Výrazné Toll-like receptory Génová expresia a gliová odozva v rôznych oblastiach mozgu prírodnej klusavky, časť 3

Skúmali sme možné korelácie medzi neuropatologickými znakmi priónovej choroby a expresiou génu TLR v štyroch rôznych oblastiach mozgu oviec prirodzene infikovaných scrapie. Vo všetkých štyroch oblastiach mozgu sme pozorovali významné rozdiely v depozícii PrPSc, spongióze, astroglióze a mikroglióze u prirodzene infikovaných oproti kontrolným ovciam.

Priónová choroba, tiež známa ako choroba chrámu, choroba požierajúca vosk atď., je akútna vírusová infekcia spôsobená priónmi. Ochorenie sa prenáša najmä konzumáciou tepelne neupraveného jedla obsahujúceho prióny. Po infikovaní priónmi môže spôsobiť zápal mozgu a poškodenie nervového systému a môžu sa vyskytnúť príznaky ako bolesť hlavy, vracanie a horúčka.

Keď sa však stretneme s takouto situáciou, nemôžeme stratiť dôveru v našu pamäť kvôli existencii priónovej choroby. Väčšina infikovaných ľudí sa môže po liečbe zotaviť a obnoviť si pamäť.

Samozrejme, z preventívneho hľadiska môžeme skúsiť jesť viac varenej stravy, aby sme sa vyhli priónovej infekcii. Zároveň, ak pociťujete nejaké príznaky, mali by ste čo najskôr navštíviť aj lekára, aby ste predišli zhoršeniu ochorenia.

V každodennom živote môžeme na zlepšenie pamäti vyskúšať nejaký jednoduchý tréning pamäti, ako je čítanie, zostavovanie zoznamov, organizovanie udalostí a informácií atď. Tieto tréningy si nevyžadujú veľa času a energie, ale sú veľmi dôležité pre udržanie zdravého mozgu a efektívnu funkciu pamäte.

Skrátka, pri stretnutí s chorobami, ako je priónová choroba, by sme sa k nej mali postaviť pozitívne, vyhľadať odbornú lekársku liečbu a preventívne opatrenia a dbať na každodenné cvičenia pamäti, aby sme si zabezpečili fyzické zdravie a efektívnu prácu. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov, ktoré sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže Cistanche tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, aby mozog získal dostatočnú výživu a energiu, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť spôsoby, ako zlepšiť funkciu mozgu

Tieto rozdiely boli najzreteľnejšie v medulla oblongata, najviac caudalarea. Naopak, najmiernejšie lézie boli pozorované vo frontálnom kortexe, najviac rostraarea. Tento sekvenčný vzor je v súlade s cestou priónovej neuroinvázie a diseminácie v CNS, začínajúc na miestach vstupu do miechy a obexu a nakoniec zasahujúcej do frontálneho kortexu [1,5,51].

Neočakávane, vzhľadom na ich anatomickú blízkosť, sme pozorovali drastický pokles ukladania PrPSc a vakuolizácie a významný pokles astrogliózy pri prechode z talamu do hipokampu, nesledujúc postupnú kaudo-rostrálnu progresiu patológie.

Špecifická mikrogliamorfológia známa ako tyčinková mikroglia bola pozorovaná v blízkosti pyramídových bunkových neurónov na CA3, ale chýbala vo všetkých ostatných študovaných neuroanatomických oblastiach.

Podľa našich vedomostí tento mikrogliálny profil doteraz nesúvisel s neurozápalom vyvolaným priónmi, hoci nedávna štúdia uvádzala prítomnosť tyčinkovitých mikroglií v mozočku ľudských pacientov s CJD [52].

Hoci sa od prvých opisov v roku 1900 málo študovalo, tyčinkové mikroglie boli nedávno hlásené pri neurologických poruchách, ako je epilepsia, demencia s Lewyho telieskami, Huntingtonova choroba a AD, konkrétne v stredne poškodených oblastiach mozgovej kôry a hipokampu [40,41,53]. Fenotypová expresia a funkcie tyčinkovej mikroglie ešte nie sú jasné.

Avšak skutočnosť, že tento morfologický znak sa typicky zhoduje s prítomnosťou neurónových prvkov, ktoré sú poškodené alebo náchylné na poškodenie, naznačuje neuroprotektívnu úlohu [42,54,55].

