Cistanche: Echinacozid potláča rast buniek pankreasu adenokarcinómu vyvolaním apoptózy prostredníctvom mitogénom aktivovanej proteínovej kinázovej dráhy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG a XINFENG LI

Abstraktný.

Klinická aplikácia prírodných produktov odvodených z tradičnej čínskej medicíny získala pozornosť v chemoterapeutike rakoviny.Echinacozid(ECH), jeden z fenyletanoidov, izolovaný od stoniekCistanche(čínska bylinná medicína) má ochranné a anti-apoptotické účinky na centrálny nervový systém. Zostáva však do značnej miery nepolapiteľné, či ECH má nádorovú supresívnu aktivitu. V súčasnej štúdii sa preukázalo, že ECH môže výrazne inhibovať proliferáciu buniek pankreatického adenokarcinómu tým, že navodzuje produkciu reaktívnych druhov kyslíka a narúša potenciál mitochondriálnej membrány a tým spúšťa apoptózu. Okrem toho bolo objasnené, že ECH(Echinacozid)potláča rast nádorových buniek prostredníctvom modulácie aktivity MAPK. Na záver, táto štúdia odhaľuje novú funkciu ECH (Echinacozid) pri prevencii vzniku rakoviny a znamená, že použitie ECH by mohlo byť potenciálnou chemoterapeutickou stratégiou pre rakovinu.

Zavedenie

P53 tumor supresor dráha prostredníctvom indukcie nádoru supresor, ARF zmierňuje onkogénne E3-ligáza myš dvojminút (MDM)2-sprostredkovaná degradácia p53 (3). Jedná sa o autoreguláciu, sebaochranný mechanizmus, ktorý zabraňuje bunkám pred malígnou transformáciou. P53 môže potláčať aktivitu Myc transkripciou, napríklad aktiváciou miR-145, ktorá sa zameriava naMycmRNA na umlčanie prekladu (4,5), čím sa vytvorí regulačná slučka negatívnej spätnej väzby.

Najpriamejšou a najúčinnejšou stratégiou liečby rakoviny je zabiť rakovinové bunky. Ukázalo sa, že bežne používané protirakovinové lieky, ako je cisplatina (6), aktinomycín D (7) a adriamycín (8), inhibujú rast nádoru podporou apoptózy. V poslednej dobe rastúce dôkazy preukázali, že množstvo prírodných produktov a derivátov z rastlín, najmä z liečivých rastlín používaných v tradičnej čínskej medicíne (TCM), vykazuje supresívnu funkciu nádoru tým, že navodzuje apoptózu rakovinových buniek a má potenciál pre klinickú aplikáciu v liečbe rakoviny (9). Napríklad prírodný antrachinón emodin je izolovaný z mnohých typov rakovinových buniek (10,11). Camptothecin, odvodený z čínskeho "šťastného stromu",Camptotheca acuminate, je cenný prírodný produkt, ktorý inhibuje ligáciu DNA po zlomoch vlákien sprostredkovaných topo I (12). V ďalšej retrospektívnej kohortnej štúdii založenej na populácii s celkovým počtom 729 pacientov s pokročilým karcinómom prsníka sa navrhlo, že liečba TCM môže prispieť k liečbe rakoviny. Z tejto kohorty bolo 115 pacientov užívateľmi TCM, zatiaľ čo 614 pacientov nepoužívalo TCM. Multivariátová analýza preukázala, že v porovnaní s neužívateľom bolo použitie TCM spojené s výrazne zníženým rizikom úmrtnosti zo všetkých príčin (13). Všetky vyššie uvedené zistenia naznačujú, že TCM je dôležitou doplnkovou a alternatívnou medicínou, ktorá sa môže použiť pri liečbe rakoviny.

myši s akútnym poranením pľúc (16,17). Tiež ECH(Echinacozid)bolo preukázané, že majú ochranné účinky na nervové tkanivo a zlepšujú poruchy správania u murínových modelov Parkinsonovej choroby (18). Zistilo sa, že ECH podporuje proliferáciu buniek a inhibuje apoptózu v črevných epiteliálnych bunkách MODE-K myší (19). Doteraz sa však menej pozornosti venovalo potenciálnej úlohe ECH v prevencii rakoviny.

