Antioxidačný účinok komplexného pôsobenia vitamínu E a etyltiosulfanylátu v pečeni a obličkách potkanov v podmienkach oxidačného stresu vyvolaného chrómom (VI)
Mar 25, 2022
Bohdan Kotyk1,*, Ruslana Iskra1, Vira Lubunets2
Abstrakt:Cieľom našej štúdie bolo preskúmať účinnosť a prínosy komplexného účinku vitamínu E a etyltiosulfanylátu (ETS) na stav pro/antioxidačného systému v pečeni aobličkypotkanov v stave oxidačného stresu vyvolaného Cr(VI). Potkany boli rozdelené do 8 skupín.
Skupiny dostali: I (kontrola) - fyziologický roztok (150 ul) počas 7 dní; II – olejový roztok (1 ml) počas 14 dní; III, IV, VII, VIII - K2Cr207 (2,5 mg Cr(VI)/kg telesnej hmotnosti (bw)) pre 7 (III, IV) a pre 14 (VII, VIII); V - vitamín E (20 mg/kg telesnej hmotnosti) počas 14 dní; VI, VII, VIII - vitamín E v komplexe s ETS (100 mg/kg ž.hm.) počas 14 dní. Výsledky uvádzajú, že K2Cr2O7 spôsobil oxidačný stres vyvolaný Cr(VI) v dôsledku aktivácie procesov peroxidácie lipidov (LP). Pôsobenie Cr(VI) počas 7 dní spôsobilo kompenzačnú aktiváciu antioxidačného obranného systému (AOS) v oboch tkanivách. Dlhšie pôsobenie Cr(VI) však bolo sprevádzané depléciou aktivity enzýmu AOS a obsahu GSH. Komplexný účinok vitamínu E a ETS znížil intenzitu oxidačného stresu vyvolaného Cr(VI) v oboch tkanivách potkanov. Naše výsledky poukazujú na pozitívne antioxidačné vlastnosti vitamínu E a ETS v podmienkach Cr(VI) toxicity.
Kľúčové slová:potkany; antioxidačný systém; oxidačný stres; vitamín E; etyltiosulfanylát; dvojchróman draselný; peroxidácia.
Kontakt:{0}}
Kliknutím sa dostanete dovnútraurdčinapre obličky
1. Úvod
Aktívne používanie chrómu na priemyselné a poľnohospodárske účely viedlo k významnej akumulácii zlúčenín obsahujúcich Cr v životnom prostredí [1-3]. Zlúčeniny chrómu sú jednou z najbežnejších znečisťujúcich látok vo vodných a suchozemských ekosystémoch [4-6]. Hlavnými priemyselnými odvetviami, ktoré vyžadujú aktívne používanie zlúčenín obsahujúcich Cr, sú činenie kože, prostriedky na ochranu dreva, priemyselné zváranie kovov, chrómovanie, chrómovanie a výroba ferrochromátu [1]. Chróm je prírodný kov, ktorý sa vyskytuje väčšinou v dvoch rôznych formách: trojmocný chróm (Cr(III)) a šesťmocný chróm (Cr(VI)). Cr(III) je posledným stupňom oxidácie chrómu. Trojmocná forma chrómu je bežná vo všetkých biologických systémoch, je termodynamicky stabilná a vykazuje silné vlastnosti na tvorbu koordinačných zlúčenín. Šesťmocná forma (Cr(VI)) vykazuje silné toxické a karcinogénne vlastnosti a zvyčajne sa prezentuje ako zlúčeniny chrómanov (CrO42-) a dichrómanov (Cr2O72-) s obsahom kyslíka [1,7]. Vysoká toxicita zlúčenín Cr(VI) je spojená so schopnosťou ľahko sa absorbovať a rýchlo transportovať do buniek cez sulfátové kanály [8,9]. Potom sa Cr(VI) po preniknutí do bunky v niekoľkých stupňoch redukuje na Cr(III). Počas procesu redukcie Cr(VI) vzniká veľké množstvo reaktívnych foriem kyslíka (ROS) [10,11]. Aktivácia tvorby ROS vedie následne k rozvoju oxidačného stresu a poškodeniu tkaniva. Procesy redukcie Cr(VI) sú tiež sprevádzané cytotoxicitou, genotoxicitou, karcinogenitou a apoptózou prostredníctvom modulácie regulačného génu p53 [12- 15]. Systém AOS je hlavnou bariérou v boji proti oxidačnému stresu vyvolanému Cr(VI) [9]. Enzymatické a neenzymatické zložky systému AOS, ako sú flavoenzýmy závislé od GSH a NADPH, stimulujú a urýchľujú redukciu vysoko toxického Cr(VI) na oveľa menej toxický Cr(III). Enzýmy ako SOD, CAT, GP a neenzymatický tripeptid GSH zase neutralizujú mnohé ROS, ktoré vznikajú pri redukcii Cr(VI) [16,17]. Predĺžený oxidačný stres vyvolaný Cr(VI) však vedie k vyčerpaniu zdrojov systému AOS a vyvoláva poškodenie buniek, tkanív a oxidačných orgánov v dôsledku zvýšených prooxidačných procesov [9,18]. Zlúčeniny obsahujúce Cr(VI), ako je dvojchróman draselný (K2Cr2O7) v dávke 8 mg/kg telesnej hmotnosti spôsobuje u potkanov akútnu hepatotoxicitu v dôsledku zvyšujúcich sa nekrotických a zápalových procesov a vyčerpania systémových zdrojov AOS v pečeňovom tkanive zvierat [19 ]. Jednorazová subkutánna injekcia K2Cr2O7 v dávke 10 mg/kg má tiež za následok oxidačný stres indukovaný Cr(VI) a poškodenie pečeňového tkaniva potkana, po ktorom nasledujú degeneratívne zmeny v histoarchitektúre a dilatácia pečeňových sínusoidov. Podobná dávka Cr(VI) spôsobuje degeneratívne zmeny v tubulárnych epiteliálnych bunkách, cystickú dilatáciu tubulov, upchatie ciev, hyalínové odliatky a dilatáciu Bowmanovho priestoru vobličkypotkanov [14]. Hepato- a nefrotoxicita spôsobená K2Cr2O7 je sprevádzaná akútnym oxidačným stresom vyvolaným Cr(VI). Toxicita vyvolaná Cr(VI) stimuluje najmä tvorbu ROS, hyperaktiváciu procesov peroxidácie, inhibíciu aktivity antioxidačných enzýmov, zníženie bunkového GSH, ako aj depléciu neproteínových sulfhydrylových skupín a akumuláciu Cr(VI). pečeň aobličkypotkanov a myší [14,20,21]. Predpokladá sa, že udržanie antioxidačného stavu je dôležitým faktorom na zníženie a prevenciu negatívnych účinkov oxidačného stresu vyvolaného Cr(VI) [14,22,23]. Neutralizácia Cr(VI) sa uskutočňuje enzymatickou redukciou na Cr(V) a následnou transformáciou na soli obsahujúce Cr za účasti GR a NADPH. Neenzymatické antioxidanty ako vitamín E, kyselina askorbová, N-acetylcysteín, cesnakový prášok a GSH majú schopnosť znižovať oxidačné poškodenie spôsobené K2Cr2O7 [24,25]. Vitamín E je považovaný za najúčinnejší neenzymatický antioxidant rozpustný v tukoch, ktorý chráni bunkovú membránu pred radikálmi vyvolanou peroxidáciou, stimuluje aktiváciu antioxidačných enzýmov a znižuje intenzitu oxidačného stresu spôsobeného toxicitou vyvolanou ťažkými kovmi. Pôsobenie vitamínu E v dávke 100 a 125 mg/kg telesnej hmotnosti počas 2 a 6 týždňov znižuje hladinu peroxidačných procesov vyvolaných K2Cr2O7- a obnovuje obsah GSH a aktivitu SOD v pečeni aobličkypotkanov [14,19,22]. Vitamín E v dávke 125 mg/kg telesnej hmotnosti tiež vykazuje antioxidačné a protizápalové vlastnosti a znižuje intenzitu Cr(VI)-indukovanej toxicity v pečeni aobličkypotkanov [22].