Nepredpokladá sa, že by tyčinkové mikroglie súviseli so závažnými léziami, pretože v týchto podmienkach sa očakáva progresia smerom k ameboidnej morfológii [56]. Prítomnosť rodmikroglie v hipokampe oviec infikovaných scrapie, ale nie v iných oblastiach mozgu, môže naznačovať neuroprotektívne prostredie v dobrej zhode s obmedzenou stratou neurónov pozorovanou v tejto oblasti.

Naša analýza expresie TLR odhaľuje priamu koreláciu medzi závažnosťou lézie a nadmernou expresiou génu TLR, ktorá sa zhoduje s vyššie uvedenou kaudo-rostrálnou progresiou priónovej neuropatológie.

Naopak, TLR4 bol podobne nadmerne exprimovaný vo všetkých oblastiach, bez ohľadu na závažnosť lézie. Nadmerná expresia TLR4 v oblastiach s miernejším poškodením neurónov (tj hipokampus a frontálny kortex) môže odrážať aneuroprotektívnu úlohu, ako už bolo opísané pre fagocytárne bunky, ako sú makrofágy a mikroglie [23,57]. priondisease a ľudských pacientov [22,26,31].

Pozorovali sme iba upreguláciu TLR7 v medulla oblongata, najviac poškodenej oblasti, v ktorej boli zistené najvyššie hladiny spongiózy a ukladania PrPSc.

Neurónová smrť prostredníctvom apoptózy bola predtým spojená so stimuláciou TLR7 [58,59] a jej nadmerná expresia v predĺženej mieche môže súvisieť s týmto mechanizmom [60]. Hoci úloha TLR1 pri neurodegeneratívnych ochoreniach ešte nie je jasná, zapojenie TLR2 do mikrogliálnej aktivácie sa čoraz viac preukazuje pri amyotrofickej laterálnej skleróze, SM a AD [61,62].

Zatiaľ čo úloha TLR2 v priónových ochoreniach nie je úplne objasnená, boli navrhnuté priaznivé účinky: doba prežitia je znížená u myší, ktoré neexprimujú TLR2 po intracerebrálnej inokulácii scrapie [22].

Nadmerná expresia TLR2 a MyD88 môže tiež naznačovať prozápalový mikrogliový fenotyp, čo by mohlo vysvetliť zvýšenie TNF- a IL-6, ktoré sme pozorovali v talame [8,63].

Je zaujímavé, že experimenty využívajúce bunky EOC 13.31, imortalizovanú mikrogliu podobnú myšaciu bunkovú líniu, ukázali dysreguláciu dráhy zápalovej odpovede v reakcii na aktiváciu TLR2 a naznačili súvislosť medzi expresiou TLR2 a akumuláciou mikroglií v stave, ktorý nie je optimálny pre fagocytózu [26]. .

Preto nadmerná expresia TLR2 v medulla oblongata a talame, najviac poškodených oblastiach, v ktorých boli tiež detegované nadmerné hladiny fagocytárnej mikroglie, naznačuje, že dysfunkčný klírens PrPSc môže viesť k trvalej akumulácii PrPSc a poškodeniu neurónov [9,17].

Naše zistenia v hipokampe oviec infikovaných scrapie odhaľujú opačný vzor v porovnaní s inými analyzovanými oblasťami mozgu, so zníženou reguláciou TLR1, TLR2 a MyD88 a bez zmien cytokínov.

To môže naznačovať, že mikroglie reagujú v hipokampe odlišne; skutočne sa ukázalo, že nedostatok TLR2 v primárnych mikrogliálnych bunkových kultúrach od neonatálnych myší (vo veku 0–3 dni) a stimulovaných neurotoxickým peptidom PrP106-126 posúva aktiváciu mikroglie z neurotoxického na neuroprotektívny fenotyp [63 ].

Relevantnosť PrP106-126 peptidu v priónovej patológii však bola spochybnená [64]. CD36 je odlišný typ receptora na rozpoznávanie vzorov, ktorý je schopný rozpoznať endogénne odvodené ligandy, ako sú peptidy tvoriace amyloid, ktorý má stanovené úlohy pri endocytickom vychytávaní týchto zložiek [65,66]. Tento receptor sa spája s prozápalovým mikrogliálnym stavom [67].

In vitro stimulácia BV-2 buniek, typu imortalizovaných mikrogliálnych buniek, s PrP{1}} vedie k upregulácii CD36, zvýšeniu prozápalových cytokínov a produkcie iNOS a NO [68,69].

