuje diferencujúce nefróny) v mutantnej obličke (n=3 obličiek/genotyp) . Kvantifikácia výklenkov NP buniek ukázala veľmi málo tipov, ktoré nemali žiadnych ŠESŤ2-pozitívnych NP v obličkách WT, zatiaľ čo 81 percent výklenkov v Gdnfhyper/hyper obličkách (n=2, 16 výklenkov) bolo sprevádzaných so SIX{17}}pozitivitou v potvrdených a diferencujúcich sa prekurzoroch nefrónov. Mierka: 100 um.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− potomstvo (tabuľka 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /− chov). Tieto výsledky naznačujú embryonálnu letalitu pre mutanty Gdnfhyper / hyper; Wnt11 - / - a prinútili nás zamerať analýzu na obličky Gdnfhyper / hyper; Wnt11 plus / -. Odstránenie jednej alely Wnt11 v pozadí Gdnfhyper/hyper mierne zlepšilo morfológiu UB a znížilo veľkosť obličiek ďalej od veľkosti v obličkách Gdnfhyper/hyper, čo pravdepodobne odráža zníženú tvorbu cýst zberných kanálikov po znížení dávky Wnt11 (obr. S9A-C). ŠESŤ{12}}pozitívna NP populácia sa však zvýšila (29,8 NPC/tip oproti 40,7 NPC/tip pri E14,5 a 20,3 NPC/tip oproti 30,9 pri P0) a nefrogenéza sa zlepšila v kortikálnej diferenciačnej zóne Gdnfhyper/hyper ;Wnt1 plus /- obličky (obr. 8; obr. S9D-F; porovnaj aj s obr. 1F). Tieto výsledky teda naznačujú, že zvýšené hladiny GDNF zvyšujú niekoľko cieľov GDNF/Ret odvodených od púčikov, ktoré nie samotné, ale vo vzájomnej kombinácii a spolu so zvýšenou kanonickou WNT signalizáciou regulujú NPC v embryonálnych obličkách.

DISKUSIA Počet nefrónov je definovaný počas života plodu a môže sa medzi jednotlivcami značne líšiť. Expanzia a životnosť NP výrazne ovplyvňuje konečné vybavenie nefrónov, a preto je dôležitá identifikácia regulačných mechanizmov, ktoré riadia samoobnovu NP. Tu ukazujeme, že neurotropný faktor GDNF, o ktorom je známe, že iniciuje vývoj obličiek a reguluje morfogenézu UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn a kol., 2018; Li a kol., 2019), je napriek svojim negatívnym účinkom na rast obličiek schopný predĺženia nefrogénneho programu nad jeho normálne zastavenie. Naše výsledky ukazujú, že nadbytok GDNF má dvojfázový účinok na samoobnovu a udržiavanie NP. Na základe našej analýzy navrhujeme model fungovania nadbytku GDNF v Gdnfhyper/hyper obličkách