Etyltiosulfanylát patrí do triedy tiosulfonátových zlúčenín. Tiosulfonáty sú syntetické analógy prírodných biologicky aktívnych organosírových zlúčenín získaných z cesnaku, cibule, brokolice a karfiolu. Tiosulfonáty sú stabilnejšie ako ich prírodné analógy, vykazujú široké spektrum biologických vlastností a vyznačujú sa nízkou toxicitou. Mnoho výskumníkov v posledných rokoch študovalo protirakovinové, protizápalové, antifungálne, antimikrobiálne a imunomodulačné vlastnosti tiosulfonátov. Neexistujú však dostatočné štúdie o antioxidačných vlastnostiach tiosulfonátov. Je známe, že tiosulfonáty sú schopné modulovať transkripčné faktory, ktoré sa podieľajú na aktivácii génov systému AOS [26,27]. Antioxidačný účinok týchto zlúčenín sa prejavuje v schopnosti znižovať intenzitu deplécie GSH poolu a tvorby reaktívnych látok s kyselinou tiobarbiturovou (TBARS) v pečeni potkana v podmienkach oxidačného stresu [28]. O antioxidačných vlastnostiach tiosulfonátov pri toxickom pôsobení ťažkých kovov je známe len veľmi málo. Prírodné organické zlúčeniny síry však preukázali pozitívny antioxidačný účinok proti oxidačnému stresu vyvolanému Cr(VI) [23, 29-31]. Naše predchádzajúce štúdie tiež naznačujú, že etyltiosulfanylát vykazuje antioxidačné vlastnosti a čiastočne eliminuje negatívne účinky oxidačného stresu vyvolaného K2Cr2O7- v tkanive pečene potkanov [32].
Preto, vzhľadom na pozitívne antioxidačné vlastnosti vitamínu E, ako aj tiosulfonátov a ich prírodných analógov, sa naša štúdia zamerala na skúmanie účinnosti a výhod komplexného účinku vitamínu E a etyltiosulfanylátu na stav pro/antioxidačného systému v pečeni. aobličkypotkanov v stave oxidačného stresu vyvolaného Cr(VI).
2. Materiály a metódy
Časť «Materiály a metódy» bola pripravená analogicky s našou predchádzajúcou publikáciou [32].
2.1. Experimentálny dizajn.
V našej práci sme použili 40 samcov potkanov Wistar s hmotnosťou 130- 140g. Vytvorili sme 8 skupín zvierat (5 potkanov na skupinu): 1 kontrolnú skupinu a 7 experimentálnych skupín. Všetky potkany boli umiestnené v štandardných podmienkach a dostávali štandardné krmivo a pitnú vodu ad libitum.
Intaktné kontrolné potkany v skupine I dostali jednu intraperitoneálnu injekciu fyziologického roztoku (150 ul) raz denne počas 7 dní. Zvieratám z experimentálnych skupín III a IV sa intraperitoneálne podával K2Cr207 rozpustený v 150 ul fyziologického roztoku (koncentrácia Cr(VI) 2,5 mg/kg telesnej hmotnosti) počas 7 a 14 dní, v danom poradí.
Skupina II.
Skupina V: dostávala denne intragastrickú injekciu olejového roztoku vitamínu E v dávke 20 mg/kg telesnej hmotnosti počas 14 dní a potom bezprostredne potom bol intraperitoneálne podávaný fyziologický roztok (150 ul) raz denne počas 7 dní.
Skupina VI: dostávali denne intragastrické injekcie komplexu olejového roztoku vitamínu E [20 mg/kg telesnej hmotnosti] a etyltiosulfanylátu (ETS) [100 mg/kg telesnej hmotnosti] počas 14 dní a potom bezprostredne po tom podávali denne intraperitoneálne 150 µl fyziologického roztoku počas 7 dní.
Skupina VII/Skupina VIII: dostávala intragastricky komplexný olejový roztok vitamínu E [20 mg/kg telesnej hmotnosti] a ETS [100 mg/kg telesnej hmotnosti] počas 14 dní a potom bezprostredne potom dostávala K2Cr2O7 intraperitoneálne denne v dávke 2,5 mg Cr(VI)/kg telesnej hmotnosti za deň počas 7 dní/14 dní.
Všetky manipulácie so zvieratami v našej práci boli v súlade s ustanoveniami Európskeho dohovoru o ochrane stavovcov používaných na experimentálne a iné vedecké účely (Štrasburg, 1986) a „Spoločnými etickými zásadami pre pokusy na zvieratách“ (Ukrajina, 2001). Povolenie na uskutočnenie výskumu bolo získané od Výboru pre bioetiku Ústavu biológie zvierat NAAS vo Ľvove (protokol č. 80).