Okrem toho rozpoznanie -amyloidového peptidu pomocou CD36 spúšťa zostavenie nového heterotrimérneho komplexu CD36-TLR4-TLR6, ktorý aktivuje vrodenú imunitnú odpoveď [70,71].

V našej štúdii všetky regióny vykazovali významnú upreguláciu CD36 okrem hipokampu. Upregulácia CD36, TLR4 a TLR6 v najviac poškodených oblastiach, medulla oblongata a obex, naznačuje zapojenie tejto triády do spúšťania prozápalovej mikrogliálnej odpovede na priónovú infekciu.

Naopak, neprítomnosť nadmernej expresie CD36 a TLR6 v hipokampe naznačuje, že tento heterotrimér sa netvorí, čo opäť svedčí o aneuroprotektívnom prostredí v tejto oblasti mozgu.

Zostáva vysvetliť, prečo mikroglie reagujú v tejto oblasti mozgu odlišne. Zatiaľ čo tropizmus buniek špecifický pre priónový kmeň by mohol určiť typ mikrogliózy a astrogliózy, nedávne zistenia naznačujú, že obe reakcie sú ovplyvnené hlavne oblasťou mozgu [18,72].

Ani mikroglie, ani astroglie nereagujú jednotne v CNS a táto špecifická odpoveď pre daný región môže viesť k selektívnej zraniteľnosti niektorých oblastí mozgu pri priónových ochoreniach [16,18].

V tejto súvislosti sa predpokladalo, že zápalová odpoveď mikroglií na priónovú infekciu je regulovaná sialyláciou PrPSc [14,73–75] a že sialylácia PrPSc je závislá od oblasti mozgu [18]. Konkrétne vyššia úroveň sialylácie PrPSc sa nachádza v hipokampe a kortexe ako v talame a mozgovom kmeni, čo naznačuje potenciálnu úlohu v selektívnej zraniteľnosti týchto oblastí mozgu [18,73,75].

Vysoká úroveň sialylácie PrPSc v hipokampe môže byť spojená so spomalenou replikáciou priónov, čo vedie k výraznej priónom indukovanej mikrogliálnej aktivácii v tejto oblasti, čo je v súlade so zníženou citlivosťou tejto oblasti vyplývajúcou z našich zistení.

Je zaujímavé, že predchádzajúce zistenia naznačujú, že hipokampus môže byť chránený pred priónovou neurotoxicitou pri prirodzenej infekcii CJD [76,77] a podrobné neuropatologické štúdie prípadov CJD zaznamenali miernejšie lézie v hipokampe ako v iných oblastiach mozgu [76].

Konkrétne sa zdá, že archikortex, ktorý primárne zahŕňa hipokampus, je relatívne ušetrený v porovnaní s inými kortikálnymi oblasťami pri CJCH [77]. Toto mierne postihnutie hipokampu opísané pri prirodzenej CJD je v súlade so súčasnými zisteniami u oviec prirodzene infikovaných klusavkou.

Je zaujímavé, že táto čiastočná ochrana proti najmenej dvom prirodzeným priónovým ochoreniam sa vyskytuje v hipokampe, ktorý je fylogeneticky najstaršou oblasťou mozgovej kôry a pozostáva z najzákladnejšieho typu kortikálneho tkaniva.

Na preskúmanie relevantnosti tejto korelácie budú potrebné ďalšie štúdie. V súhrne naše výsledky odhaľujú obzvlášť miernu neuropatológiu v hipokampe oviec infikovaných prírodnou klusavkou, ktorá sa vyznačuje nižšími hladinami spongiózy, depozície PrPSc a astrogliózy, než sa očakávalo vzhľadom na kaudálnu až - rostrálne šírenie scrapielézií.

Okrem toho prítomnosť exkluzívnej mikrogliálnej morfológie v hipokampe, tyčinkovej mikroglie, ktorá môže hrať neuroprotektívnu úlohu [54], spolu s odlišným profilom génovej expresie receptora rozpoznávania vzoru (gény TLR a CD36), ďalej odlišuje túto oblasť mozgu od iných neuroanatomických oblastí. regiónoch u oviec infikovaných klusavkou.

