Model Drosophila na štúdium črevnej mikrobioty v správaní a neurodegeneratívnych ochoreniach, časť 1

Abstrakt:

Pribúdajúce dôkazy naznačujú, že črevná mikroflóra je spojená s niekoľkými fyziologickými procesmi a vývojom chorôb u cicavcov; základné mechanizmy však zostali nepreskúmané najmä kvôli zložitosti črevného mikrobiómu cicavcov. Ovocná muška, Drosophila melanogaster, je cenným zvieracím modelom na štúdium interakcií hostiteľ-črevná mikroflóra v translačných aspektoch.

Zvieratá a pamäť sú veľmi zaujímavý vzťah. Od vernosti psov po inteligenciu myší, spomienky zvierat boli už dlho predmetom údivu a zvedavosti. Zatiaľ čo zvieratá sa líšia v tom, ako dobre si pamätajú, ich pamäť dáva dôveru k záveru, že zvieratá majú nielen silný pud sebazáchovy, ale sú tiež schopné učiť sa zo skúseností, čo naznačuje, že pamäť je dôležitá.

Po prvé, psy a mačky sú dva najvhodnejšie domáce zvieratá pre ľudí. Všetci sú veľmi šikovní a majú veľmi dobré spomienky. Dokážu si zapamätať vôňu a zvuk majiteľa a prostredia a môžu tiež vyjadrovať emócie prostredníctvom určitého správania. Sila tejto pamäte sa odráža v schopnosti psov a mačiek nájsť stratených majiteľov. Aj keď je to už dávno, čo majiteľ odišiel, pokiaľ existujú miesta a pachy, ktoré sa dajú identifikovať, budú hľadať ďalej.

Po druhé, myši patria tiež medzi zvieratá s obzvlášť vysokým IQ. Pamäť myší je oveľa lepšia, ako si predstavovali. Dokážu si zapamätať, kam idú, kde majú jedlo a územie, a tiež dokážu rozpoznať a zapamätať si ľudí alebo zvieratá, ktoré pre nich predstavovali nebezpečenstvo. Experimenty niektorých vedcov zistili, že myši rozpoznávajú a reagujú na prostredie aj prostredníctvom hudby a tónov, čo ukazuje, že pamäť zvierat zahŕňa zmyslovú, emocionálnu a logickú inteligenciu.

Vo všeobecnosti pamäť zvierat priniesla ľuďom veľa prekvapení a objavov. Nielenže sa dokážu chrániť, ale dokážu si vybudovať aj užšiu dôveru a vzťahy s ľuďmi. Okrem toho zvieratá inšpirovali rôzne experimenty a štúdie, ktoré vedcom pomohli lepšie pochopiť podstatu a mechanizmy pamäti. Poďme teda obdivovať inteligenciu a pamäť zvierat a žasnúť nad ich šikovným a flexibilným mozgom. Je vidieť, že či už ide o človeka alebo zviera, pamäť je veľmi dôležitá. Cistanche môže výrazne zlepšiť našu pamäť, pretože Cistanche je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, z ktorých jedným je zlepšenie pamäte. Účinnosť mletého mäsa pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane karboxylovej kyseliny, polysacharidov, flavonoidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi kanálmi.

Kliknite na krátkodobú pamäť, ako sa zlepšiť

Dostupnosť výkonných genetických nástrojov a zdrojov v Drosophila umožnila vedcom odhaliť mechanizmy, ktorými črevné mikróby ovplyvňujú kondíciu, zdravie a správanie svojich hostiteľov.

Modely Drosophila sa v minulosti vo veľkej miere používali nielen na štúdium správania zvierat (tj dvorenie, agresivita, spánok a učenie a pamäť), ale aj niektorých neurodegeneratívnych chorôb súvisiacich s ľuďmi (tj Alzheimerovej choroby a Parkinsonovej choroby). Tento prehľad komplexne sumarizuje súčasné chápanie črevnej mikroflóry Drosophila a jej vplyvu na správanie múch, fyziológiu a neurodegeneratívne ochorenia.
Kľúčové slová:

Drosophila melanogaster; mikrobiota; črevo-mozog; správanie; učenie a pamäť; neurodegeneratívne ochorenia.