Práca študovala účinky novosyntetizovanej zlúčeniny ETS (etyl 4- aminobenzéntiosulfonát) v komplexe s vitamínom E na telo potkana. ETS bol syntetizovaný na oddelení technológie biologicky aktívnych zlúčenín, farmácie a biotechnológie Národnej univerzity "Lviv Polytechnic" podľa protokolu podrobne opísaného v článku [33, 34].
Po dekapitácii zvierat, ku ktorej došlo v tiopentalovej anestézii,obličkyboli zozbierané. Všetky procedúry zapnutéobličkyboli vykonané pri 4 stupňoch. Výskumným materiálom boli obličkové homogenáty potkanov, ktoré boli pripravené na 0,05 M Tris-HCl tlmivom roztoku s pH 7,4 v pomere 1 g tkaniva a 9 ml tlmivého roztoku (1:9, hmotnosť/objem ) a potom centrifugovať 15 minút pri 1000 g. Po centrifugácii v získaných supernatantoch sa stanovil obsah GSH, hladina produktov peroxidácie a aktivita antioxidačných enzýmov.
2.1.1. Skupiny zvierat.
Skupiny zvierat sa porovnávali podľa nasledujúcej schémy (obrázok 1). Skupina I je neporušená kontrola vo vzťahu k experimentálnym skupinám III a IV, ktoré nedostali olejový roztok. Kontroly skupiny II vo vzťahu k experimentálnym skupinám V, VI, VII a VIII, ktoré dostali olejový roztok. Zaznamenali sme percentuálnu (percentuálnu) zmenu ukazovateľov pre III a IV experimentálne skupiny v porovnaní so skupinou I (intaktná kontrola). Zaznamenali sme tiež percentuálnu zmenu ukazovateľov pre experimentálne skupiny V, VI, VII a VIII v porovnaní so skupinou II (kontrola oleja). V záverečnej fáze sme analyzovali percentuálnu zmenu ukazovateľov III/IV experimentálnych skupín v porovnaní so skupinou I (intaktná kontrola) a porovnali sme ju s percentuálnou zmenou ukazovateľov VII/VIII experimentálnych skupín v porovnaní so skupinou II (olejová kontrola).
2.2. Spracovanie.
2.1.1. Koncentrácia LHP.
Meranie hladiny LHP (lipidových hydroperoxidov) sa uskutočňovalo v rozpore s metódami zrážania proteínov indukovanej kyselinou trichlóroctovou a etanolom indukovaného lipidu.
extrakcia [35]. Tiokyanát amónny interaguje s lipidovými etanolovými extraktmi a iniciuje farebnú reakciu. Záznam absorbancie farebného produktu sa uskutočnil spektrofotometricky (A 480 nm). Hladina LHP (SU/g tkaniva) bola vypočítaná ako rozdiel medzi kontrolnou a experimentálnou vzorkou.
2.2.2 Koncentrácia TBARS.
Hodnotenie koncentrácie TBARS (látky reaktívne s kyselinou tiobarbiturovou) je založené na princípe interakcie malondialdehydu a kyseliny tiobarbiturovej v podmienkach kyslosti a vysokej teploty [35]. Výsledkom interakcie malondialdehydu a kyseliny tiobarbiturovej je farebná reakcia. Zaznamenanie absorbancie farebného produktu sa uskutočnilo spektrofotometricky (A 535 nm a A 580 nm) a hladina TBARS sa vypočítala ako nmol MDA/g tkaniva.
2.2.3. Činnosť praktického lekára.
Meranie enzymatickej aktivity GP (glutatiónperoxidázy) sa uskutočňuje v prítomnosti GSH pred a po pridaní terciárneho butylhydroperoxidu [35]. Vyhodnocovanie
aktivita GP je založená na princípe rýchlosti oxidácie GSH. SH-skupiny molekuly GSH sa oxidujú v prítomnosti kyseliny 2-nitrobenzoovej. Dinitrofenylový anión vzniká v dôsledku oxidácie GSH. Záznam absorbancie farebného produktu sa uskutočnil spektrofotometricky (A 412 nm) a aktivita GP sa vypočítala v nmol GSH/min. × mg proteínu.
2.2.4. Činnosť GR.
Meranie enzymatickej aktivity GR (glutatiónreduktázy) sa uskutočnilo v prítomnosti oxidovaného glutatiónu a NADPH [35]. Hodnotenie aktivity GR je založené na princípe rýchlosti redukcie oxidovaného glutatiónu. Záznam absorbancie sa uskutočňoval spektrofotometricky (A 340 nm) počas 1 minúty pri 37 stupňoch. Znižovanie rýchlosti extinkcie je indikátorom intenzity reakcie. Aktivita GR bola vypočítaná v umol NADPH/min. × mg proteínu.
2.2.5. Koncentrácia GSH.
Hodnotenie hladiny GSH (redukovaný glutatión) je založené na princípe tvorby dinitrofenylového aniónu (farebného produktu) po naviazaní 2-kyseliny nitrobenzoovej na SH-skupinu molekuly GSH [36]. Hodnota koncentrácie GSH závisí od intenzity farebnej reakcie. Zaznamenanie absorbancie farebného produktu sa uskutočnilo spektrofotometricky (A 412 nm) a obsah GSH sa vypočítal ako mmol GSH/g tkaniva.
2.2.6. Činnosť SOD.
Meranie enzymatickej aktivity SOD (superoxiddismutázy) sa uskutočnilo v prítomnosti NADH a fenazínmetosulfátu [36]. Hodnotenie aktivity SOD je založené na princípe redukcie nitrotetrazoliovej modrej. Intenzita inhibície procesu redukcie nitrotetrazoliovej modrej indikuje intenzitu enzýmovej aktivity. Záznam absorbancie sa uskutočnil spektrofotometricky (A 540 nm) a aktivita SOD sa vypočítala v štandardných jednotkách na 1 mg proteínu.
2.2.7. Činnosť CAT.
Meranie enzymatickej aktivity CAT (katalázy) sa uskutočnilo v prítomnosti molybdénových solí, ktoré interagujú s peroxidom vodíka [36]. V dôsledku reakcie sa vytvoril farebný produkt. Zaznamenanie absorbancie farebného produktu sa uskutočnilo spektrofotometricky (A 410 nm) a aktivita CAT sa vypočítala v mmol/minútu x 1 mg proteínu.