V tejto štúdii sa skúmalo, či liečba ECH ovplyvňuje rast a proliferáciu nádorových buniek a či ECH(Echinacozid)indukuje apoptózu, zvyšuje produkciu reaktívnych druhov kyslíka (ROS) a znižuje potenciál mitochondriálnej membrány (MMP) a následne potláča rast nádorových buniek. Okrem toho sa táto štúdia zamerala na identifikáciu molekulárnych mechanizmov zodpovedných za inhibíciu rastu buniek sprostredkovanú ECH.

Materiály a metódy

Bunka linka Činidla a protilátky.SW1990 bunky pankreatického adenokarcinómu (ATCC, Manassas, VA, USA) boli kultivované v dulbecco modifikovanom orlovom médiu doplnenom o 10% sérum hovädzieho dobytka plodu, 50 U/ml penicilínu a 0,1 mg/ml streptomycínu pri teplote 37°C v 5% CO2 zvlhčenej atmosfére. ECH(Echinacozid)bol zakúpený od spoločnosti Jrdun Biotechnology Corp (Šanghaj, Čína). Protilátky proti AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 a GAPDH boli zakúpené od spoločnosti Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); anti-Bax a anti-Bcl-2 boli zakúpené od spoločnosti Santa Cruz Biotechnology Inc. a anti-Caspase-3 bol zakúpený z Abcamu (Šanghaj, Čína).

Bunka životaschopnosťTest. Na posúdenie rýchlosti rastu nádorových buniek sada počítania buniek-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) bol použitý podľa pokynov výrobcu. Bunkové suspenzie boli nasadené v 5 000 bunkách na jamku s liečbou ECH na 0, 12, 24, 48 alebo 72 h v 96 -studni kultivačných dosiek. Inhibícia rastu buniek bola stanovená pridaním činidla WST-8 zo súpravy CCK-8 v konečnej koncentrácii 10% do každej jamky a absorbancia vzoriek sa merala pri 450 nm pomocou čítačky mikroplatňov (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 Farbenie.Bunky (60% sútoku) boli ošetrené Hoechstom 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Čína) v konečnej koncentrácii 1µg/ml, inkubované v inkubátore pri teplote 37°C po dobu 15 minút, dvakrát umyté fyziologickým roztokom tlmeným fosfátom, upevnené v 4% paraformaldehyde na 30 minút pri izbovej teplote a namontované na sklíčka. Morfologické zmeny bunkových jadier boli pozorované pod fluorescenčným mikroskopom (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Normálne jadrá boli okrúhle a zafarbené svetlo modrou farbou, zatiaľ čo apoptotické jadrá boli scvrknuté a zafarbené jasne modrou farbou.

Fluorescencia aktivovaná bunka triedenie (FACS) Analýzy.Na posúdenie apoptózy sa podľa pokynov výrobcu použila súprava na detekciu fluoresceínu izotiokyanátu (FITC)-Annexin V (BD Biosciences, Šanghaj, Čína). Stručne povedané, bunky 5x104 boli umyté ľadovo studeným PBS, resuspendované v 0,1 ml viažucom tlmivom roztoku (Beyotime Institute of Biotechnology) a zafarbené 10 ml fitc-konjugovaného prílohínu V (10 mg/ml) a 10 ml propidium jodidu (PI) (50 mg/ml). Po inkubácii počas 15 minút pri izbovej teplote v tme a pridaní 400 ml viažuceho tlmivého roztoku boli bunky analyzované prietokovým cytometrom (C6; BD Biosciences, Šanghaj, Čína).

Meranie od reaktívny kyslík druh (ROS).Na vyhodnotenie výroby ROS bola použitá súprava na testovanie reaktívnych druhov kyslíka (Vigorous Biotechnology, Peking, Čína) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, bunky (80% sútoku) boli zozbierané a premyté PBS pred farbením roztokom dihydroethidium (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). Bunky boli potom analyzované prietokovými cytometrickými analýzami.

Meranie od Mitochondriálnej membrána potenciálny (MMP).