1. Úvod
Ovocná muška Drosophila melanogaster je dôležitým experimentálnym zvieraťom používaným v biomedicínskych štúdiách. Ovocnú mušku prvýkrát použili ako experimentálny organizmus Castle v roku 1901 a Morgan v roku 1909 na genetické štúdie. Keďže Drosophila sa používa ako modelový organizmus už viac ako storočie, bolo vyvinutých niekoľko techník na riešenie špecifických vedeckých otázok.

Drosophila má relatívne krátku životnosť a zložité správanie. Dostupnosť výkonných nástrojov na genetickú manipuláciu v špecifických tkanivách alebo orgánoch umožnila vedcom študovať molekulárne mechanizmy regulujúce správanie drozofily, ako je adaptívna reakcia na okolité prostredie, ako aj vrodené (dvoch, agresivita, spánok atď.) [1 –3] a naučené správanie (čuchová pamäť a pamäť na dvorenie) [4–6].

Za posledných 20 rokov sa Drosophila používala ako ideálny in vivo model na štúdium neurodegeneratívnych chorôb, ako je Alzheimerova choroba (AD) a Parkinsonova choroba (PD) [7,8]. Významné signálne dráhy, ktoré regulujú rast a funkcie neurónov u ľudí, sú konzervované v Drosophila, čo umožňuje použitie tohto modelového organizmu na štúdium ľudských neurodegeneratívnych chorôb.

Napríklad model Drosophila AD vyvinutý ektopickou expresiou ľudského proteínu A 42 v mozgu muchy vykazuje klinické symptómy spojené s pacientmi s AD, ako je porucha krátkodobej pamäte závislá od veku, poruchy učenia, zvýšená bdelosť a prerušovaný spánok [8 ,9]. To naznačuje, že Drosophila môže byť použitá ako ideálny in vivo model na skríning nových liekov na liečbu AD.

Pribúdajúce dôkazy podporujú názor, že dobre vyvážená črevná mikroflóra je nevyhnutná pre ľudské zdravie [10,11]. Zasahovanie do zloženia črevnej mikroflóry môže nepriaznivo ovplyvniť zdravie a fyziológiu hostiteľa, čo vedie k rôznym neurologickým ochoreniam, ako sú abnormality správania, neurodegeneratívne ochorenia a neuropsychiatrické poruchy [12–14].

Štúdie ukázali, že črevné baktérie môžu produkovať niekoľko neurotransmiterov vrátane dopamínu, kyseliny gama-aminomaslovej (GABA) a serotonínu [15]. Okrem toho je obojsmerný presluch medzi črevom a centrálnym nervovým systémom (CNS) sprostredkovaný cez črevnú mikroflóru [16,17]. Nedávne štúdie ukázali, že zmeny v zložení črevnej mikroflóry súvisia s určitými neurologickými ochoreniami [18–20].

Podrobný mechanizmus toho, ako črevné baktérie regulujú progresiu ochorenia ovplyvňovaním komunikácie pozdĺž osi čreva a mozgu, si však vyžaduje ďalšie skúmanie.

Za posledných 20 rokov väčšina štúdií črevnej mikrobioty využívala modely hlodavcov na skúmanie úlohy osi mikrobiota-črevo-mozog. Všestranný organizmus Drosophila je však výkonným výskumným modelom, ktorý umožňuje vedcom skúmať mechanizmy, ktorými črevné mikróby ovplyvňujú mozgové funkcie (obrázok 1a,b). Mikróby môžu byť geneticky označené fluorescenčným proteínom, takže je možné vizualizovať ich distribúciu v tráviacom trakte Drosophila (obrázok 1c) [21,22].

Obrázok 1. Porovnanie tráviaceho traktu človeka a Drosophila. a) Tráviace ústrojenstvo ľudí a Drosophila. Funkčné oblasti tráviaceho traktu u Drosophila a ľudí sú podobné a zahŕňajú pažerák, predné a zadné stredné črevo (tenké črevo), hrubé črevo (zadné črevo) a žalúdok (plodina). (b) Subregióny tráviaceho traktu Drosophila zobrazujúce predné črevo, stredné črevo a zadné črevo.