2.2.8. Koncentrácia bielkovín.
Koncentrácia celkového proteínu v tkanivových homogenátoch bola meraná Lowryho metódou [37] s použitím súprav "Simko LTD" (Ukrajina, Ľvov). Meranie všetkých hodnôt absorbancie sa uskutočnilo na spektrofotometri "Unico" 1205 (USA).
2.3. Štatistická analýza.
Všetky experimentálne údaje boli štatisticky analyzované softvérom Microsoft Excel s použitím jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA) a Tukey-Kramerovho testu. Všetky experimentálne hodnoty boli vypočítané ako priemerné hodnoty (M) ± štandardná chyba (SEM) a boli považované za štatisticky významné pri P <>
3. Výsledky a diskusia
Časť «Výsledky a diskusie» bola pripravená analogicky s našou predchádzajúcou publikáciou [32].
3.1. Markery oxidačného stresu.
Zistili sme, že intraperitoneálne podávanie dvojchrómanu draselného počas 7 a 14 dní vedie k zvýšeniu obsahu markerov oxidačného stresu v tkanive pečene a obličiek samcov potkanov. Expozícia K2Cr2O7 v dávke 2,5 mg Cr(VI)/kg telesnej hmotnosti počas 7 (skupina III) a 14 dní (skupina IV) spôsobila výrazné zvýšenie obsahu TBARS v pečeni zvierat v porovnaní so skupinou I (kontrola) o 69 a 75 percent (tabuľka 1). Hladina TBARS bola tiež významne zvýšená v obličkovom tkanive potkanov III a IV experimentálnych skupín v porovnaní s kontrolou o 41 a 46 percent, v danom poradí. Podobná dávka Cr(VI) viedla k významnému zvýšeniu koncentrácie LHP v pečeni potkanov z III a IV experimentálnych skupín v porovnaní so skupinou I o 112 a 127 percent. Hladina LHP bola tiež významne zvýšená v tkanive obličiek potkana po 7 (skupina III) a 14 dňoch (skupina IV) pôsobenia Cr(VI) v porovnaní s kontrolnou skupinou o 39 a 56 percent.
Dôvodom zvýšenia intenzity procesu peroxidácie v pečeni a obličkách potkanov je Cr(VI)-indukovaná hyperaktivácia tvorby hydroxylových a superoxidových radikálov. Tvorba ROS indukovaná Cr(VI) spôsobuje poškodenie štruktúry lipidových zložiek bunkovej membrány a v dôsledku toho vyvoláva zvýšenie obsahu TBARS [19,20,38]. Medziprodukty redukcie Cr(VI) vstupujú do reakcií podobných Fentonovi, interagujú s peroxidom vodíka a iniciujú hydroxylové radikály [19]. Podľa literatúry Cr(VI) zvyšuje intenzitu tvorby superoxidových radikálov aktiváciou enzymatických komplexov NADPH-oxidázy [39] a xantín-xantínoxidázy [40].
Intragastrické podanie vitamínu E (skupina V) a vitamínu E v komplexe s ETS (skupina VI) počas 14 dní viedlo k významnému zníženiu obsahu TBARS v pečeni zvierat v porovnaní so skupinou II o 13 a 16 percent (tabuľka 1). Mierny pokles hladiny TBARS bol tiež zaznamenaný v obličkovom tkanive potkanov V a VI experimentálnej skupiny v porovnaní so skupinou II o 5 a 3 percentá. Obsah LHP bol významne znížený v experimentálnych skupinách V a VI v pečeni potkanov v porovnaní so skupinou II o 12 a 16 percent. Došlo tiež k významnému zníženiu hladiny LHP v tkanive obličiek potkanov podobných experimentálnych skupín v porovnaní so skupinou II o 10 a 8 percent.
Obsah TBARS v pečeni potkana zostal na úrovni ukazovateľov skupiny II po 14 dňoch komplexnej predliečby vitamínom E a ETS ďalším aktínom Cr(VI) počas 7 dní (skupina VII). Predchádzajúci komplexný vplyv vitamínu E a ETS ďalším pôsobením Cr(VI) počas 14 dní viedol k zvýšeniu hladiny TBARS v pečeňovom tkanive skupiny VIII v porovnaní so skupinou II o 23 percent. Avšak zvýšenie obsahu TBARS v pečeňovom tkanive zvierat skupiny VIII (23 percent) v porovnaní so skupinou II bolo o 52 percent nižšie ako percentuálne zvýšenie obsahu TBARS v pečeni potkanov skupiny IV (75 percent) v porovnaní so skupinou I .
Koncentrácia TBARS sa v tkanive obličiek potkana zvýšila po 14 dňoch komplexnej predliečby vitamínom E a ETS ďalším pôsobením Cr(VI) na 7 (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) v porovnaní so skupinou II o 21 resp. 31 percent, resp. Intenzita zvýšenia obsahu TBARS v obličkách potkanov skupiny VII (21 percent) a VIII (31 percent) v porovnaní so skupinou II však bola o 25 a 21 percent nižšia ako percento zvýšenia hladiny TBARS v obličkových homogenátoch skupín III (46 percent) a IV (52 percent) v porovnaní so skupinou I.
Komplexná predliečba vitamínom E a ETS ďalším aktínom Cr(VI) počas 7 dní (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) spôsobila zvýšenie obsahu LHP v pečeňovom tkanive potkanov v porovnaní so skupinou II o 17 a 52 percent , resp. Avšak zvýšenie hladiny LHP v pečeni potkanov skupín VII (17 percent) a VIII (52 percent) v porovnaní so skupinou II bolo o 97 a 75 percent nižšie ako percentuálne zvýšenie obsahu LHP v pečeňových homogenátoch skupín III (114 percent ) a IV (127 percent) v porovnaní s I. skupinou.
Koncentrácia LHP sa zvýšila v obličkách zvierat skupiny VII a VIII v porovnaní so skupinou II o 16 a 31 percent.
Avšak zvýšenie obsahu LHP v obličkách potkanov skupiny VII (16 percent) a VIII (31 percent) v porovnaní so skupinou II bolo o 23 a 25 percent nižšie ako percentuálne zvýšenie hladiny LHP v obličkovom tkanive skupiny III (39 percent ) a IV (56 percent) v porovnaní so skupinou I.