Na detekciu zmien v MMP bola použitá súprava tetrametylrhodamínu metyl esteru (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA). Stručne povedané, bunky (80% sútoku) boli zozbierané, umyté PBS a zafarbené TMRM po dobu 15-20 minút v inkubátore s teplotou 37 °C. Bunky sa potom raz umyli PBS a podrobili sa prietokovým cytometrickým analýzam.

ImunoblottingAnalýzy. Bunky (80% sútok) boli zozbierané a lyžované v ripa buffere (Jrdun Biotechnology) pozostávajúcom z 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% kyselina deoxycholová sodná a 0,1% SDS a čerstvo pridané inhibítory proteazómu. Na imunoblottingovú analýzu sa použili rovnaké množstvá číreho bunkového lyzátu, ako bolo opísané predtým (20).

Štatistický analýza.Kvantitatívne údaje sú vyjadrené ako stredná ± smerodajnej odchýlky. Štatistické rozdiely boli vyhodnotené nepárovým študentským t-testom pomocou štatistického softvéru SPSS 15.0. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Výsledky

ECH (Echinacozid)Potláča nádor bunkarast. Aj keď sa uvádza, že ECH(Echinacozid)vykazuje ochrannú úlohu inhibíciou apoptózy a zápalových signálov v somatických bunkách, ako sú neurónové a črevné epiteliálne bunky (16-19), zostáva nepolapiteľné, či ECH riadi rast a proliferáciu rakovinových buniek. Na testovanie sa test prežitia buniek vykonala liečbou buniek SW1990, odvodených z pankreatického adenokarcinómu II. stupňa, titrovanými dávkami ECH, ako je znázornené na obr. Predovšetkým sa preukázalo, že ECH významne spomaľuje proliferáciu nádorových buniek spôsobom závislým od dávky počas 5-dňového obdobia kultúry (obr. 1).ECH Spúšťaapoptóza. Keďže strata apoptózy je jedným z hlavných príčinných mechanizmov, ktoré sú základom nekontrolovanej proliferácie buniek rakoviny pankreasu (21), súčasná štúdia vykonala súbor experimentov na určenie, či ECH spúšťa apoptózu. Po prvé, zafarbením jadier nádorových buniek Hoechstom 33342 sa preukázalo, že ECH vedie k apoptóze spôsobom závislým od dávky (obr. 2A). Okrem toho sa vykonali analýzy FACS s použitím zafarbenia v prílohy V/PI, aby sa ďalej potvrdil apoptotický účinok ty ECH (obr. 2B). Priemerné percento apoptotických buniek bolo 1,1% za normálnych kultúrnych podmienok, zatiaľ čo toto percento sa výrazne zvýšilo na 10, 6, 21, 4 a 51, 3% v reakcii na liečbu ECH spôsobom závislým od dávky (obr. 2C). Tieto výsledky spolu s testom životaschopnosti buniek preukázaným na obr. 1 ukazujú, že liečba ECH potláča proliferáciu nádorových buniek spustením apoptózy.

generovanie etídia, ktoré sa prelína s DNA, bolo použité v tejto štúdii na vyhodnotenie produkcie ROS. Zistilo sa, že podobne ako iné protirakovinové lieky, aj ECH stimuluje produkciu ROS spôsobom závislým od dávky, čo dokazuje zvýšená intenzita fluorescencie pri liečbe ECH (obr. 3).