prostredníctvom mechanizmov, ktoré zahŕňajú zmeny v progresii bunkového cyklu a schopnosti snímať hladiny rastových faktorov. Spočiatku v embryonálnych obličkách spôsobujú vysoké hladiny GDNF rýchly pokles počtu NP na niku, čo je typické pre mnohé modely myší s primárnym deficitom UB (Carroll a Das, 2013; Chen a kol., 2015b; Costantini a Kopan, 2010; Liu a kol., 2018). Predčasný pokles NP pozorovaný v týchto predtým publikovaných modeloch je zvyčajne spôsobený ich predčasnou diferenciáciou, čo nie je prípad Gdnfhyper/hyper obličiek. Namiesto toho je nadbytok GDNF schopný udržať aktívny bunkový cyklus v postnatálnej obličkovej kôre podstatne dlhšie, ako je vidieť v obličkách WT. Proliferácia sa vyskytuje v NP bunkách, ktoré sú udržiavané dlhšie ako v obličkách WT, a stále produkujú nové nefróny. V budúcnosti bude zaujímavé sledovať, či bude možné podávať nadbytok GDNF spôsobom priaznivým pre pokračujúcu postnatálnu nefrogenézu bez vážneho ovplyvnenia morfogenézy UB, aby sa narušil celkový rast orgánu. Naše údaje ukazujú, že skorý pokles embryonálnych NP Gdnfhyper/hyper obličiek je spôsobený skôr zníženou proliferáciou buniek než zvýšenou predčasnou diferenciáciou. Tento bunkový mechanizmus podporujú molekulárne zmeny detekované v známych cieľoch GDNF (Crlf1, Wnt11 a Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) a v dôležitých regulátoroch signalizácie udržiavania buniek NP (Wnt9b, Wnt11 a ich transkripčné ciele) (Karner a kol., 2011; Kiefer a kol., 2012; O'Brien a kol., 2018). Predchádzajúce skúmanie dlhovekosti a odolnosti NP buniek abláciou populácie NP difterickým toxínom A alebo narušením aktivácie MAPK/ERK, čo malo za následok rýchly pokles NP buniek bez pozitívneho vplyvu na ich životnosť (Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella et al., 2018), spolu s našimi výsledkami naznačujú, že proliferácia NP buniek zo svojej podstaty zohráva hlavnú úlohu pri definovaní ich celkovej životnosti. V zhode, NP bunky v neskorých embryonálnych obličkách vykazujú výrazne zníženú mieru proliferácie a zrýchlenú diferenciáciu, zatiaľ čo transplantácia starých NP buniek do obličiek v skoršom štádiu predlžuje ich životnosť (Chen et al., 2015a). Na základe našich výsledkov navrhujeme, aby GDNF prispieval k mechanizmu, prostredníctvom ktorého NP bunky vnímajú svoj vývojový vek a v konečnom dôsledku ich životnosť. V normálnej obličke je expresia GDNF vysoká na začiatku morfogenézy obličiek a počas fázy aktívneho rastu, zatiaľ čo v neskorých embryonálnych obličkách dochádza k jasnému poklesu hladín GDNF, čo vedie k strate expresie v skorom postnatálnom štádiu (obrázky 7 a 9). . Hladiny GDNF v skorých Gdnfhyper/hyper obličkách sú abnormálne vysoké, čo sa zdá byť inhibičné pre proliferáciu NP buniek, pravdepodobne v dôsledku zistených bunkových a molekulárnych zmien v mutantnom UB, ako je napríklad zmenená dráha WNT

(Obr. 7E, F; Obr. S7A, B), ktorý má známe účinky na biológiu NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Podobne ako v obličkách WT sa hladiny Gdnf mRNA a GDNF proteínu znižujú v postnatálnych Gdnfhyper/hyper obličkách, v ktorých sa Gdnf manipuluje na post-transkripčnej úrovni, čo umožňuje endogénnu dočasnú reguláciu expresie (Kumar et al., 2015). To pravdepodobne znižuje expresiu GDNF na úroveň, ktorá je prípustná pre samoobnovu a diferenciáciu NP buniek, ktoré sa detegujú ako trvalý nefrogénny program v postnatálnych obličkách (obr. 9). Takáto novorozpoznaná plasticita závislá od rastového faktora v renálnej diferenciácii nesie nádej na jej využitie na regeneračné účely v budúcnosti. Prvé indície o možnosti predĺženia obdobia diferenciácie nefrónov pochádzajú z experimentov inhibujúcich BMP/

Obr. 5. Trvalá kortikálna proliferácia v postnatálnych Gdnfhyper/hyper obličkách. (A, B) Farbenie Ki67 v obličkách P4 WT (A) a Gdnfhyper/hyper (B) ukazuje podobný vzor proliferatívnych buniek v kortikálnych obličkách (červené šípky) oboch genotypov. (C,D) V obličkách P5 WT (C) je Ki67-pozitivita významne znížená v kortexe (červená šípka), zatiaľ čo obličky Gdnfhyper/hyper (D) stále vykazujú fokálne veľmi vysokú proliferáciu (červené šípky). (E,F) Proliferácia v kortikálnej obličke WT (E) je ďalej znížená na P6, zatiaľ čo zostáva vysoko aktívna v Gdnfhyper/hyper obličkách (F). (G,H) Ki67-pozitívne proliferatívne bunky sa lokalizujú v medulárnych obličkových tubuloch (čierna šípka) v obličkách P7 WT (G), ale aktívna proliferácia sa stále deteguje v kortikálnych diferenciačných nefrónových štruktúrach (červené šípky) Gdnfhyper/hyper obličiek (H). Pre každé postnatálne štádium n=3 obličiek/genotyp. Mierka: 1 mm.