Literárne údaje uvádzajú, že vitamín E sa vyznačuje účinnými antioxidačnými vlastnosťami, inhibuje procesy peroxidácie lipidov a znižuje hladiny ROS in vitro a in vivo [22]. Perorálne podávanie vitamínu E zmierňuje hepatotoxicitu indukovanú Cr(VI) a znižuje obsah TBARS v pečeni potkanov [19]. Príčinou zníženia intenzity peroxidačných procesov v tkanive pečene potkana môže byť aj antioxidačná vlastnosť sulfátu inej skupiny, ktorá je štruktúrnou zložkou molekuly ETS [32,42,43]. Táto funkčná skupina má vlastnosti na zníženie obsahu LHP [41]. S-alkyltiosulfonáty, ktoré sú syntetickými štruktúrnymi analógmi ETS, inhibujú aktivitu xantín-xantínoxidázového systému a tvorbu ROS [27]. Vitamín E je dôležitou súčasťou cytoplazmy a bunkovej membrány. Antioxidačný účinok vitamínu E zabraňuje aktivácii reťazových reakcií autooxidácie lipidov v dôsledku neutralizácie peroxylových a alkoxidových radikálov. Peroxylové radikály tiež reagujú rýchlejšie s vitamínom E ako s lipidmi bunkovej membrány [14].
Toxický účinok Cr(VI) teda vedie k zvýšeniu obsahu TBARS a LHP v tkanive pečene a obličiek zvierat. Predchádzajúci vplyv vitamínu E s ETS však znižuje intenzitu peroxidačných procesov v pečeni a obličkách potkanov pri pôsobení oxidačného stresu vyvolaného Cr(VI).
3.2. Glutatiónový antioxidačný systém.
Došlo k zvýšeniu aktivity GP v pečeňovom tkanive potkanov pod pôsobením Cr(VI) počas 7 (skupina III) a 14 dní (skupina IV) v porovnaní so skupinou I o 55 a 15 percent (tabuľka 2).
Intraperitoneálne podávanie dvojchrómanu draselného počas 7 dní (skupina III) spôsobilo zvýšenie obsahu bunkového GSH v tkanive pečene potkana o 12 percent v porovnaní s kontrolou (skupina I). Hladina GSH sa nelíšila od kontrolných hodnôt v obličkách zvierat skupiny III (K2Cr2O7 14 dní). Avšak došlo k poklesu GSH poolu v pečeni a obličkách potkanov po 14 dňoch pôsobenia Cr(VI) (skupina IV) v porovnaní so skupinou I o 34 percent, respektíve o 36 percent. Na druhej strane vysoká citlivosť obličkového tkaniva na toxicitu vyvolanú Cr(VI) môže byť dôvodom inaktivácie GP v obličkách zvierat skupiny IV [1, 16].
Autori tiež naznačujú, že mechanizmus inaktivácie GP za podmienok toxicity Cr(VI) sa uskutočňuje pripojením Cr(VI) k aktívnemu miestu enzýmu a priamym vytesnením kofaktorov-kovov z aktívneho miesta [25].
Aktivita GR sa nezmenila v pečeni zvierat skupiny III v porovnaní s kontrolou. Ale 14 dní expozície Cr(VI) viedlo k zníženiu aktivity GR v pečeňovom tkanive potkanov o 17 percent v porovnaní so skupinou I. Inhibícia aktivity GR bola tiež pozorovaná v obličkovom tkanive zvierat po 7 (skupina III) a 14 (IV. skupina) dní injekcie K2Cr2O7 v porovnaní so skupinou I o 45 a 43 percent.
Predpokladáme, že Cr(VI)-indukovaný pokles obsahu GSH môže byť dôvodom supresie GR v oboch tkanivách potkanov [44-46]. Molekuly GSH zabezpečujú priamu neutralizáciu voľných radikálov, zohrávajú kľúčovú úlohu v mechanizmoch antioxidačnej ochrany buniek [47] a podieľajú sa na procesoch redukcie Cr(VI) [19]. Preto pokles obsahu GSH v pečeni potkanov postihnutých Cr(VI) môže byť dôsledkom intenzívneho používania molekúl GSH v procesoch neutralizácie ROS a voľných radikálov v podmienkach oxidačného stresu vyvolaného K2Cr2O7-.
Literárne údaje tiež opisujú priamy mechanizmus inhibície aktivity GR v dôsledku špecifickej väzby ťažkého kovu na tiol/tiolátový redoxný pár a histidínový zvyšok v katalytickom centre redukovanej formy enzýmu. Potom naviazaný kovový ión spôsobuje zmeny v ohybe izoaloxazínového kruhu FAD a hydrofóbnosti jeho mikroprostredia. V dôsledku toho je enzymatická aktivita GR inhibovaná [48].
Podávanie vitamínu E (skupina V) a vitamínu E v komplexe s ETS (skupina VI) spôsobilo zvýšenie hladiny GSH v pečeni potkanov v porovnaní so skupinou II o 15 a 21 percent. Predchádzajúci komplexný vplyv vitamínu E a ETS ďalším pôsobením Cr(VI) počas 7 (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) viedol k zvýšeniu obsahu GSH v pečeňovom tkanive v porovnaní so skupinou II o 21 a 23 percent , resp.
Nezistili sme štatisticky významný rozdiel v zmenách obsahu GSH v živočíšnych tkanivách po podaní vitamínu E a vitamínu E v komplexe s ETS. Pozorovali sme len tendenciu zvyšovať hladiny GSH v obličkách zvierat po 14-dňovej liečbe vitamínom E a vitamínom E v komplexe s ETS.
Podľa literatúry vitamín E vykazuje hepato- a nefroprotektívne vlastnosti proti toxicite vyvolanej Cr(VI), obnovuje obsah GSH a podporuje aktivitu enzýmov AOS [14, 19]. Autori tiež uvádzajú, že tiosulfonáty sú zodpovedné za Nrf2- dependentnú aktiváciu prvkov reagujúcich na antioxidanty (ARE), ktoré indukujú aktiváciu enzýmov antioxidačného obranného systému a zachytávanie voľných radikálov. Aktivácia ARE sprostredkovaná tiosulfonátom stimuluje aktivitu génov kódujúcich -GCS. Možno sa podobné mechanizmy podieľajú na zvyšovaní obsahu GSH pri pôsobení ETS [26]. Literárne údaje tiež naznačujú, že stimulácia ARE indukuje expresiu génov GR a GS. Tieto enzýmy hrajú kľúčovú úlohu pri syntéze a redukcii molekúl GSH [49].