Predžalúdky obsahujú plodinu a proventrikulus. Stredné črevo sa ďalej delí na oblasti R1-R5. ( c ) Lactobacillus označený GFP bol kŕmený dospelými Drosophila a konfokálne obrázky ukazujú distribúciu Lactobacillus (zelená) v rôznych oblastiach tráviaceho traktu. Zväčšené obrázky orezania, oblastí R2, R4 a R5 sú zobrazené v c1 až c4. Vzorka bola imunofarbená anti-integrín-PS protilátkou (červená). Mierka, 500 µm.

2. Vrodené správanie drozofily
Predpokladá sa, že vrodené správanie je pevne zapojené do mozgu zvieraťa a je geneticky zakódované a nevyžaduje žiadne predchádzajúce skúsenosti na správne vykonanie. Vrodené správanie je vysoko prispôsobiteľné vnútornému stavu zvierat a vonkajšiemu prostrediu, čo umožňuje zvieratám modifikovať svoje správanie podľa rôznych podmienok prostredia [23].

Drosophila je vynikajúci zvierací model na štúdium molekulárnych mechanizmov ľudského vrodeného správania, pretože existujú určité podobnosti vo fenotypoch správania medzi muchami a ľuďmi. U Drosophila sa študovalo rôzne vrodené správanie, ako je párenie, agresívne správanie, spánok/lokomotorická aktivita a správanie súvisiace s teplotou [3,24–28].

Okrem toho je genóm Drosophila približne zo 60 % homológny s ľudským a približne 75 % génov súvisiacich s ľudskými chorobami má homológy aj u múch [29]. Napríklad v spánkovom správaní dopamínová signalizácia reguluje bdelosť nielen u Drosophila, ale aj u ľudí [30]. Tu uvádzame niektoré kľúčové vrodené správanie Drosophila a diskutujeme o ich vzťahu s črevnou mikrobiotou (tabuľka 1).

2.1. Črevná mikrobiota a párenie

Párenie u samcov drozofily zahŕňa sériu krokov: postup smerom k samici (orientácia), prenasledovanie samice (nasledovanie), dotýkanie sa brucha samice (klepanie), jednostranné vysúvanie krídel a vibrácie (spev), olizovanie ženských genitálií, uchopenie. na chrbát samice (pokus o kopuláciu) a konečnú kopuláciu [3,26]. Jeden mucha sa pokúsi spáriť s jednou panenskou samicou a meranie sexuálneho nadšenia samca muchy voči samičke sa nazýva index dvorenia (CI).

CI je čas strávený samcom Drosophila dvorením vydelený celkovým časom experimentu. Dobre známy nervový okruh, ktorý reguluje párenie, sa skladá z neurónov exprimujúcich ovocie (fru). Neuróny exprimujúce fru vrátane primárnych senzorických aferentov a centrálnych interneurónov, ako sú neuróny klastra P1, ktoré spúšťajú dvorenie, môžu tvoriť základnú časť okruhu mužského dvorenia [50].

Najmenej tri štúdie uvádzajú, že črevná mikroflóra neovplyvňuje dvorenie u Drosophila [33,35,51]; treba však poznamenať, že každá štúdia používala rôzne muchy divokého typu a využívala rôzne metódy na generovanie múch bez mikróbov.

Na rozdiel od týchto štúdií Heys a kol. ukázali, že črevná mikroflóra pôsobí proti stratégii premnoženia samcov tým, že mení ženskú sexuálnu signalizáciu, čo vedie k zníženému prenosu spermií od samcov múch [31]. Outbreeding u Drosophila zvyšuje genetickú diverzitu u potomstva, posilňuje imunitnú obranu a môže byť ovplyvnený hostiteľskou mikrobiotou [31,52].