P7 len v Gdnfhyper/hyper obličkách. (A,B) Marker prekurzora nefrónu LEF1 (červený) v obličkách WT (A) a Gdnfhyper/hyper (B) na P4 demonštruje prebiehajúcu nefrogenézu v oboch genotypoch (šípky) (n=2 obličiek/genotyp). (C,D) Obličky P5 WT (C) vykazujú veľmi málo LEF1-pozitívnych buniek v kôre, zatiaľ čo v Gdnfhyper/hyper obličkách sa deteguje rozsiahla nefrogenéza (D; šípky; n=4 obličky/genotyp) . (E,F) LEF1 už nie je prítomný v kôre obličiek WT na P6 (E), zatiaľ čo množstvo prekurzorov nefrónov sa stále deteguje v Gdnfhyper/hyper obličkách (F) (n=3 obličiek/genotyp). (G) Cyklín D1 (biely) a JAG1 (červený) sa lokalizujú do diferencovaných distálnych tubulov nefrónu (žltá šípka a hrot šípky) v obličke P7 WT (n=3 obličiek). (H) V P7 sa Gdnfhyper/hyper obličky cyklín D1 a JAG1 lokalizujú na telá prekurzorov nefrónov v tvare čiarky (šípka) a S (šípka) v kortikálnej diferenciačnej zóne, čo ukazuje trvalú nefrogenézu v tomto neskorom postnatálnom štádiu (n{ {19}} obličky). Mierka: 100 um.

Signalizácia SMAD1/5, čo viedlo k mierne väčším obličkám s väčším počtom nefrónov ako v obličkách ošetrených vehikulom (Brown et al., 2015). Znížená dávka Tsc1, kódujúca inhibítor mTOR, udržuje NP bunky ďalší deň bez hlásených účinkov na počet embryonálnych NP buniek (Volovelsky et al., 2018). Predĺžená nefrogenéza bola pozorovaná aj u myší s nadmernou expresiou Lin28, Lin28b alebo inaktivovaného Let-7 (Let-7a1; Let{11}}d; Let{12}}f1) (Urbach et al ., 2014; Yermalovich a kol., 2019), ktoré tiež vykazujú priamu tumorigenézu alebo aktiváciu lokusov Igf2 alebo H19h spojených s Wilmsovým nádorom pediatrickej rakoviny obličiek (Chen a kol., 2018; Ogawa a kol., 1993). Všimnite si, že v Gdnfhyper/hyper obličkách, ktoré sú hypodysplastické a kompatibilné so životom počas troch týždňov, sa nezistili žiadne zmeny v lokalizácii alebo hladinách pSMAD1/5.

Táto štúdia sa zameriava na charakterizáciu funkcie GDNF pri nefrogenéze, ktorá bola predtým skúmaná znížením dávky endogénneho Gdnf a výsledkom je znížená zásoba nefrónov (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). Kanonický receptorový komplex pre GDNF je tvorený RET tyrozínkinázou a jej koreceptorom GFRa1, ktoré sú výlučne koexprimované iba v UB epiteli (Costantini, 2012; Golden a kol., 1999; Pachnis a kol., 1993) . GDNF je kľúčovým faktorom pre UB tip bunky (Chi a kol., 2009; Riccio a kol., 2016; Shakya a kol., 2005). Už sme predtým ukázali, že nadbytok GDNF rozširuje zberný kanál progenitorov na úkor predĺženia ureterického kmeňa, čo vedie k rozšírenému fenotypu hrotu a krátkeho kmeňa v dôsledku defektov v motilite progenitorov a skrátenej dĺžke bunkového cyklu (Li et al., 2019). Počas embryonálnych štádií kombinovaný účinok abnormálne

Obr. 7. Analýza expresie kľúčových regulátorov vývoja obličiek. (A) In situ hybridizačný test Gdnf na P4 nie je schopný detegovať žiadne transkripty v obličkách WT (n=3 obličiek). (B) Expresia Gdnf sa udržiava v P4 Gdnfhyper/hyper oblička a lokalizuje sa do kortikálnej diferenciačnej zóny, v ktorej sú udržiavané progenitory nefrónov (červené šípky) v dôsledku prebytku GDNF (n=3 obličiek). (C) qRT-PCR analýza Gdnf transkriptov v Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper a Gdnfhyper/hyper obličkách v P7 (n=3 obličiek/genotyp). Expresia Gdnf v Gdnfhyper/hyper obličkách je výrazne vyššia ako vo WT (P=0.036) a Gdnfwt/ko (P=0.038) (priemer ± sem, obojstranný t-test v SPSS ). (D) ELISA analýza hladín GDNF proteínu v obličkách P7 (n=5 obličky/genotyp) (priemer ± sem). (E,F) kvantifikácia na základe qRT-PCR relatívnych hladín expresie vybraných génov v E14 (E) a v P5 (F) (n=3 obličiek/genotyp v danom štádiu). Sekretované ciele GDNF odvodené od UB sú uvedené nad prerušovanou čiarou, zatiaľ čo iné známe regulátory nefrogenézy sú uvedené pod čiarou. Gdnfhyper/hyper obličky vykazujú významnú upreguláciu Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) a Wnt9b ( **P=0.01) na E14, zatiaľ čo na P5 významne zvýšené génové expresie zahŕňajú Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0.{{{101} 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) a Wnt4 (*P=0.026). Naproti tomu transkripcia Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) a Fgf20 (**P=0.001 ) je významne znížená v Gdnfhyper/hyper obličkách na P5. Mierka: 100 um.