Molekuly tiosulfonátu majú tiež schopnosť transformovať sa na mono-, di- a trisulfidy. Je možné, že produkty transformácie tiosulfonátov obsahujúce síru sa môžu podieľať na biosyntéze nových molekúl GSH [29].
Komplexná predliečba vitamínom E a ETS ďalším aktínom Cr(VI) počas 7 dní (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) vykazovala iba tendenciu k obnoveniu aktivity GP a GR v pečeni potkanov. Štatisticky významný rozdiel sme však v tomto prípade nenašli.
Pôsobenie najmä vitamínu E (skupina V) a v kombinácii s ETS (skupina VI) počas 14 dní viedlo k aktivácii GP v obličkovom tkanive zvierat v porovnaní so skupinou II o 19 a 22 percent. Predchádzajúci komplexný účinok vitamínu E a ETS ďalším pôsobením Cr(VI) počas 7 dní spôsobil zvýšenie aktivity GP o 38 percent v obličkách potkanov skupiny VII v porovnaní so skupinou II (tabuľka 2). Avšak zvýšenie aktivity GP v obličkách potkanov skupiny VII (38 percent) v porovnaní so skupinou II bolo o 47 percent nižšie ako percento hyperaktivácie GP v tkanive obličiek potkanov skupiny III (85 percent) v porovnaní so skupinou I.
Na druhej strane, aktivita GP bola potlačená o 16 percent v obličkovom tkanive potkanov po predchádzajúcom účinku vitamínu E v komplexe s ETS na 14 dní ďalším pôsobením Cr(VI) na 14 dní (skupina VIII) v porovnaní so skupinou II. Avšak zníženie aktivity GP v obličkovom tkanive zvierat skupiny VIII (16 percent) v porovnaní so skupinou II bolo o 11 percent nižšie ako percento inaktivácie GP v obličkách potkanov skupiny III (27 percent) v porovnaní so skupinou I. zvýšenie aktivity GR (8 percent) bolo pozorované po 14 dňoch komplexnej expozície vitamínu E a ETS v obličkovom tkanive zvierat skupiny VI v porovnaní so skupinou II.
Predchádzajúci komplexný vplyv vitamínu E a ETS ďalším pôsobením Cr(VI) počas 7 (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) spôsobil zníženie aktivity GR v obličkách potkanov v porovnaní so skupinou II o 17 a 36 percent, resp.
Intenzita poklesu aktivity GR v tkanive obličiek potkanov skupiny VII (17 percent) a VIII (36 percent) v porovnaní so skupinou II však bola o 28 a 7 percent nižšia ako percento inaktivácie aktivity GR v obličkových homogenátoch skupín III. (45 percent) a IV (43 percent) v porovnaní so skupinou I.
Predpokladáme, že čiastočná stabilizácia aktivity GP a zníženie intenzity supresie GR v obličkách potkana pôsobením Cr(VI) bolo sprostredkované antioxidačným účinkom komplexu vitamínu E a ETS. Výsledky štúdií opísaných vyššie ukázali, že predchádzajúca expozícia vitamínu E a ETS zoslabila intenzitu Cr(VI)-indukovaných LP procesov v obličkách potkanov. Podľa literatúry je prudké zvýšenie obsahu TBARS, LHP a produktov peroxidácie proteínov sprevádzané narušením aktivity enzýmov AOS súvisiacich s GSH [50]. Je možné, že komplexný antioxidačný účinok vitamínu E a ETS stabilizuje enzymatickú aktivitu GP a GR znížením obsahu LHP a TBARS v tkanive obličiek zvierat.
Intraperitoneálna injekcia K2Cr2O7 počas 7 dní teda vedie k miernej kompenzačnej aktivácii GP a zvýšeniu obsahu GSH v pečeni potkanov. Mierna stimulácia GP sa pozoruje aj po 14 dňoch pôsobenia Cr(VI). Avšak 14 dní expozície K2Cr2O7 spôsobuje vyčerpanie pečeňového fondu GSH a inhibíciu aktivity GR. Cr(VI)-indukovaná deplécia obsahu GSH eliminuje v pečeňovom tkanive komplexnou intragastrickou predliečbou vitamínu E a ETS. Pôsobenie Cr(VI) počas 7 dní vedie ku kompenzačnej aktivácii GP a potlačeniu GR v obličkách potkanov. Na druhej strane, 14 dní expozície K2Cr2O7 spôsobí inaktiváciu GP, GR a depléciu renálneho obsahu GSH. Predchádzajúci komplexný vplyv vitamínu E a ETS tlmí intenzitu inaktivácie GR a stabilizuje aktivitu GP v tkanive obličiek potkana v podmienkach oxidačného stresu vyvolaného K2Cr2O7-.
3.3. Antioxidačné enzýmy.
Intraperitoneálna injekcia dvojchrómanu draselného počas 7 a 14 dní viedla k zníženiu aktivity SOD v pečeňovom tkanive zvierat skupín III a IV v porovnaní so skupinou I o 17 a 33 percent (tabuľka 3). Aktivácia SOD bola pozorovaná po 7 dňoch liečby Cr(VI) v tkanive obličiek potkanov skupiny III (21 percent), ale 14 dní pôsobenia Cr(VI) spôsobilo potlačenie enzymatickej aktivity SOD v obličkách zvierat skupiny IV (18 percent ) v porovnaní so skupinou I.
Aktivita CAT sa zvýšila o 11 percent po 7 dňoch expozície Cr(VI), ale 14 dní podávania K2Cr2O7 bolo sprevádzané znížením aktivity CAT o 13 percent v tkanive pečene potkanov skupiny IV v porovnaní so skupinou I. Cr(VI ) toxicita počas 7 dní viedla k aktivácii CAT (o 15 percent), ale toxicita K2Cr2O7 počas 14 dní spôsobila zníženie enzymatickej aktivity CAT v obličkovom tkanive zvierat skupiny IV v porovnaní so skupinou I.
Autori uvádzajú, že dôvodom aktivácie SOD (pečeň a obličky) a CAT (pečeň) v tkanivách potkanov III. skupiny môže byť nadmerná expresia antioxidačných génov alebo kompenzačné mechanizmy systému AOS proti oxidačnému stresu vyvolanému Cr(VI) [51 ,52].