Tieto zistenia naznačujú stupeň neuroprotekcie proti prirodzenej priónovej infekcii v hipokampe, ktorý si zasluhuje ďalšie skúmanie. Neurodegeneratívne ochorenia spôsobené chybným poskladaním proteínov zahŕňajú začarovaný cyklus zápalu, ktorý pozostáva z akumulácie nesprávne poskladaných proteínov, aktivácie glií a uvoľnenia gliových zápalových mediátorov, ktoré zhoršujú ukladanie proteínov a neurozápal.

Prerušenie tohto začarovaného cyklu zacielením na aktiváciu mikroglií pomocou špecifických inhibítorov TLR v špecifickom štádiu ochorenia môže predstavovať sľubný prístup k obmedzeniu ďalšieho neurozápalu. Naše zistenia zdôrazňujú downreguláciu TLR2 ako potenciálny cieľ pre takýto prístup, pretože to môže vyvolať posun v mikrogliách z neurotoxického na aneuroprotektívny fenotyp [63].

Napokon, aj keď sa dosiahol veľký pokrok v charakterizácii diverzity glialfenotypov pomocou myších modelov neurodegeneratívnych chorôb, otázka, či myšacie modely verne odrážajú kľúčové aspekty priónových chorôb, je predmetom diskusie [78,79].

Naše výsledky v transgénnom modeli tg338 reprodukovali bežné patologické príznaky priónovej infekcie, vrátane výrazného ukladania PrPSc, neuropilovej spongiózy, astrogliózy a mikrogliózy.

Infikované myši však vykazovali významnú nadmernú expresiu TLR1 a TLR2 a tendenciu k nadmernej expresii TLR7. Zatiaľ čo upregulácia týchto génov bola predtým opísaná v iných modeloch myší infikovaných scrapie [22,26], tento vzorec je v rozpore s našimi zisteniami v mozgu oviec. Je pozoruhodné, že v myšom mozgu sme nepozorovali žiadne zmeny v expresii TLR4, génu, pre ktorý boli vo vzorkách oviec pozorované najväčšie zmeny v expresii.

Tieto protichodné zistenia môžu byť dôsledkom rôznych ciest infekcie a/alebo hladín expresie priónového proteínu u myší tg338 [80,81]. Naše výsledky však v konečnom dôsledku naznačujú, že intracerebraliokulácia scrapie u nadmerne veľkých myší tg338 nereprodukuje imunitnú odpoveď pozorovanú pri prirodzenej infekcii scrapie.

4. Materiály a metódy

4.1. Ovce infikované klusavou a kontrolné

Do tejto štúdie bolo zahrnutých 21 samíc oviec Rasa Aragonesa (vo veku od 2 do 6 rokov). Všetky boli genotypizované na polymorfizmy PRNP, ako už bolo uvedené [82], a zistilo sa, že vykazujú genotyp ARQ/ARQ. Kontrolné zvieratá (n=8) boli vybrané z kŕdľa, v ktorom neboli hlásené žiadne prípady klusavky.

Zvieratá infikované klusavkou (n=13) boli získané z kŕdľov postihnutých klusavkou a boli diagnostikované imunohistochémiou (IHC) biopsií rektálnej sliznice. Infekcia bola potvrdená post-mortem imunodetekciou PrPSc v obexe podľa publikovaných kritérií [83].

Zvieratá boli usmrtené intravenóznym predávkovaním barbiturátmi a vykrvácaním.

V čase eutanázie všetky ovce infikované klusavkou vykazovali klinické príznaky rôznej závažnosti: niektoré zvieratá vykazovali počiatočné príznaky, ako je svrbenie chrbta a slabín po digitálnej stimulácii a miernom znížení stavu tela, zatiaľ čo iné vykazovali pokročilé klinické príznaky, ako je spontánne škrabanie koreň chvosta, bedrovej oblasti a končatín, neurologické príznaky vrátane ataxie a chvenia hlavy a škrípanie zubov, strata vlny a intenzívna strata hmotnosti [84].

4.2. Infekcia myši Tg338

Na vyhodnotenie expresie génu TLR v mozgu myšacieho modelu scrapie, desať týždňov starých myší tg338 (n=8) (nadmerne exprimujúcich ovčie VRQ/VRQ PrPC 8- až 10-násobne [ 85]) boli naočkované zásobou mozgu z prirodzenej klusavky infikovanej ovce Rasa Aragonesa usmrtenej v klinickom štádiu.