Zdá sa, že vysoký GDNF, biofyzikálne zmeny vyvolané anomálnou morfológiou hrotu UB a súvisiace molekulárne zmeny v cieľoch GDNF a dráhe WNT spoločne posúvajú NP bunky smerom k zníženej proliferácii. Ukazujeme, že rozšírená morfológia hrotu UB sa časom zlepšuje, ale pretrváva pri miernych formách až do P4 v postnatálnych Gdnfhyper/hyper obličkách (obr. 5). UB tipové bunky sú molekulárne stále prítomné v P5 Gdnfhyper/hyper obličkách, ktoré exprimujú vysoké hladiny GDNF-regulovaných tipových markerov Crlf1, Etv4, Etv5 a Lama1, NPC-exprimované kanonické WNT ciele Cited1 a Uncx4.1, ako aj WNT agonistu R -spondin1 (obr. 7E, F; obr. S7A, B) (Karner a kol., 2011; Lu a kol., 2009; Vidal a kol., 2020). Takéto molekulárne zmeny v postnatálnej UB tak pravdepodobne poskytujú priaznivé prostredie pre trvalú samoobnovu NP po P2 / P3. Identifikovali sme secernované CRLF1 a WNT11 odvodené od UB ako ciele GDNF, ktoré spolu s rozšíreným kanonickým WNT

signalizácia, navyše posilnená zvýšenou expresiou Wnt9b, sprostredkúva jej účinky na reguláciu NP. Naše údaje tiež naznačujú, že funkcia CRLF1 je nadbytočná s inými cytokínmi, pretože jeho inaktivácia neovplyvňuje renálnu diferenciáciu. WNT9b aj WNT11 regulujú mnohé aspekty NPC a nefrogenézu (Carroll a kol., 2005; Karner a kol., 2011; Majumdar a kol., 2003; Nagy a kol., 2016; O'Brien a kol., 2018). Upregulácia UB-exprimovaného Wnt9b, o ktorom je známe, že reguluje mnohé aspekty nefrogenézy, v Gdnfhyper/hyper obličkách môže napodobňovať jeho nútenú expresiu v NP, čo narúša ich udržiavanie oproti diferenciačnej rovnováhe (Kiefer et al., 2012), a tak mechanicky prispieva k nevyváženej samoobnove NP pri Gdnfhyper/hyper nefrogenéze. Toto je podporované zlepšenou morfológiou hrotu po kanonickej inhibícii WNT pomocou IWR1 v celých obličkách čeliacich prebytku GDNF.

Tabuľka 2. Secernované cieľové gény GDNF s potenciálom ovplyvniť nefrogénny program

Naše výsledky ukazujú, že samotná inhibícia IWR1 má hlavný vplyv na NPC, ktoré sú rozptýlené a voľne priľnuté k hrotom UB. Kanonická inhibícia WNT v samotných NPC pravdepodobne prispieva k zlyhaniu rozšírenia ich fenotypu v prítomnosti nadbytku GDNF. Podporujú to naše genetické experimenty, v ktorých zníženie expresie Wnt11 exprimovaného UB v pozadí Gdnfhyper/hyper zlepšilo udržiavanie a diferenciáciu NP, ale nedokázalo úplne zachrániť renálnu hypopláziu spôsobenú nadbytkom GDNF. Môže to byť aspoň čiastočne z dôvodu zlyhania inaktivácie oboch alel Wnt11 na pozadí Gdnfhyper/hyper v dôsledku embryonálnej letality Wnt11−/− (Nagy et al., 2016). Jedna zostávajúca alela Wnt11 môže dokonca rozšíriť kaskádu GDNF, ako bolo navrhnuté skôr (Majumdar et al., 2003), a tak čiastočne zakázať úplnú záchranu nefrogenézy. Naša súčasná štúdia nemôže vylúčiť možnosť, že niektoré účinky GDNF na NP sú spôsobené nekanonickou signalizáciou GDNF, keďže jeho potenciálne alternatívne signálne receptory sú exprimované NP (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis a kol., 2013; Paratcha a kol., 2003). Avšak delécia NCAM alebo expresia Gfra1 len v UB (umiestnením pod kontrolu promótora Ret) udržujú normálny renálny fenotyp (Cremer a kol., 1994; Heuckeroth a kol., 1999; Keefe Davis a kol., 2013; Rossi a kol., 1999; Sariola a Saarma, 2003). To naznačuje, že prinajmenšom samy osebe nie sú NCAM ani GFRa1 nevyhnutné pre nefrogénny program. Stručne povedané, naše experimenty naznačujú, že GDNF, ktorý bol a v súčasnosti je v klinických skúškach na Parkinsonovu chorobu (Kirkeby a Barker, 2019), môže mať potenciál slúžiť ako perspektívny prostriedok na zlepšenie vybavenosti nefrónov v budúcnosti. Na identifikáciu možných prostriedkov na nadmernú aktiváciu signalizácie GDNF bez škodlivých účinkov na rast obličiek sú potrebné ďalšie experimenty