Predchádzajúca štúdia ukázala, že 1- a 3-deň po párení sa vzor génovej expresie v tkanive hlavy muchy zmení, čo ovplyvňuje správanie muchy vrátane správania pri kŕmení, metabolizmu a produkcie vajec (po -párovacie správanie) [53]. Delbare a kol. vykonali rozsiahlu analýzu RNA-seq panenských a spárených axenických/konvenčných múch a uviedli, že u párených samíc sú transkripty zapojené do regulácie reprodukcie a neuronálnych funkcií rôzne bohaté v závislosti od mikrobioty samíc [32].

Okrem toho stav mikroflóry samca ovplyvnil plodnosť konvenčných aj axenických samíc; ovplyvnilo to však transkripčné profily iba u axenických, ale nie u konvenčných samíc.

2.2. Črevná mikrobiota a agresívne správanie

Agresívne správanie, ktoré je široko pozorované v živočíšnej ríši, je rozhodujúce pre prežitie a reprodukciu [54]. U Drosophila agresívne správanie zahŕňa vyhrážanie sa krídlom, boxovanie, poklepávanie prednou nohou, výpady a narážanie hlavou [2,33]. Jia a kol. opísali protokol na analýzu agresívneho správania u múch.

V tomto teste sa dva samce alebo samice muchy (vo veku 5 až 7 dní) umiestnia do bojovej komory, ktorá sa potom rýchlo prikryje skleneným krycím sklíčkom s rozmermi 20 mm x 20 mm. Boj počas 30 minút je snímaný kamerou. Agresívne správanie sa analyzuje spočítaním počtu výpadov u mužov a úderov hlavy u žien a vyhodnotením frekvencie výpadov/latencie boja. Frekvencia výpadov je definovaná ako počet výpadov za minútu po začatí výpadu, zatiaľ čo latencia boja je definovaná ako trvanie medzi začiatkom záznamu a prvým výpadom [33].

Štúdie naznačujú, že agresívne správanie sa koordinuje s vizuálnymi, čuchovými, chuťovými, mechanickosenzorickými a sluchovými vstupmi. Tieto vstupy sa integrujú do tela mozgovej huby (MB), laterálneho rohu a centrálnych komplexných oblastí a nakoniec poháňajú výstupy motora cez svaly krídel a nôh.

Štúdie tiež naznačujú, že neurotransmitery a neuropeptidy, ako je oktopamín, serotonín, dopamín, acetylcholín a neuropeptid F (NPF), tiež hrajú dôležitú úlohu v agresívnom správaní [54].

Nedávne štúdie ukázali, že špecifická črevná mikroflóra je spojená s agresivitou múch. Jia a kol. použili chlórnan sodný a sériu premývacích protokolov na generovanie axenických múch [33].

V porovnaní s konvenčnými muchami (Canton-S) vykazovali axenické muchy menej agresívneho správania medzi samcami, čo naznačuje, že muchy bez mikróbov majú zníženú agresivitu medzi samcami. Okrem toho komenzálne baktérie, ako je Acetobacter, Lactobacilli a Enterococci, podporovali agresívne správanie u axenických múch mikrobiálnou rekolonizáciou. Autori tiež hlásili 73% zníženie hladín oktopamínu u múch bez mikróbov a genetická manipulácia oktopaminergnej neuronálnej aktivity obnovila agresívne správanie u axenických múch.

Rovnaká štúdia tiež uvádza dva kľúčové faktory, ktoré sa podieľajú na regulácii agresie prostredníctvom expresie oktopamínu. Jedným z nich bolo kritické vývojové obdobie počas larválneho štádia (48–98 hodín po znesení vajíčok), v ktorom suplementácia stravou bohatou na kvasinky obnovila agresívne správanie u axenických múch. Ďalším faktorom bola výživa, pretože je tiež dôležitá pre expresiu oktopamínu, a poskytovanie správnej výživy axenickým muchám normalizovalo agresívne správanie.

Tieto zistenia ukazujú, že črevná mikroflóra a výživa počas kritického vývojového obdobia ovplyvňujú expresiu oktopamínu, ktorý reguluje agresivitu u dospelých mužov [33].
2.3. Črevná mikrobiota a spánok a pohybová aktivita
Systém Drosophila Activity Monitor (DAM) sa používa na štúdium spánku a lokomočného správania u múch [55]. V tomto teste sú muchy umiestnené v podmienkach cyklu 12 h svetlo/12 h tma [56,57].