Myši boli naočkované 2 0 ul inokula proti scrapie (zriedené 2 % hmotn./obj. v PBS) do pravej mozgovej hemisféry v anestézii izofluránom. Intracerebraliinjekcie sa uskutočňovali s použitím 50 ul injekčnej striekačky a 25G ihly. Po inokulácii sa myšiam podala subkutánna injekcia buprenorfínu (0,3 mg/kg) na vyvolanie analgézie.

Ako kontroly boli myši tg338 (n=8) naočkované mozgovým homogenátom z oviec negatívnych na scrapie podľa rovnakého postupu opísaného vyššie. U myší sa monitoroval vývoj klinických príznakov a boli usmrtené cervikálnou dislokáciou, keď sa objavili terminálne príznaky choroby, ako je ťažká ataxia a neschopnosť kŕmiť sa.

Myši infikované inokulom pozitívnym na scrapie vykazovali priemerný čas prežitia 187 ± 26 dpi.

4.3. Zbierka tkanív

Odobrali sa vzorky z CNS a sagitálne sa rozdelili na dve polovice; jeden bol fixovaný v 10% neutrálnom pufrovanom formalíne na histopatologickú a imunohistochemickú analýzu a druhý bol priamo zmrazený a udržiavaný pri teplote -80 ◦C na analýzu proteínov alebo stabilizovaný v roztoku RNAlaterTM (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) na extrakciu RNA a potom zmrazený a uskladnený pri -80 ◦C.

4.4. Sekvenovanie PRNP

DNA bola extrahovaná zo vzoriek krvi pomocou súpravy Speedtools Tissue DNA Extraction kit (Biotools, Madrid, Španielsko) podľa pokynov výrobcu. PCR amplifikácia a sekvenovanie sa uskutočnili tak, ako bolo opísané vyššie [82].

4.5. Imunohistochémia

Formalínom fixované tkanivá boli spracované podľa štandardných histopatologických postupov. Tkanivové rezy boli zaliate do parafínu, narezané na 4 um hrubé rezy a zafarbené hematoxylínom-eozínom (HE) na vyhodnotenie vakuolizácie a neuropilovej spongiózy.

IHC na detekciu PrPSc sa uskutočnilo s použitím myšej monoklonálnej primárnej protilátky L42 u oviec (riedenie 1:500 pri teplote miestnosti počas 30 minút) (R-Biopharm, Darmstadt, Nemecko) a králičej polyklonálnej protilátky R486 u myší (1: 8000 riedenie, cez noc pri 4 °C) (R. Jackman, nepublikované), ako už bolo opísané [86,87].

Rezy sa tiež podrobili konvenčnému imunofarbeniu astrocytového markera gliálneho fibrilárneho kyslého proteínu (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Dánsko) a mikrogliového markeru ionizovanej vápnik-väzbovej molekuly 1 (Ibal) (1:1000; Wako, Richmond , VA, USA), podľa publikovaných protokolov [88]. Všetky histologické a IHC hodnotenia vykonali dvaja veterinárni patológovia zaslepení klinickými údajmi.

Hodnotenia spongiózy a intenzity farbenia PrPSc boli semikvantitatívne vykonané a upravené podľa kritérií opísaných v predchádzajúcich štúdiách: vakuolizácia neuropilu a perikarya bola hodnotená od 0 (neprítomná) po 5 (veľmi početná a splývajúca) [51], PrPSc signál bol kvantifikovaný na základe rozsahu imunofarbenia od 0 (bez značenia) do 5 (intenzívne jednotné značenie), ako už bolo uvedené [89], a rozsah imunoznačenia GFAP a Iba1 bol hodnotený na škále od {{ 8}} až 5 (0=slabé zafarbenie; 5=značné imunoznačenie v celej oblasti), ako je opísané [88]. Boli hodnotené štyri oblasti mozgu: frontálna kôra (Fc), talamus (Th), formácia hipokampu (Hc) a medulla oblongata (Mo), pričom každá oblasť bola globálne analyzovaná na hodnotenie a graficky znázornená ako priemer ± štandardná chyba.

4.6. Western Blot

100 mg mozgového tkaniva každej oblasti mozgu (Fc, Th, Hc a Mo) z 13 oviec infikovaných scrapie, 8 s pokročilými klinickými príznakmi a 5 s začínajúcimi klinickými príznakmi, bolo homogenizovaných v 1 ml lyzačného pufra.