Analýza údajov z literatúry tiež ukazuje, že Cr(VI) je silným inhibítorom enzymatickej aktivity SOD. Možno, že tieto údaje môžu vysvetliť inhibíciu aktivity SOD po dlhšom toxickom aktíne Cr(VI) v tkanivách potkanov skupiny IV (Cr(VI) počas 14 dní). Toxické pôsobenie Cr(VI) vedie k inhibícii enzymatickej aktivity SOD a narušeniu molekulárnej štruktúry SOD v dôsledku zintenzívnenia peroxidačných procesov [53]. Ťažké kovy, vrátane Cr(VI), majú schopnosť inaktivovať enzýmy AOS po priamej väzbe na aktívne miesto zodpovedajúcich enzýmov [54]. Po potlačení inaktivácie SOD dochádza k procesu dismutácie O2- na H2O2. V dôsledku toho môže byť Cr(VI) indukovaná stimulácia tvorby O2- a inhibícia procesov využitia O2- príčinou inaktivácie enzýmov AOS, vrátane CAT [55].
Najmä vitamín E (skupina V) a v kombinácii s ETS (skupina VI) stimulovali aktivitu CAT v pečeňovom tkanive zvierat v porovnaní so skupinou I o 15 a 33 percent. Tiež bola pravdepodobná aktivácia CAT v obličkách potkanov experimentálnych skupín V a VI v porovnaní so skupinou II o 23 a 28 percent (tabuľka 3).
Komplexná predliečba vitamínom E a ETS ďalším aktínom Cr(VI) počas 7 dní (skupina VII) a 14 dní (skupina VIII) spôsobila zvýšenie aktivity CAT v tkanive pečene potkanov v porovnaní so skupinou II o 17 a 9 percent. resp. Aktivácia CAT bola tiež pozorovaná v obličkách potkanov skupiny VII (13 percent) v porovnaní so skupinou II. Enzymatická aktivita CAT v obličkovom tkanive zvierat skupiny VIII však zostala na úrovni ukazovateľov skupiny II.
Literárne údaje uvádzajú, že vitamín E zabraňuje deplécii enzymatickej aktivity SOD, CAT a iných enzýmov AOS v tkanivách myší a potkanov v podmienkach oxidačného stresu [56,57]. Vitamín E tiež zmierňuje oxidačný stres vyvolaný Cr(VI) v semenníkoch potkanov v dôsledku obnovy aktivity SOD a CAT a zníženia intenzity LP procesov [58].
Tiosulfonáty sa podieľajú na Nrf2-závislej aktivácii stimulácie génu AOS [26]. Stimulácia Nrf2 zase vedie k zvýšenej expresii génov kódujúcich CAT [59]. Allicín, jeden z prirodzených analógov tiosulfonátov, sa podieľa na aktivácii génov zodpovedných za expresiu SOD, CAT a Nrf2 [60]. Je možné, že vyššie uvedené antioxidačné vlastnosti vitamínu E, tiosulfonátov a ich prírodných analógov môžu byť dôvodom na obnovenie enzymatickej aktivity CAT pri pôsobení oxidačného stresu vyvolaného Cr(VI).
4. Závery
O antioxidačných vlastnostiach tiosulfonátov je málo známe. Existuje tiež dostatok informácií popisujúcich ochranné vlastnosti tiosulfonátov proti toxicite vyvolanej ťažkými kovmi v tkanivách živočíšneho organizmu. Naše predchádzajúce štúdie naznačujú, že predúprava ETS môže byť účinná pri korekcii toxicity pečene vyvolanej Cr (VI) v organizmoch potkanov. Predpokladáme, že ďalšie štúdie antioxidačných vlastností ETS v kombinácii s antioxidačnými zlúčeninami a bunkovými redukčnými činidlami sú dôležité pre lepšie pochopenie úlohy tiosulfonátov v mechanizmoch prevencie oxidačného stresu vyvolaného ťažkými kovmi.
Zovšeobecnenie získaných výsledkov ukazuje, že pôsobenie K2Cr2O7 vedie k Cr(VI)-indukovanej hepato- a nefrotoxicite v dôsledku zintenzívnenia LP procesov a zvýšenia tvorby LHP a TBARS v oboch tkanivách zvierat. Systém AOS zahŕňa kompenzačné mechanizmy na pôsobenie proti oxidačnému stresu vyvolanému Cr(VI). Tieto mechanizmy sú sprevádzané aktiváciou SOD, CAT a GP v tkanive obličiek, ako aj stimuláciou CAT, GP a akumuláciou GSH v pečeni potkanov po 7 dňoch expozície Cr(VI). Dlhšie pôsobenie Cr(VI) počas 14 dní však vedie k vyčerpaniu zdrojov systému AOS v dôsledku inaktivácie antioxidačných enzýmov (SOD, CAT, GR, GP) a k vyčerpaniu zásoby GSH v tkanivách pečene a obličiek zvierat. Komplex vitamínu E a ETS vykazuje antioxidačný účinok proti toxicite vyvolanej Cr(VI). Intragastrická predbežná liečba týmto komplexom počas 14 dní sa prejavuje znížením Cr(VI)-indukovaných LP procesov v pečeni a obličkách potkanov. Predchádzajúci účinok vitamínu E a ETS tiež zabraňuje deplécii CAT a GSH v pečeni, ako aj eliminuje intenzitu inaktivácie CAT, stabilizuje aktivitu GP a GR v obličkovom tkanive zvierat v stave oxidácie vyvolanej K2Cr2O7- stres. Najmä vitamín E a v komplexe s ETS potláča zvýšenie LHP a stimuluje CAT v oboch tkanivách potkanov. Antioxidačný účinok týchto zlúčenín tiež vedie k akumulácii GSH v pečeni a aktivácii GP obličiek.
Získané výsledky naznačujú, že predúprava vitamínom E a ETS čiastočne stabilizovala Cr(VI)-indukovanú poruchu v mechanizmoch pôsobenia antioxidačného obranného systému v obličkách potkanov. Výsledky našej štúdie sa navyše môžu stať súčasťou podkladu pre tvorbu účinných metód prevencie a korekcie antioxidačných a prooxidačných stavov v obličkách ovplyvnených pôsobením oxidačného stresu vyvolaného Сr(VI).
1 Ústav biochémie adaptácie a ontogenézy živočíchov; Ústav biológie zvierat NAAS; Ľvov; Ukrajina
2 Katedra technológie biologicky aktívnych zlúčenín; Farmácia a biotechnológia Ľvovskej polytechnickej národnej univerzity; Ukrajina
Referencie
1. Sahar, HO; Sherif, MS Zlepšujúce účinky hroznového oleja na chrómom indukovanú nefrotoxicitu a oxidačný stres u potkanov. Slovinský veterinárny výskum Zbornik 2020, 57, 123- 131.