MATERIÁLY A METÓDY

Zvieratá

Protokoly starostlivosti o zvieratá a výskumu boli vykonané v súlade s Kódexom etického správania pri pokusoch na zvieratách, ako aj so smernicami Európskej únie (smernica 2010/EU/63) a boli schválené Fínskym Národným výborom pre pokusy na zvieratách. Myši boli umiestnené v individuálne vetraných klietkach s potravou a vodou ad libitum. Optimálne zvlhčovanie a vykurovanie boli neustále poskytované v certifikovanom Laboratórnom zvieracom centre Helsinskej univerzity. Generovanie a genotypovanie myších modelov Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) a Fgf9;20 (Barak et al., 2012) už bolo opísané skôr. Mláďatá Gdnfhyper;Wnt11− pochádzajú z kríženia C57BL6 Wnt11−

Tabuľka 3. Súhrn genotypov potomkov z krížení Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /−

(Nagy et al., 20}16) a línie Gdnfhyper a boli genotypované, ako už bolo opísané (Kumar et al., 20}15; Nagy et al., 2016 ). Všetky myšacie línie použité v štúdiách sa udržiavali na trojitom zmiešanom pozadí 129Ola/ICR/C57bl6. Generovanie Crlf knockout myší bolo opísané skôr (Alexander et al., 1999). Genotypizácia PCR sa uskutočnila s použitím sady neošpecifických primérov (5′-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′ a 5′-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) spolu so súbormi génovo špecifických primérov pre Crlf1 (5′-GCCTAGTGATAGGTG{10}}′ 18}}′ a 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Odber tkaniva Embryá boli usporiadané podľa kritérií Theilera (1989), ako už bolo opísané (Kuure et al., 2005) a odoberané po cervikálnej dislokácii gravidných samíc v hlbokej anestézii CO2. Neskoré embryonálne a postnatálne mláďatá boli usmrtené dekapitáciou. Tkanivo bolo vypreparované v Dulbeccovom médiu doplnenom 0,2 percentami hovädzieho sérového albumínu (BSA), po čom nasledovala fixácia 4 percentami paraformaldehydu (PFA) alebo orgánová kultúra. Orgánová kultúra Obličky izolované z myších embryí E11.5 a E12.5 sa umiestnili na rozhranie vzduch-kvapalina podporované systémom polyesterovej membrány Transwell® (Costar) a kultivovali sa pri 37 stupňoch vo zvlhčenej atmosfére 5 percent CO2 s kultivačným médiom obličiek [F12 :DMEM (1:1) plus Glutamax (Gibco)] doplnený o 10 percent fetálneho hovädzieho séra a penicilín-streptomycín (Ihermann-Hella a Kuure, 2019). Pre in vitro kultúru so 100 ng/ml exogénneho GDNF (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997) zameranú na kvantifikáciu NPC, bol každý urogenitálny blok obsahujúci metanefros, definitívny rudiment obličiek, rozdelený na polovicu pozdĺž linea mediana ventralis. Jedna polovica každej vzorky bola kultivovaná s exogénnym GDNF, zatiaľ čo druhá polovica slúžila ako kontrola. Experimenty s inhibíciou WNT boli najskôr testované s 50-100 ng/ml GDNF a 50-100 uM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). Na základe týchto experimentov závislosti od dávky boli optimálne koncentrácie 50 ng/ml GDNF a 75 uM IWR1. Histológia a imunofarbenie Pre štúdie skúmajúce sledovaný marker na parafínových rezoch boli obličky vyrezané z embryí alebo mláďat v uvedených štádiách, po čom nasledovalo spracovanie tkaniva a rezy, ako už bolo opísané (Li et al., 2019). V každej analýze sa použilo minimálne päť rezov z každej obličky a tri až päť rôznych obličiek na genotyp. Presné čísla vzoriek sú uvedené v legendách obrázkov. Hematoxylín a eozín (H&E) a imunohistochémia vykonané na parafínových rezoch boli dokončené, ako už bolo opísané (Li et al., 2019). Stručne povedané, vypreparované tkanivo bolo cez noc fixované 4 percentami PFA (pH 7,4), po čom nasledovala dehydratácia a parafinizácia pomocou automatického tkanivového procesora (Leica ASP 200). Rezy s hrúbkou 5 um boli pripravené a zbavené vosku v xyléne, po čom nasledovala rehydratácia predtým, ako boli zafarbené Harris H&E alebo podrobené teplom indukovanému získaniu antigénu v tlmivom roztoku na získanie antigénu (10 mM citrát; pH 6,0). Na imunofarbenie sa na blokovanie použilo 3 percentá BSA (1 h pri teplote miestnosti), po čom nasledovalo 30 minútové ošetrenie 0,5 percentným peroxidom vodíka na chromogénne farbenie. Rezy sa potom inkubovali s primárnymi protilátkami cez noc pri plus 4 stupňoch, po čom nasledovala druhovo špecifická sekundárna protilátka inkubovaná počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Chromogénna detekcia bola implementovaná pomocou súpravy EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

