Účinok fenyletanolových glykozidov na transformujúci rastový faktor – signálna dráha P1/Smads v ľudských hypertrofických jazvových fibroblastoch

Účinok fenyletanoidových glykozidov na transformujúci rastový faktor – signálna dráha p1/Smads vo fibroblastoch ľudskej hypertrofickej jazvy

Ďalšie informácie:{0}}

[Abstrakt]Cieľ Na základe signálnej dráhy transformujúceho rastového faktora - pl (TGF - pl)/Smads skúmať účinkyfenyletanoidové glykozidyodcistanche tubulosa(CPhGs) na ľudských hypertrofických jazvových fibroblastoch (HSFbs) a možný mechanizmus. Metódy Od marca do júna 2019 bolo prijatých 9 pacientov s hypertrofickou jazvou po popálenine. Fibroblasty boli izolované z hypertrofickej jazvy a kultivované. Ľudské hypertrofické jazvy boli odstránené a fibroblasty boli kultivované in vitro. Bola vytvorená slepá skupina, modelová skupina, pozitívna kontrolná skupina (TGF-pl plus 5 -fluóruracil) a experimentálna skupina (TGF-pl plus CPhGs). Účinkyfenyletanoidové glykozidyodcistanche tubulosav rôznych koncentráciách na proliferáciu HSFb boli detegované pomocou testu súpravy na počítanie buniek {{0}} (CCK - 8). Expresia mRNA Smad2, Smad3, Smad7, kolagénu I (COL -1) a kolagénu HI (COL -3) bola detegovaná kvantitatívnou reverznou transkriptázou - polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase (RT - qPCR) v každá skupina. Expresia proteínov Smad2, Smad3, fosforylovaných proteínov Smad2 (p - Smad2), fosforylovaných proteínov Smad3 (p - Smad3), Smad7, COL -1 a COL {{20}} bola detegovaná metódou Western blotting. Namerané údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (priemer ± SD). Viaceré skupiny sa porovnávali pomocou jednosmernej ANOVA. Výsledky Miera inhibície fibroblastov po ošetrení CPhG pri 60, 90 a 120 mg/l počas 48 hodín bola (36,87 ±0,06) percent vs. (43,52 ±0,04) percent vs. (78,11 ±0,03) percent , hodnota F =45,070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="" <="" 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

{{0}}.04 ± 0.04, hodnota F=14,780, P < {{21="" }}.05);="" výsledky="" western="" blotting="" ukázali,="" že="" proteínová="" expresia="" p-smad2="" a="" p-smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3,="" v="" experimentálnej="" skupine="" a="" pozitívnej="" kontrolnej="" skupine="" bola="" významne="" nižšia="" ako="" v="" modelovej="" skupine,="" a="" expresia="" proteínu="" smad7="" bola="" výrazne="" vyššia="" ako="" v="" modelovej="" skupine="" (0.="" 16="" ±="" 0.03="" vs.="" 0,="" 11="" ±="" 0,02="" vs.="" 0,06="" ±="" 0.{{{{101}="" 26}}),="" (0,12="" ±="" 0,02="">

{{0}}.07 ± 0.{{10}}1 vs. 0.04 ±{ {18}}.{{20}}1, hodnota F =7,670, P < 0,05), (0,12 ±0,03 vs. 0,15 ±0,06 vs. 0,23 土 0,05, hodnota F { {24}}.936, P<0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="" <="" 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[Kľúčové slová] Fenyletanoidové glykozidyodcistanche tubulosa; fibroblasty hypertrofickej jazvy; Transformujúci rastový faktor - signálna dráha pl/Smads

Kliknite pre produkty cistanche deserticola ma a Cistanche

Hypertrofické zjazvenie (HS) je fibrotické ochorenie kože charakterizované nadmernou proliferáciou fibroblastov (FBS), ako aj ukladaním extracelulárnej matrice (ECM), ktoré sú hlavnými bunkami umožňujúcimi tvorbu jaziev, môžu vylučovať veľké množstvo kolagénu a s tvorbou HS úzko súvisí transformujúci rastový faktor (TGF) - P / Smads signálna dráha.Cistancheje tradičná tonizujúca tradičná čínska medicína, ktorej extrakt fenyletanoid kyselina octová total (cphgs) je jednou z hlavných zložiek s liečivými účinkami a s rôznymi biologickými funkciami, ako sú protizápalové, protinádorové, protiradiačné, pohlcujúce voľné radikály atď. štúdie ukázali, že cphgs môže inhibovať proliferáciu pečeňových hviezdicových buniek a že to môže urobiť znížením expresie Smad2, Smad3, zvýšením expresie Smad7, čím sa zablokuje transdukcia signálnej dráhy tgf-p/Smads a potom sa oneskorí progresia fibrózy pečene. Cieľom tejto štúdie bolo sledovať účinky na expresiu génov a proteínov súvisiacich s ľudskými hypertrofickými jazvovými fibroblastmi (hsfbs) na základe signálnej dráhy TGF PL / Smad.