2. Husain, N.; Mahmood, R. Taurine zmierňuje Cr(VI)-indukované poškodenie buniek a DNA: štúdia in vitro s použitím ľudských erytrocytov a lymfocytov. Aminokyseliny2020, 52, 35-53.
3. Tian-Guang, Z.; Ya-Li, Z.; Lei, Li.; Dong-Hai, Z. Antagonistické účinky nano-selénu na poškodenie pečene brojlerov vyvolané otravou Cr (VI) v dráhe AMPK. Environmental Science and Pollution Research International 2020, 27, 41585-41595.
4. Farag, AI; El-Sherry, ES Chrómom indukovaná hepatotoxicita a potenciálny ochranný účinok selénu u dospelých samcov albínov potkanov: histologická, imunohistochemická a molekulárna štúdia. Med. Univerzita J. Cairo 2020, 88, 187- 196.
5. Shih-Chang, F.; Jui-Ming, L.; Kuan-I, L.; Feng-Cheng, T.; Kai-Min, F.; Ching-Yao, Y.; Chin-Chuan, S.; Hsin-Hung, C.; Ren-Jun, H.; Ya-Wen, C.Cr(VI) indukuje ROS-sprostredkovanú mitochondriálne závislú apoptózu v neurónových bunkách prostredníctvom aktivácie signálnej dráhy Akt/ERK/AMPK. Toxikológia in vitro 2020, 65, 1- 16.
6. Fedala, A.; Adjroud, O.; Abid-Essefi, S.; Timoumi, R. Ochranné účinky selénu a zinku proti narušeniu štítnej žľazy vyvolanému dichrómanom draselným, oxidačnému stresu a poškodeniu DNA u gravidných potkanov Wistar. Environ Sci Pollut Res Int 2021
7. On, X.; Li, P. Znečistenie povrchových vôd v Strednej čínskej sprašovej plošine so špeciálnym zameraním na šesťmocný chróm (Cr6 plus): výskyt, zdroje a zdravotné riziká. Expozícia a zdravie 2020, 12, 1- 17, https://doi.org/10.1007/s12403-020-00344-x.
8. Chen, YQ; Murphy, A.; Sun H.; Costa M. Molekulárne a epigenetické mechanizmy karcinogenézy indukovanej Cr(VI). Toxikológia a aplikovaná farmakológia 2019, 377, 1-9,
https://doi.org/10.1016/j.taap.2019.114636.
9. Machado, AB; Caprara, JF; Diehl de Franceschi, I.; Linden, R.; Berlese, DB; Feksa, LR Účinky chronickej expozície šesťmocnému chrómu vo vode na parametre oxidačného stresu u potkanov Wistar. Acta Scientiarum Biological Sciences 2019, 41, 1- 10.
10. Fatma, M.; Raghda, A.; Mohamed, M. Hepatoprotektívny potenciál esenciálneho oleja Rosmarinus officinalis proti hematotoxicite vyvolanej šesťmocným chrómom, biochemickým, histologickým a imunohistochemickým zmenám u samcov potkanov. Environmental Science and Pollution Research 2021, 28, 17445 – 17456.
11. Wang, Y.; Wang, X.; Wang, L.; Cheng, G.; Zhang, M.; Xing, Y.; Zhao, X.; Liu, Y.; Liu, J. Mitofágia vyvolaná poškodením mitochondriálnej funkcie v kuracích obličkách vystavených Cr(VI). Biologický výskum stopových prvkov 2021, 199, 703-711.
12. Zheng, X.; Li, S.; Li, J.; Lv, Y.; Wang, X.; Wu, P.; Yang, Q.; Tang, Y.; Liu, Y.; Zhang, Z. Šesťmocný chróm indukuje renálnu apoptózu a autofágiu prostredníctvom narušenia rovnováhy mitochondriálnej dynamiky u potkanov. Ekotoxikológia a environmentálna bezpečnosť 2020, 204, 1-9.
13. Yang, D.; Yang, Q.; Fu, N.; Li, S.; Han, B.; Liu, Y.; Tang, Y.; Guo, X.; Lv, Z.; Zhang, Z. Srdcová dysfunkcia vyvolaná šesťmocným chrómom prostredníctvom poruchy mitochondriálnej funkcie a dodávky energie sprostredkovanej Sesn{1}}. Chemosphere 2021, 264, 1- 10.
14. Balakrishnan, R.; Satish Kumar, CS; Rani, MU; Srikanth, MK; Boobalan, G.; Reddy, AG Hodnotenie ochrannej úlohy -tokoferolu na hepatotoxicitu vyvolanú voľnými radikálmi a nefrotoxicitu spôsobenú chrómom u potkanov. Indian Journal of Pharmacology 2013, 45, 490-495.
15. Zhang, Y.; Bian, H.; Smieť.; Xiao, Y.; Xiao, F. Hyperaktívna mitofágia vyvolaná Cr(VI) prispieva k strate mitochondrií a cytotoxicite v hepatocytoch L02. Biochemical Journal 2020, 477, 2607-2619.
16. Saidi, M.; Aouacheri, O.; Saka, S.; Tebboub, I.; Ailene, L. Nefrónové ochranné účinky kurkumy na oxidačné poškodenie a oxidačný stres u potkanov pri subchronickej otrave chrómom. Int. J. Biosci 2019, 15, 241-250.
17. Li, J.; Zheng, X.; Ma, X.; Xu, X.; Du, Y.; Lv, Q.; Li, X.; Wu, Y.; Sun, H.; Yu, L.; Zhang, Z. Melatonín chráni pred poškodením srdca vyvolaným chrómom (VI) prostredníctvom aktivácie dráhy AMPK/Nrf2. Časopis
Anorganická biochémia 2019, 197, 1- 10.
18. Science Direct.
19. Shati, AA Zlepšujúci účinok vitamínu E na hepatotoxicitu vyvolanú dvojchrómanom draselným u potkanov. Časopis King Saud University - Science2014, 6, 181- 189.
20. Khalaf, AA;Hassanen, EI;Ibrahim, MA;Tohamy, AF;Aboseada, MA;Hassan, HM;Zaki, AR
Kyselina rozmarínová zmierňuje chrómom indukované oxidačné poškodenie pečene a obličiek a poškodenie DNA u potkanov. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 2020, 34, 1- 12.