Obr. 8. Genetický pokles hladiny Wnt11 čiastočne zachraňuje stratu progenitorov nefrónu v Gdnfhyper/hyper obličkách. (A) ŠESŤ2-pozitívnych progenitorov nefrónu (NP, červená) je zriedkavé v E14.5 Gdnfhyper/hyper obličkách (v priemere 29,8 NP/tip v 552 tipoch analyzovaných v deviatich obličkách). (B) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /- obličky vykazujú zvýšenie všeobecného množstva NP na výklenok v neprítomnosti jednej alely Wnt11 (v priemere 40,7 NP/tip v 107 tipoch analyzovaných v štyroch obličkách ). (C,D) PAX2-pozitívne bunky v obličkách Gdnfhyper/hyper (C) a Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /- (D) vykazujú podobné vzorce a množstvo pri E14.5. (EH) Pri P0 farbenie SIX2 demonštruje zlepšenie počtu NP odstránením jednej alely Wnt11 (v priemere 20,3 NP/tip v 610 Gdnfhyper/hyper tipoch oproti priemeru 30,9 NP/tip v Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /- hroty analyzované v šiestich obličkách/genotyp), čo je podporované farbením PAX2. Distribúcia SIX2-pozitívnych NP (A′,B′,E′,F′) a PAX2- pozitívnych buniek (C′,D′,G′,H′) je znázornená bez kalbindínu ( zelený) signál, ktorý zobrazuje UB epitel vo všetkých obličkách. Mierka: 200 um.

Obličky E11.5 a E12.5 podrobené celoplošnému imunofluorescenčnému farbeniu boli fixované a permeabilizované 100 percent ľadovo studeným metanolom počas 10 minút pred inkubáciou cez noc s primárnymi protilátkami. Inkubácia so zodpovedajúcimi druhovo špecifickými sekundárnymi protilátkami sa uskutočnila na druhý deň po intenzívnom premytí s PBST (0,1 percenta Tween 20 v PBS). Podrobnosti o primárnych a sekundárnych protilátkach použitých v tejto štúdii sú uvedené v tabuľke S1. In situ hybridizácia In situ hybridizácia sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie (Ihermann Hella et al., 2014). Stručne povedané, antisense RNA sonda proti Gdnf exónom bola transkribovaná a hybridizovaná na hrubých rezoch odvodených z obličiek P4 (10-15 sekcií/oblička, n=3 obličiek/genotyp) vložených do 4 percent agarózy s nízkou teplotou topenia (NuSieve GTG, Lonza). Na kolorimetrickú reakciu sa použil BM Purple

ELISA Hladiny proteínu GDNF v obličkách P7.5 sa merali pomocou ELISA, ako už bolo uvedené (Kumar et al., 2015). GDNF Emax® Immunoassay (Promega) sa použil s pôsobením kyseliny pri uskutočňovaní ELISA. Podrobne, pre každý genotyp boli lyzované tri obličky ihneď po ich vypreparovaní. Po zmeraní koncentrácie proteínu pomocou DC proteínového testu (Bio-Rad) sa 25 ug celkového proteínu nanieslo do jamky na doštičke ELISA. Každá vzorka sa analyzovala dvojmo.