Prístroj DAM má tri hlavné komponenty: (1) sklenenú trubicu, v ktorej sa môže voľne pohybovať jedna mucha, (2) infračervený lúč, ktorý smeruje cez stred sklenenej trubice, a (3) počítač na zaznamenávanie správania. výsledky [55]. V teste spánkového/lokomotorického správania systém DAM zaznamenáva prerušenia infračerveného lúča spôsobené muchami prechádzajúcimi sa v sklenených skúmavkách na detekciu spánku alebo pohybu [58].

Dobre známy okruh súvisiaci so spánkovým správaním v mozgu Drosophila sa skladá z cirkadiánnych neurónov. Svetlo stimuluje skupinu veľkých ventrálno-laterálnych neurónov (l-vLN), ktoré uvoľňujú pigment dispergujúce faktory (PDF), aby stimulovali skupinu malých ventrálno-laterálnych neurónov (s-vLN). Nakoniec s-vLN regulujú riadiace centrum lokomotoriky mozgu, elipsoidné telá, aby inhibovali spánkové správanie.

l-vLN aj s-vLN exprimujú receptory GABAA, ktoré môžu inhibovať bdelosť prostredníctvom GABAergických neurónov podporujúcich spánok. MB je tiež dôležitou oblasťou mozgu, ktorá reguluje spánok prostredníctvom katalytickej podjednotky proteínkinázy A, enzýmu aktivovaného spánkovou cAMP dráhou [59]. Pohybová aktivita je dôležitá pre prežitie Drosophila a je riadená hormónmi, ktoré je možné analyzovať aj pomocou systému DAM. King a spol.

nedávno oznámili prítomnosť peptidergického okruhu, ktorý spája cirkadiánne hodiny s lokomotorickou aktivitou. s-vLN uvoľňujú PDF, ktoré stimulujú DN1 hodinové neuróny, ktoré naopak stimulujú DH44 pozitívne neuróny pars intercerebralis (PI). DH44-pozitívne PI neuróny stimulujú hugin-pozitívne SEZ neuróny, ktoré nakoniec uvoľňujú huginový neuropeptid do motorického okruhu vo ventrálnej nervovej šnúre, ktorá reguluje lokomotorickú aktivitu u Drosophila [60].

Účinok črevnej mikroflóry na spánkové správanie u Drosophila zostáva nejasný. Selkrig a kol. použili izogénny kmeň D. melanogaster Canton-S bez Wolbachie ako muchy divokého typu a vykonali testy spánku a lokomotorického správania. Autori vytvorili muchy bez baktérií Canton-S bez Wolbachie premytím vajec NaClO a prvú generáciu nazvali ako F1 a ďalšiu generáciu ako F2.

Ich údaje odhalili, že ani muchy F1 bez mikróbov, ani muchy F2 bez mikróbov nevykazujú žiadnu významnú zmenu v správaní počas spánku. Navyše, aj keď bezmikrobné muchy F1 nevykazovali žiadnu zmenu v lokomotorickom správaní, bezmikrobné muchy F2 vykazovali mierne zvýšenie lokomotorickej aktivity v porovnaní s konvenčnými muchami [35].

Ďalšia štúdia Silvu a kol. použili Canton-S a W1118 ako muchy divokého typu a použili NaClO na umývanie vajíčok mušiek počas 3–5 minút, aby sa vytvorili axenické muchy [61]. Ich výsledky odhalili, že v porovnaní s konvenčnými muchami mali axenické muchy tendenciu spať dlhšie a vykazovali znížený odraz spánku po deprivácii spánku [34]. Avšak stav črevnej mikroflóry múch mal malý vplyv na cirkadiánnu rytmiku lokomotorickej aktivity.