ECH (Echinacozid)Znižuje MMP.Ukázalo sa, že mitochondriálna dysfunkcia sa podieľa na indukcii apoptózy. Ukázalo sa, že otvorenie prechodových pórov mitochondriálnej priepustnosti indukuje depolarizáciu transmembránového potenciálu a uvoľňovanie pro-apoptotických faktorov (23). Preto sa testovalo, či ECH môže vyvolať stratu MMP v nádorových bunkách vykonaním testu TMRM, čo je dobre zavedený prístup, pretože intenzita fluorescencie TMRM je úmerná membránovému potenciálu. Preukázalo sa, že liečba ECH významne znižuje MMP spôsobom závislým od dávky (obr. 4).ECH Ovládacie prvky nádor bunka rast cez Proteín aktivovaný mitogénomskúmal sa molekulárny základ smrti nádorových buniek sprostredkovaných ECH, aktivita niekoľkých životne dôležitých signálnych dráh, ako sú MAPK a AKT (24,25), ktoré kontrolujú prežitie buniek a smrť. MAPK sú evolučne konzervované, prolínom riadené proteínové kinázy Ser / Thr, vrátane extracelulárnych signálom regulovaných kinázy (ERK), c-Jun NH2-terminálnej kinázy (JNK) a členov rodiny p38, ktorí sa aktivujú prostredníctvom trojstupňových kaskád signalizácie kinázy (26,27). V tejto štúdii sa hodnotila expresia MAPK a AKT, ako aj ich aktivované fosforylované formy a zistilo sa, že ECH výrazne potláča aktivitu JNK a ERK1/2, ale zvyšuje aktivitu p38 (obr. 5). Predovšetkým sa preukázalo, že aktivita AKT, ktorá je kriticky dôležitá aj pre proliferáciu buniek, nie je ovplyvnená liečbou ECH (obr. 5). Okrem toho sa ukázalo, že liečba ECH zvyšuje expresiu Baxu a Kaspázy-3 a zároveň znižuje expresiu Bcl-2 (obr. 5), čo je v súlade s obr. 2. Výsledky teda naznačujú, že ECH spúšťa apoptózu nádorových buniek prostredníctvom dráhy MAPK.

Diskusia

Podľa našich najlepších vedomostí je to prvá štúdia, ktorá ukazuje, že ECH má nádorovo supresívnu funkciu spustením apoptózy (obr. 2), podporou produkcie ROS (obr. 3) a vyvolaním depolarizácie potenciálu mitochondriálnej membrány (obr. 4), čo následne vedie k inhibícii rastu nádorových buniek (obr. 1). Okrem toho sa ukázalo, že molekulárny základ smrti nádorových buniek sprostredkovaných ECH sa vyskytuje reguláciou signálnych dráh MAPK (obr. 5). Tieto zistenia demonštrujú novú funkciu ECH pri prevencii tumorigenézy, a preto naznačujú, že môže byť kandidátskym prostriedkom na liečbu rakoviny.

Väčšina protirakovinových liekov môže vyvolať apoptózu nádorových buniek, senescenciu a / alebo zastavenie bunkového cyklu, čo vedie k inhibícii rastu a proliferácie nádorových buniek. Zastavenie bunkového cyklu je bunková reakcia na mierne stresové signály, ktoré umožňujú bunkám opraviť poškodenú DNA pred začatím replikačnej syntézy DNA alebo mitózy, zatiaľ čo apoptóza a senescencia (zastavenie trvalého bunkového cyklu) sa vyskytujú v reakcii na stresové signály, ktoré eliminujú nenapraviteľné alebo malígne bunky (28,29). Preto sa v tejto štúdii hodnotil iba apoptotický účinok ECH na nádorové bunky, pretože zabíjanie rakovinových buniek je hlavným kritériom hodnotenia účinnosti protirakovinového činidla. Predovšetkým sa preukázalo, že ECH vyvoláva vyjadrenieBax(Obr. 5), pro-apoptotický gén, transkripčne aktivovaný nádorovým supresorom p53 (30). Preto stojí za to otestovať, či ECH dokáže aktivovať signálnu dráhu p53. Ak áno, ECH môže byť tiež schopný vyvolať zástavu bunkového cyklu závislého od P53, senescenciu, apoptózu alebo autofágiu. V tejto štúdii bola objasnená nádorovo supresívna funkcia ECH v bunkovej línii adenokarcinómu pankreasu SW1990. Sú však potrebné ďalšie štúdie pozorujúce viac bunkových línií rakoviny pankreasu. Ukázalo sa, že mutácie v onkogénnej bielkovine RAS a nádorovom supresore p53 sú spojené s rozvojom rakoviny pankreasu (31); bunková línia SW1990 však podľa databázy IARC p53 (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx) neprechováva žiadnu mutáciu p53. Preto je dôležité preskúmať, či ECH môže ovplyvniť rast a proliferáciu iných bunkových línií rakoviny pankreasu s rôznymi mutáciami p53. Okrem toho by bolo zaujímavé určiť, či je ECH schopný podporovať apoptózu a inhibovať rast iných typov nádorov.

