Echinakozid spomaľuje bunkovú starnutie ľudských fibroblastických buniek MRC-5

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Aktívna zložka Cistanche: Ako pôsobí echinakozid proti starnutiu?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

V tejto štúdii sa skúmali účinky echinakozidu, jedného z fenyletanoidov izolovaných zo stoniek Cistanches salsa, tradičného čínskeho bylinného lieku, na pľúcne fibroblastické bunky MRC-5 ľudského embrya. Aktivita bunkovej proliferácie bola hodnotená pomocou Alamar Blue, čo ukazuje, že ošetrenie echinakozidom môže spomaliť starnutie. Výsledky prietokovej cytometrie ukazujú, že echinakozid by mohol spustiť bunky vo fáze G1, aby vstúpili do fázy S a fázy G2, a mohol by zlepšiť degradáciu ROS. Výsledky kométového testu naznačujú, že echinakozid by mohol chrániť bunky pred poškodením DNA, čo čiastočne objasňuje mechanizmus jeho účinkov. Všetky vyššie uvedené výsledky naznačujú, že echinakozid má potenciálnu aktivitu proti starnutiu.

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

1. Úvod

Normálne bunky kultivované in vitro proliferujú na obmedzený počet zdvojnásobení populácie ("Hayflflickov limit") a vstupujú do štádia replikatívnej starnutia. Senescentné bunky podliehajú zastaveniu bunkového rastu vo fáze G1 a zmene morfológie a metabolizmu, vrátane zväčšenia buniek, zvýšenej biogenézy lyzozómov a expresie vyššej aktivity -galaktozidázy pri pH 6 (galaktozidáza spojená so starnutím, SA- - -Gal ) (Hayflflick a Moorhead 1961; Dimri 1995). Hromadenie senescentných buniek predpovedá pokles súvisiaci s vekomtkaniva/organfunkcie. Aby sme sa dostali k spôsobu oddialenia alebo zvrátenia starnutia, snahy o objavenie účinných látok proti starnutiu nikdy neprestali.Echinakozidje jedným z fenyletanoidov izolovaných zo stoniekCistanches salsa, čínsky tradičný bylinný liek, ktorý má potenciálne biologické aktivity, ako antisérum, tak ajproti únavečinidlo (Deng a kol. 2004; Xiong a kol. 1996). Tiež sa uvádza, že sa správa in vitro ako potentná látkazadarmoradikálnymrchožrút(Facino et al. 1995) a exponátyneuroprotektívnečinnostiin vitro a in vivo (Koo a kol. 2005; Geng a kol. 2007). Echinakozid môže byť kandidátom na látku proti starnutiu a aktivita proti starnutiu môže byť jednou z jeho biologických vlastností. Ošetrili sme teda senescentnú líniu pľúcnych fibroblastických buniek ľudského embrya MRC-5 echinakozidom, pričom sme očakávali, že by mohol spomaliť alebo zvrátiť starnutie.

2. Vyšetrovania a výsledky

Najprv sme do kultivačného média pridali echinakozid, aby sme skontrolovali jeho vplyv na rast buniek a bunkové cykly. Pozorovalo sa, že životaschopnosť buniek po 48-hodinovej expozícii echinakozidu sa evidentne zvýšila v porovnaní s kontrolou, keď sa koncentrácia zvýšila (obr. 1A), čo naznačuje, že echinakozid pomáhal senescentným bunkám proliferovať. Výsledok farbenia SA-Gal ukázal, že hladina SA-Gal sa po ošetrení echinakozidom zjavne znížila (údaje nie sú uvedené), čo naznačuje, že časť senescentných buniek bola zvrátená od starnutia. Aby sa potvrdilo, či starnúce bunky boli skutočne poháňané k proliferácii echinakozidom, bola zavedená spoločná cytometria na kontrolu zmeny fázy bunkového cyklu starnúcich buniek MRC-5 po liečbe echinakozidom. V našej štúdii sme pozorovali, že so zvyšujúcou sa koncentráciou echinakozidu sa pomer buniek v období G1 postupne znižoval. Naopak, viac buniek sa dostalo do fázy S a fázy G2 (obr. 1B). Akumulácia heterochromatínových ložísk spojených so starnutím (SAHF) je ďalším špecifickým biomarkerom starnúcich buniek (Shay a Wright 2001). Senescentné bunky vykazovali prerušované ložiská DNA, ktoré boli vizualizované farbením Hoechst (obr. 1C). Naproti tomu bunky MRC{12}} ošetrené echinakozidom mali menej SAHF.

Úroveň reaktívnych foriem kyslíka (ROS) sa zvyšuje, keď sa bunky blížia k Hayflflickovmu limitu (Hutter et al. 2002). Nepretržité ošetrovanie buniek so subletálnymi hladinami ROS nielenže zvyšuje hladinu produktov oxidačného poškodenia, ako je lipofuscín (Sitte et al. 2001), ale spôsobuje aj trvalé zastavenie rastu sprevádzané aktiváciou p53-inhibítora rastu dráha (Toussaint et al. 2000). Preto na bunkovej úrovni hrá ROS kľúčovú úlohu pri indukcii starnutia. Fluorescenčné farbivo FL DCFH-DA sa použilo na meranie obsahu ROS pomocou inej cytometrie. Ukázalo sa, že v porovnaní s kontrolou sa obsah ROS evidentne znížil v bunkách inkubovaných s echinakozidom (obr. 2A). Tieto výsledky tomu nasvedčujúechinakozidmôže pôsobiť ako antioxidant, znižuje produkciu ROS alebo urýchľuje odstraňovanie ROS.