Zobrazovanie Imunofarbenie a hybridizácia in situ na rezoch boli zobrazené pomocou zariadenia Zeiss AxioImager vybaveného fluorescenčným svetelným zdrojom HXP 12{2}V, fotoaparátu Hamamatsu Orca Flash 4.{8}} LT B&W a farebnej kamery Zeiss AxioCam 105 , alebo s Leica DM5000B vybaveným kovovým halogenidovým svetelným zdrojom Leica EL 6000 a kamerou Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS. Imunofluorescenčné farbenie celej montáže bolo zobrazené pomocou Zeiss AxioImager s aplikáciou Zeiss ApoTome. Zobrazovanie celej montáže na meranie veľkosti intaktnej obličky sa uskutočnilo pomocou Leica MZFLIII vybavenej kamerou Leica DFC7000T. Kvantitatívne analýzy založené na imunofarbení a zobrazovaní Kvantifikácia glomerulárnej hustoty sa vypočítala zo sekvenčných rezov obličiek E18.5 a P7. Obličky boli narezané a rezy na glomerulárnu kvantifikáciu boli odoberané každých 125 um, aby sa predišlo iteračnému počtu glomerulov. Počet glomerulov v každej sekcii sa spočítal manuálne a plocha každej obličky sa merala pomocou softvéru Fiji ImageJ (V1.51) pomocou manuálneho obrysu obrysu. Na výpočet glomerulárnych hustôt, celkového počtu glomerulov

Obr. 9. Schéma účinkov nadbytku GDNF na vyvíjajúce sa obličky myší. (A) V embryonálnych obličkách, ktoré prechádzajú aktívnym rastom, progenitorové bunky nefrónu (NPC, červená) dostávajú sekretované vodiace signály (napr. Wnt11 a Wnt9b) z ureterických pupenových špičiek (UBT, tmavomodrá), aby kontrolovali rovnováhu proliferácie NP a sebaobnovy a ich diferenciácia na peritubulárne agregáty (PA, pink cell cluster). (B) V postnatálnych obličkách sa identita hrotu UB (UB, svetlomodrá) stratila, čo molekulárne dokazuje pokles expresie napr. Wnt9b, Wnt11, Crlf1 a Etv4/5, označený tenkými červenými písmenami. Postupná strata sekretovaných faktorov odvodených od UB (Wnt9b, Wnt11 a Crlf1) prispieva k poklesu proliferácie NP a samoobnovy. Súčasne sa znižujú hladiny GDNF a FGF, čo sa zhoduje so zrýchlenou diferenciáciou NP. Tieto spoločne rýchlo vyčerpávajú zásobu NP, čo vedie k zastaveniu nefrogenézy. (C) Nadbytok GDNF v embryonálnych obličkách indukuje abnormálnu morfológiu UBT a zvyšuje expresiu sekretovaných regulačných molekúl odvodených od pupencov (Crlf1, Sign, Wnt11 a Wnt9b). Nadmerná expresia secernovaných molekúl odvodených z púčikov má inhibičný účinok na NP bunkový cyklus, čo vedie k zníženej proliferácii a samoobnoveniu. Pokles celkového počtu NP spomaľuje diferenciáciu PA, čo sa deteguje zníženou expresiou Wnt4. (D) V postnatálnych obličkách sa morfológia UBT, a teda výklenok, ktorý poskytuje pre NPS, normalizuje napriek vyššej expresii sekretovaných cieľov než WT (Crlf1, Etv4/5 a Lama1). Spolu s normalizovanými Wnt9b a Wnt11 (nezobrazené) tieto molekulárne zmeny dotujú normálnu proliferáciu, samoobnovu a diferenciáciu NP, o čom svedčí udržiavanie veľkej populácie NP, vyššia expresia Wnt4 a podobné množstvo prekurzorov nefrónov (ružové zhluky buniek) ako v WT embryonálnych obličkách. Prostredníctvom takýchto mechanizmov umožňuje konštitutívny nadbytok GDNF pod vlastným promótorom pokračovať v nefrogénnom programe až do P7. Tmavosivý text, nezmenený výraz; červený text, znížený výraz; zelený text, zvýšený výraz.