Hemiencefalóny 8 infikovaných a 8 kontrolných myší sa homogenizovali pri 10 % (hmotn./obj.) v lyzovacom pufri. Vzorky tkaniva sa homogenizovali miešacími skúmavkami (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pomocou homogenizátora TeSeEPrecess 48 TM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a koncentrácia proteínu sa merala pomocou súpravy PierceTM BCA Protein Assay kit (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) podľa pokynov výrobcu.

Na analýzu PrPres sa rovnaké množstvá proteínov z tkanivových homogenátov inkubovali 10 minút pri 37 °C s roztokom proteinázy K, ako už bolo opísané [90].

Výsledné vzorky sa podrobili elektroforéze v 12 % CriterionTM XT Bis-Tris Proteín Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a preniesli sa na PVDF membrány, ktoré sa na 1 hodinu blokovali 2 % odtučneným sušeným mliekom v TBST (Tris- pufrovaný fyziologický roztok s 0.1 % Tween20).

Na imunoblotovanie sa membrány inkubovali cez noc pri 4 °C s primárnou protilátkou Sha31 (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Francúzsko) v koncentrácii 1 ug/ml, po čom nasledovala 1 hodina inkubácie pri izbovej teplote (RT) s chrenovou peroxidázou- konjugovaná anti-myšia IgG sekundárna protilátka (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA).

Imunoreaktivita sa detegovala pomocou chemiluminiscenčného substrátu ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Nemecko). Expresia proteínu TLR4 sa analyzovala z tkanivových homogenátov zmiešaných s 2 x Laemmli Sample pufrom (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. .

Štyridsať mikrogramov celkového proteínu sa nanieslo do každej jamky, spracovalo sa v 7,5% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a prenieslo sa na PVDF membrány, ktoré sa potom blokovali na 2 hodiny 4% hovädzím sérovým albumínom. (BSA) (Merck, Darmstadt, Nemecko) v TBST pri teplote miestnosti. Membrány sa inkubovali cez noc pri 4 °C s králičou polyklonálnou anti-TLR4 protilátkou (Novus Biological, Minneapolis, MN, USA) v koncentrácii 0,5 µg/ml a potom sa premyli a inkubovali s kozím antikráličím IgG ( H + L) sekundárna protilátka HRP (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) o 1:20,000 počas 1 hodiny pri teplote miestnosti.

Bloty boli vizualizované tak, ako je opísané vyššie. Potom boli membrány stripované s RestoreTM Western Blot Stripping pufrom (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) počas 15 minút pri 37 °C, premyté a opäť blokované.

Potom boli membrány inkubované cez noc pri 4 °C s myšou monoklonálnou-aktínovou primárnou protilátkou (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) v pomere 1:1000, premyté a inkubované s anti-myšou sekundárnou protilátkou m-IgGBKBP-HRP (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) počas 1 hodiny. Po premytí boli bloty vyvinuté tak, ako je opísané vyššie.

Denzitometria sa uskutočnila pomocou softvéru ImageJ a hodnoty sa normalizovali pomocou -aktínu. Normalizované hodnoty boli znázornené pomocou GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, USA).

Štatistické analýzy na porovnanie infikovaných a kontrolných skupín sa vykonali pomocou Studentovho t-testu a rovnosť rozptylov sa určila pomocou Levene'stestu pomocou softvéru SPSS (SPSS Statistics for Windows, verzia 17.0, Chicago, IL, USA). Rozdiely medzi skupinami sa považovali za štatisticky významné pri * p<0.05.

4.7. Extrakcia RNA, syntéza cDNA a expresia génov

Celková RNA oviec bola extrahovaná z 90 mg vzoriek tkaniva z frontálneho kortexu, talamu, hipokampu a medulla oblongata. Myšie mozgy boli rozdelené v strednej čiare a bola z nich extrahovaná celková RNA<90 mg obtained from the thalamic area. 

Tkanivá boli homogenizované pomocou homogenizátora TeSeEPrecess 48TM (Bio-Rad) s mini súpravou RNeasy LipidTissue (Qiagen, Hilden, Nemecko) v kombinácii s TURBO DNázou (Invitrogen TM, Waltham, MA, USA), aby sa odstránila možná kontaminácia genómovou DNA. Koncentrácia RNA sa stanovila spektrofotometricky pomocou spektrofotometra NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) a pre každú vzorku sa analyzovali pomery 260/280 a 260/230, aby sa overila čistota vzorky.