Akumulované reaktívne formy kyslíka (ROS) spôsobujú významné poškodenie makromolekúl v bunkách, vrátane proteínov, DNA a telomér (Kovtun et al. 2007). Oxidačné poškodenie DNA spúšťa zastavenie rastu G1 závislé od p53-, po expresii p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) a starnutie buniek v normálnych ľudských fibroblastoch. Na meranie poškodenia DNA a jeho opravy sme použili kométový test. Veľkosť fragmentov DNA a počet zlomov určujú migráciu a vzor pozorovanej kométy. Obsah DNA chvosta (súčin dĺžky chvosta a obsahu DNA chvosta) sa zvyšuje s poškodením. Naše výsledky ukazujú, že predbežné ošetrenie echinakozidom môže čiastočne podporiť opravu poškodenia DNA, prinajmenšom chrániť bunky pred léziami DNA spôsobenými H2O2 (obr. 2B). Na základe týchto faktov sme dospeli k záveru, že echinakozid má anti-senescenčnú aktivitu aspoň v bunkách MRC{12}}. Výsledky našej štúdie ukazujú, že echinakozid môže znižovať akumuláciu ROS, chrániť bunky pred poškodením DNA, podporovať bunky MRC-5 z fázy G1 do fázy S a G2, a tak zlepšiť proliferáciu buniek. Vo všeobecnosti možno účinky echinakozidu na bunky MRC{16}} rozdeliť na dva aspekty: na podporu bunkovej proliferácie a na zníženie akumulácie ROS. Hoci presný mechanizmus starnutia buniek je stále neznámy a sieť regulácie bunkového cyklu zostáva kontroverzná, preukázali sme, že echinakozid môže chrániť bunky pred oxidačným poškodením. Preto o tom špekulujemeechinakozidmôže byť dobrým kandidátom na reguláciu starnutia, aj keď presný základný mechanizmus zostáva otvorenou otázkou a prebiehajú ďalšie štúdie.

3. Experimentálne

3.1. Bunková kultúra a liečba

Ľudská embryonálna pľúcna fibroblastická bunková línia MRC{{0}}} (Ústav biochémie a bunkovej biológie, SIBS, CAS) bola udržiavaná v modifikovanom minimálnom esenciálnom médiu (Gibco/BRL) a doplnená 10 percentným fetálnym hovädzím sérom. Bunky MRC-5 podliehajú replikatívnej starnutiu po viacerých pasážach buniek, čo sa hodnotí spomalením metabolizmu a zastavením delenia do 7 dní. Všetky kultúry sa naočkovali pri bunkovej hustote 104/cm2, pokiaľ nie je uvedené inak, a nechali sa nerušene proliferovať 7 dní. Rôzne koncentrácie echinakozidu sa pridali 48 hodín pred vyšetrením s rozpúšťadlom ako kontrolou, pokiaľ nie je uvedené inak. Koncentrácia DMSO v kultúrach bola nižšia ako 0,3 percenta (v/v). Na ošetrenie H202 boli bunky indukované 250 M H202 počas 12 hodín.

3.2. Test miery prežitia

Bunky boli kultivované a ošetrené echinakozidom na 96-jamkových platniach. Pred detekciou sa do média pridalo 10 percent Alamar BlueTM a inkubovalo sa 4 hodiny. Absorbancia sa merala spektrofotometrom.

3.3. Analýza prietokovou cytometriou

Prietoková cytometria bola zavedená na meranie obsahu DNA a intracelulárnych hladín ROS s použitím propídiumjodidu a DCFH-DA, v danom poradí. Bunky boli nanesené v hustote 105 buniek/10 ml bunkového roztoku na misky s priemerom 100 mm a doplnené echinakozidom počas 48 hodín po nasadení buniek. Po 48 hodinách ošetrenia sa bunky zozbierali a premyli v PBS po centrifugácii, potom sa resuspendovali v roztoku PBS s 0,1 percentami RNázy a 50 g/ml propídiumjodidu alebo kultivačného média obsahujúceho 10 M DCFH-DA počas 30 minút. Obsah DNA alebo ROS sa potom určil triedením buniek aktivovaným fluorescenciou FL na systéme Beckman Coulter Flow Cytometry System. Údaje boli analyzované softvérom MultiCycle.

3.4. Farbenie Hoechst

Bunky boli kultivované a ošetrené echinakozidom počas 48 hodín na 96-jamkovej platni. Médium sa odstránilo, bunky sa premyli PBS, potom sa fixovali 4 percentným formaldehydom v PBS počas 20 minút, potom sa raz premyli PBS a farbili sa farbivom Hoechst počas 10 minút. Boli zachytené obrázky.

3.5. Jednobunková gélová elektroforéza (kométový test)

Kométový test sa uskutočnil tak, ako bolo uvedené (Olive a Banath 2006). Jednotlivé snímky komét boli analyzované softvérom CometScore. Poďakovanie: Táto práca bola finančne podporená Národným programom základného výskumu (Projekt 973) Číny (č. 2007CB507406), Čínskou národnou nadáciou pre prírodné vedy (č. 30572341) a Fondom lekárskych vied Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008 ).