Silva a spol. a Selkrig a kol. sa zameral na pochopenie úlohy črevnej mikroflóry pri regulácii spánku a pohybu Drosophila. Schretter a kol. navrhli možný mechanizmus na vysvetlenie vzťahu medzi črevnou mikrobiotou a pohybom/spánkom. V tejto štúdii bol kmeň Oregon-R použitý ako divoký typ a muchy dostávali diétu doplnenú antibiotikami, aby vytvorili muchy ošetrené antibiotikami (ABX).

Výsledky ukázali, že muchy ABX zvýšili rýchlosť chôdze, zlepšili denné aktivity a znížili spánok počas dňa. Autori tiež uviedli, že enzým xylózaizomeráza, ktorý katalyzuje reverzibilnú izomerizáciu určitých cukrov prítomných v Lactobacillus brevis, znižuje lokomotorickú aktivitu moduláciou metabolizmu cukrov prostredníctvom stimulácie oktopaminergných neurónov; tento enzým však spánok neovplyvňuje [36].

2.4. Črevná mikrobiota a správanie súvisiace s teplotou

Teplota prostredia silne ovplyvňuje fyziológiu ektotermov, ako je Drosophila. Pre prežitie u Drosophila je dôležité správanie preferencie teploty (muchy sa vyhýbajú horúcemu alebo studenému prostrediu) a tolerancia voči horúcim alebo nízkym teplotám. Test teplotného gradientu sa používa na štúdium preferencie teploty u múch.

Rôzne štúdie používali odlišné zariadenia s teplotným gradientom, ale základný princíp je rovnaký: jedna strana zariadenia má nízku teplotu a druhá strana produkuje vysokú teplotu. Umiestnením hliníkového plechu medzi dve strany sa vytvorí teplotný gradient. Muchy sú umiestnené na hliníkovom plechu a môžu si zvoliť preferovanú teplotu [62,63].

Existujú dva rôzne spôsoby, ako študovať správanie pri vyhýbaní sa teplote: jedným je použitie testu teplotného gradientu (opísaný vyššie) a druhým je použitie testovacieho stroja s dvoma možnosťami výberu.

Testovací stroj s dvomi možnosťami výberu obsahuje štyri kvadranty, ktoré sú vyrobené z termoelektrického chladiaceho čipu a hliníkového plechu. Pri vykonávaní testu vyhýbania sa teplote by testovacie zariadenie s dvoma možnosťami nastavilo konštantnú teplotu (25 ◦C) v jednej sade diagonálnych kvadrantov a ostatné diagonálne kvadranty by sa nastavili na experimentálnu teplotu, ktorá závisí od analýzy [64] .

Zotavenie z chladnej kómy je protokol na štúdium správania tolerancie teploty. V tomto teste sú muchy ponorené do vodného a glykolového kúpeľa nastaveného na -3,5 ◦C (v závislosti od experimentálneho dizajnu) pre chladový stres alebo vystavené teplote 38,5 ◦C (v závislosti od experimentálneho dizajnu) pre tepelný stres, po ktorom nasleduje muchy sa nechajú zotaviť a meria sa čas zotavenia [37,65].

Nedávne štúdie naznačujú, že črevná mikroflóra silne ovplyvňuje teplotnú toleranciu ovocných mušiek. Henry a spol. generovali axenické muchy dechloráciou, pri ktorej boli vajíčka múch ponorené do 2,7 % chlórnanu na 2 minúty, 70 % etanolu na 2 minúty a nakoniec dvakrát premyté v autoklávovanej vode [37]. Po dechlorácii boli muchy chované na autoklávovanom krmive. Ich výsledky naznačujú, že tolerancia chladu axenických múch je v porovnaní s konvenčnými muchami chybná. Tepelná tolerancia však nebola u axenických mušiek ovplyvnená. To naznačuje, že narušenie mikrobioty znižuje schopnosť vyrovnať sa so stresom z chladu [37]. Štúdie na iných druhoch Drosophila, ako je D. subobscura, naznačujú, že bežné muchy sú vystavené miernym tepelným podmienkam (<34 ◦C) exhibit higher thermal tolerance than axenic flies [38].

For more information:1950477648nn@gamil.com