Jeden mikrogram komplementárnej DNA (cDNA) bol syntetizovaný pomocou qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Okrem toho bola účinnosť liečby DNázou hodnotená v RT-negatívnych vzorkách. Po reverznej transkripcii sa rovnaká dávka zriedenej cDNA podrobila qPCR na amplifikáciu TLR.

Na normalizáciu expresie cieľových génov boli vybrané dva bežne používané gény housekeepingu (HK): glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) a aktín-beta (ACT) [91]. Stabilita tohto génu HK bola overená v našich experimentálnych podmienkach. Expresia messenger RNA (mRNA) bola stanovená pomocou qPCR pre 1 až 10 ovčích génov TLR, 1 až 9 myších génov TLR a génu MyD88 pre oba druhy.

Dva prozápalové (TNF- a IL-6) a dva protizápalové (IL-10 a TGF-) cytokíny boli tiež študované v ovčom talame a hipokampe. Sekvencie a účinnosti primérov boli publikované už skôr alebo boli navrhnuté pomocou nástroja Primer3Plus [92] (tabuľka 2).

Overili sme účinnosť každého génu pri vytváraní štandardnej krivky amplifikáciou 1:2 sériových riedení kontrolnej cDNA a potom skontrolovaním linearity medzi počiatočnou koncentráciou šablóny a prahovými hodnotami cyklu (Ct). Všetky gény vykazovali korelačný koeficient medzi 0,9 a 0,99, s hodnotou smernice štandardných kriviek v rozsahu -3,2 až -3,5 a účinnosťou qPCR 90 – 110 %.

Reakcie qPCR sa uskutočnili pomocou systému Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System, 96-jamka s univerzálnymi amplifikačnými podmienkami: počiatočná aktivácia a denaturačný krok cDNA 10 minút pri 95 ◦C, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 3 s pri 95 ◦C a 30 sa 60 ◦C.

Na identifikáciu prítomnosti nešpecifických PCR amplikónov alebo vysokých hladín primerdimérov sme po každej reakcii qPCR vykonali protokol disociačnej krivky. Každá vzorka sa analyzovala trojmo v celkovom reakčnom objeme 10 µl, ktorý pozostával z 15 ng cDNA, 5 µl Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) a požadovaného množstva vpred a vzad. primérov (tabuľka 2).

Bola pridaná voda bez nukleázy do konečného objemu 10 ul. Hladiny génovej expresie boli stanovené pomocou komparatívnej Ct metódy. Výsledky boli reprezentované ako násobok zmeny a rozdiely v génovej expresii vzhľadom na priemernú úroveň kontrolnej skupiny škálované na 1.

4.8. Analýza dát a štatistika

Všetky zhromaždené kvantitatívne údaje boli testované na normalitu pomocou Shapiro–Wilk Wtest. Histologické a imunohistochemické rozdiely medzi infikovanou a kontrolnou skupinou boli hodnotené pomocou Studentovho t-testu alebo Mann-Whitneyho U testu v závislosti od parametrickej alebo neparametrickej distribúcie údajov.

Štatistické rozdiely medzi štyrmi rôznymi oblasťami mozgu u oviec infikovaných scrapie boli stanovené pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Bonferroniho post hoc test alebo Kruskal-Wallisov test, v závislosti od parametrickej alebo neparametrickej distribúcie údajov. Štatistické analýzy údajov qPCR sa uskutočnili z priemerných hodnôt ∆Ct pre každý gén.

Na štatistické porovnanie infikovaných a kontrolných skupín sa uskutočnil Studentov t-test alebo Mann-Whitney U test v závislosti od normálnej distribúcie každého génu a rovnosť odchýlok sa určila Leveneovým testom. Rozdiely v expresii sa považovali za významné pri p < 0,05.

Na označenie p-hodnôt v obrázkoch boli použité nasledujúce zápisy: * p < 0.05; ** p Menšie alebo rovné 0.01; # p < 0.1. Na štatistické analýzy bol použitý softvér SPSS (SPSS Statistics for Windows, verzia 17.0, Chicago, IL, USA). Grafy boli vytvorené pomocou GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, USA) a údaje zobrazené na obrázkoch predstavujú priemer a štandardnú chybu priemeru (priemer ± SEM).

5. Závery

Pokiaľ je nám známe, táto štúdia je prvou, ktorá opisuje hladiny expresie TLRgénov v rôznych oblastiach mozgu prirodzených oviec infikovaných scrapie a nadmerne veľkých myší tg338 experimentálne infikovaných scrapie.