Ukázalo sa, že zvýšenie ROS a zníženie MMP, ktoré boli spôsobené liečbou ECH, sú nevyhnutné pri indukcii apoptózy (22). Okrem toho sa zistilo, že ROS môže vyvolať oxidáciu mitochondriálnych pórov, čo prispieva k uvoľňovaniu cytochrómu.c, medziprodukt v apoptóze v dôsledku narušenia MMP (22). Zostáva teda určiť, či ECH nepriamo naruší MMP prostredníctvom indukcie ROS. Okrem toho sa ukázalo, že oxidačný stres vyvolaný ROS sa podieľa aj na modulácii nespočetného množstva signálov na kontrolu rastu buniek vrátane p53, NF-κB, HIF a PI3K (32). Zostáva určiť, či a ak áno, ako ECH reguluje tieto dôležité signálne dráhy. Oxidačný stres spôsobuje rôzne neurodegeneratívne ochorenia v dôsledku vysokej spotreby kyslíka, slabých antioxidačných systémov a terminálno-diferenciačných charakteristík centrálneho nervového systému (33). Niekoľko štúdií však ukázalo, že ECH má ochranné a anti-apoptotické účinky na nervové tkanivo. V tejto súvislosti je rozumné predpokladať, že ECH môže znížiť produkciu ROS v terminálne diferencovaných nervových bunkách. Preto je tiež potrebné určiť, či regulácia produkcie ROS spoločnosťou ECH závisí od stavu diferenciácie buniek. Preto súčasné výsledky spolu s ďalšími štúdiami ukazujú, že ECH, široko používaný TCM, môže byť dôležitou chemoterapeutickou stratégiou nielen na liečbu neurodegeneratívnych ochorení, ale aj malígnych karcinómov.

V poslednej dobe si používanie TCM v liečbe rakoviny získalo čoraz väčšiu pozornosť. Potenciál prírodných produktov z liečivých rastlín používaných v TCM bol uznaný vedeckou komunitou aj v západnom svete (9). Je potrebné vyvinúť úsilie na objasnenie základných mechanizmov účinku týchto prírodných produktov, čo môže nakoniec viesť k vývoju účinných a bezpečných liekov na liečbu rakoviny.

Na záver, súčasná štúdia preukázala inhibičnú funkciu nádoru ECH a tiež rozpracováva molekulárny základ potlačenia nádoru sprostredkovaného ECH, čím naznačuje potenciálnu klinickú aplikáciu ECH v liečbe rakoviny.

Poďakovanie

Táto štúdia bola financovaná a podporená z Kľúčového programu vedeckého výskumu FMU (grant č. 09ZD014). Autori by sa chceli poďakovať spoločnosti Biomedworld (Šanghaj, Čína) za pomoc pri úprave rukopisu.

Referencie

1. Hanahan D a Weinberg RA: Znaky rakoviny: Ďalšia generácia. Bunka 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Prepis: Transkripčné účinky MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ a Roussel MF: Signalizácia Myc prostredníctvom supresora nádoru ARF reguluje apoptózu a zvečnenie závislú od p53. Gény Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K a Mo YY: p53 potláča c-Myc prostredníctvom indukcie nádorového supresora miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X a Lu H: Nové poznatky o funkciách p53 prostredníctvom cieľových mikroRNA. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB a Lippard SJ: Oprava cisplatiny a DNA pri chemoterapii rakoviny. Trendy Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H a Korc M: Actinomycín D indukuje apoptózu a inhibuje rast buniek rakoviny pankreasu. Int J Rak 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P a Dass CR: Doxorubicín: Aktualizácia protirakovinového molekulárneho účinku, toxicity a nových systémov podávania liekov. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS a Kaina B: Od tradičnej čínskej medicíny k racionálnej liečbe rakoviny. Trendy Mol Med 13: 353-361, 2007.