a počet glomerulov v kortexe sa počítali oddelene. Pre každú vzorku sa potom vypočítala priemerná celková plocha obličiek a celkový počet a počet kortikálnych glomerulov. Priemerná glomerulárna hustota sa vypočítala vydelením priemerného počtu glomerulov priemernou meranou plochou. Priemer kortikálnych glomerulov v rámci celej priemernej plochy sa vypočítal vydelením priemerného počtu kortikálnych glomerulov priemernou nameranou celkovou plochou. Boli zaznamenané iba glomeruly s intaktnými tvarmi. Kvantifikácia celkových SIX2-pozitívnych NPS pri E11,5 (n=4 pre WT, n=5 pre Gdnfhyper/hyper) a E12,5 (n=10 obličiek/ tri nezávislé experimenty) boli založené na celoplošnom imunofluorescenčnom farbení. Snímky boli zachytené pomocou aplikácie Zeiss ApoTome a následne spracované softvérom Imaris (Bitplane) pomocou sledovania škvŕn. Všetky obrázky boli spracované identickými analytickými protokolmi. Aby sa znormalizovali variácie medzi vrhmi, priemerné množstvo 62-pozitívnych NP v obličkách WT v každom vrhu sa nastavilo na 100 percent a množstvo ŠESTI{11}} pozitívnych NP v Gdnfhyper /hyper obličky sa porovnalo s priemerným množstvom v obličkách WT vo vrhu. Mitotický index SIX2-pozitívnych NPS v obličkách E12.5 (n=10 obličiek/liečba, tri nezávislé experimenty) kultivovaných s exogénnym GDNF sa vypočítal podobným spôsobom, aby sa normalizovali variácie medzi vrhmi.

Priemerný podiel proliferujúcich SIX{0}}pozitívnych NP v obličkách WT a obličkách kultivovaných bez exogénneho GNDF v každom vrhu bol nastavený na 100 percent a podiel proliferujúcich SIX{{2 }} pozitívne NP v prítomnosti nadbytku GDNF (Gdnfhyper/hyper obličky a exogénna aplikácia) z rovnakého vrhu boli vynesené na obrázku po porovnaní s WT súrodencami. Mitotický index SIX2-pozitívnych NPS v obličkách E11.5 kultivovaných s exogénnym GDNF bol vynesený do grafu ako pôvodné údaje/hodnota. Výpočet priemerných SIX2-pozitívnych NPS na nefrogénnu niku (E14.5 a P0) a nefrogénne niky s progenitormi (P3-P6) sa uskutočnil imunofluorescenčným farbením v parafínových rezoch. Počet SIX2-pozitívnych NPS sa spočítal pomocou softvéru Fiji ImageJ (V1.51) na každej sekcii vybranej na analýzu pomocou analýzy častíc a počet hrotov sa spočítal manuálne na zodpovedajúcich sekciách. Počet analyzovaných vzoriek v E14.5 bol tri obličky pre WT a Gdnfhyper/hyper obličky a dve obličky pre Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /-. Počet hrotov analyzovaných pri E14.5 bol 207 vo WT, 431 v Gdnfhyper/hyper a 107 pre Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /− obličky. Počet analyzovaných vzoriek v P0 bol tri obličky na genotyp a počet analyzovaných špičiek, ktorý je uvedený na zodpovedajúcich obrázkoch, sa pohybuje od 10 do 315, pričom najnižší je v obličkách WT P6, v ktorých sú špičky zriedkavo prítomné. Merania hrotov UB sa uskutočňovali pomocou programu LAS X operačného systému mikroskopu Leica po 48 hodinách kultivácie v prítomnosti špecifikovaných chemikálií a vizualizácii hrotov protilátkou E-kadherín (tabuľka S1). Špičky boli merané zo šiestich obličiek v každom stave dvoch nezávislých sád experimentov, v ktorých bol počet meraných špičiek: 101 pre GDNF, 131 pre IWR1 a 115 pre 75 uM IWR1 plus 50 ng/ml GDNF. Merania veľkosti obličiek v experimentoch hodnotiacich účinok delécie Wnt11 v pozadí Gdnfhyper/hyper sa uskutočňovali pomocou softvéru Fiji ImageJ (V1.51) na celoplošných snímkach pomocou manuálneho sledovania obrysu obličky. Štatistická analýza Všetky hodnoty sú prezentované ako priemer ± sem s výnimkou analýzy hlavných účinkov Gdnf a Wnt11 na veľkosť obličiek, ktorá je znázornená ako priemer ± sd Štatistická významnosť bola nastavená na P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Poďakovanie Ďakujeme personálu Biomedicum Imaging and Light Microscopy Units Helsinského inštitútu biologických vied (HiLIFE) za cennú pomoc pri analýze obrazu a technikách súvisiacich s kvantifikáciou. Myši Wnt11 láskavo poskytol profesor Seppo Vainio (Univerzita v Oulu, Fínsko) a poslal ich do Centra laboratórnych zvierat HiLIFE na Helsinskej univerzite.