Naša štúdia jasne ukazuje, že TLR, a najmä TLR4 u oviec a TLR1 a TLR2 u myší, sa podieľajú na patogenéze klusavky. Okrem toho, na rozdiel od všetkých ostatných študovaných oblastí, výrazný profil génovej expresie TLR spolu s jedinečnou mikrogliálnou morfológiou a mierna neuropatológia pozorovaná v hipokampe naznačuje imunitnú odpoveď špecifickú pre oblasť mozgu pri infekcii naturalscrapie.

Na charakterizáciu expresie TLR v mikrogliách, astrogliách a neurónoch pri infekcii scrapie však budú potrebné ďalšie štúdie, aby sme pochopili presný príspevok každého typu buniek k neurozápalu. Okrem toho je ešte potrebné určiť, či je aktivácia TLR priamou reakciou na toxicitu priónov alebo sa vyskytuje sekundárne k iným zápalovým mechanizmom.

TLR predstavujú sľubný cieľ pre terapeutické prístupy k topriónovým ochoreniam, a preto bude potrebné lepšie pochopenie neurozápalových reakcií regulovaných TLR, aby sa zabezpečil ďalší pokrok v tejto oblasti.

Doplnkové materiály: Nasledujúce materiály sú k dispozícii online na adresehttps://www.mdpi.com/article/10.3390/IJMS23073579/S1.

Autorské príspevky: Konceptualizácia, výskum a správa údajov, MCG a LMC; príprava na písanie originálu, MG-M., MCG a LMC; experimentálna metodológia, MG-M.; písanie-recenzia a editácia, MG-M., MCG, LMC a AO; metodika in vivo, MB; financovanie akvizície, RB a JJB; molekulárna metodológia, BS-P.; supervízia, MCG a JJB Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Tento výskum financovalo „Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento“ (vláda Aragónska) prostredníctvom projektu „A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes“.

Vyhlásenie inštitucionálneho revízneho výboru: Všetky postupy týkajúce sa zvierat boli v súlade s usmerneniami obsiahnutými v španielskom zákone na ochranu zvierat RD53/2013 a smernici Európskej únie 2010/63 o ochrane zvierat používaných na pokusné účely. Protokol bol schválený Výborom pre etiku experimentov na zvieratách Univerzity v Zaragoze (číslo povolenia: PI38/159 október 2015 a PI19/14 11 apríl 2014).

Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Údaje uvedené v tejto štúdii sú dostupné v rámci textu článku, obrázkov a doplnkového materiálu.

Poďakovanie: Ďakujeme Olivierovi Andreolettimu (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) a Vincentovi Beringueovi (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) za láskavé poskytnutie myší tg338 používaných na tieto experimenty.

Konflikty záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov. Investori nezohrávali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie; pri zbere, analýzach alebo interpretácii údajov; pri písaní rukopisu alebo pri rozhodnutí o zverejnení výsledkov. Obrázky a obrázky v tomto rukopise sú pôvodné údaje.

Referencie

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Včasná akumulácia PrP(Sc) v lymfoidných a nervových tkanivách spojených s črevom citlivých oviec z kŕdľa romanov s prírodnou ksrapiou. J. Gen. Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prionové choroby a kríza BSE. Science 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Včasné šírenie klusavky z gastrointestinálneho traktu do centrálneho nervového systému zahŕňa autonómne vlákna splanchnických a vagusových nervov. J. Virol. 2001, 75, 9320-9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions a ich smrteľná cesta do mozgu. Nat. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WE; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc šíriace vzory v mozgu oviec spojené s rôznymi typmi priónov. Vet. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Dôkaz pre skorú zápalovú reakciu v centrálnom nervovom systéme myší so scrapií. Neuroveda 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner, S.; Wadsworth, JD; a kol. Priónová neuropatológia sleduje akumuláciu alternatívnych izoforiem priónového proteínu po tom, čo infekčný titer dosiahol vrchol. Nat. komun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Definovanie reakcie mikroglie na časový priebeh chronickej neurodegenerácie. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Mikroglia pri priónových chorobách. J. Clin. Vyšetrovať. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Úloha mikroglie v priónových chorobách: Paradigma funkčnej diverzity. Front. Starnutie Neurosci. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogenita v distribúcii a morfológii mikroglií v normálnom mozgu dospelých myší. Neuroveda 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Heterogenita v morfológii a fyziológii astrocytov. Brain Res. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com