Materiály a metódy

1. Materiály:Cistanchecphgs boli zakúpené od hechen pharmaceutical biotech Co., Ltd., Hetian, Čína; Fetálne hovädzie sérum bolo zakúpené od Clark Bioscience, USA; Súprava na počítanie buniek TGF PL bola zakúpená od pepro tech, USA; Fluorescenčná kvantitatívna PCR súprava bola zakúpená od Takara Corporation, Japonsko; Všetky súpravy na reverznú transkripciu boli zakúpené od Thermo Fisher Scientific, USA; Protilátky Smad2/3, p-Smad2/3 boli zakúpené od spoločnosti cell signaling technology, USA; Protilátky proti Smad7, COL-1, COL-3, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáze (gap-dh) boli zakúpené od spoločnosti abeam (UK); Polyvinylidénfluoridové (PVDF) membrány boli zakúpené od millipore, USA.

2. Všetky prípady boli vybrané z oddelenia ortopédie, First Affiliate Hospital of Xinjiang Medical University, a tri vzorky (všetky boli patológiou definitívne diagnostikované ako hypertrofická jazva) boli náhodne vybrané na primárnu kultiváciu FBS; Tento experiment schválila lekárska etická komisia Prvej pridruženej nemocnice lekárskej univerzity Xinjiang (číslo schválenia 20170214-71) a od pacientov a ich rodín sa získal informovaný súhlas.

3. Cell grouping: randomly divided into blank group; Model group: 5 |ug / L TGF - & 1; Positive control: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Experimental group: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >120 mg/l) cphgso.

4. Bunková proliferácia sa určila pomocou súpravy na počítanie buniek (CCK{1}}): odobrali sa hsfbs v logaritmickej rastovej fáze, bunky z každej skupiny sa ošetrili podľa plánu a hodnota absorbancie každej jamky každej skupiny sa monitorovala postupne pri 450 nm vlnová dĺžka s použitím čítačky mikrodoštičiek pri 24, 48 a 72 hodinách.

5. Detekcia expresie mRNA pomocou RT qPCR: hsfbs z každej skupiny sa zhromaždili po 48 hodinách zásahu, extrahovala sa RNA a určilo sa množstvo expresie mRNA.

6. Expresia proteínu bola stanovená analýzou Western blot. Celkový bunkový proteín sa extrahoval 48 hodín po ošetrení z každej skupiny na detekciu expresie každého proteínu.

7. Štatistické metódy: na analýzu bol použitý štatistický softvér SPSS 22.0 a namerané údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (priemer ± SD) a na porovnanie medzi viac skupín a P < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.

Výsledky

Výsledky bunkovej proliferácie ukázali, že 60, 9{{10}} a 120 mg/l cphg počas 48 hodín na fibroblastoch, miera inhibície bola [(36,87 ±0,06) percent : (43,52 ±0,04) percent :(78,11 ±0,03) percent ,F=45,073,P< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

Porovnanie expresie CoL-I, COL-3, Smad2 a Smad3 mRNA v každej skupine: v porovnaní s modelovou skupinou mohli pozitívne kontrolné aj experimentálne skupiny znížiť CoL-I, COL{{ 6}}, expresiu mRNA Smad2 a Smad3 a podporujú expresiu mRNA Smad7 so štatisticky významnými rozdielmi. (1,56 ±0.01:0. 30 ± 0,25 : 0,21 ±0,04,F=39. 755, P<0.01; 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01;="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ;2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ;0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

Porovnanie p-Smad2, p-smad3, col-l, COL-3 v každej skupine: v porovnaní s prázdnou skupinou sa proteínová expresia p-Smad2, col-l v modelovej skupine zvýšila, zatiaľ čo expresia Smad7 sa znížil; V porovnaní s modelovou skupinou mohla pozitívna kontrolná skupina downregulovať proteínovú expresiu p-smad3, COL-1, COL{13}} a experimentálna skupina preukázala inhibičný účinok na zvýšenú proteínovú expresiu p- Smad2, p-smad3, stĺpec - 3. Expresia COL-3 bola inhibovaná v rôznych stupňoch, zatiaľ čo expresia Smad7 bola v týchto dvoch skupinách relatívne zvýšená a hodnoty expresie proteínu p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL{{27 }} v prázdnej skupine, pozitívnej kontrolnej skupine a experimentálnej skupine boli (0.{{30}}9 ±0.04,{ {38}}.16 ±{{40}}.03,0.11 ± 0.{{50}}2 ,0.06 ± 0.00),(0,07 ±0,03,0,12 ± 0,02,0,07 ± 0,01,0,04 ±0,01,F { {60}}. 670, str<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05,="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01),(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02,="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

Diskusia

HS je nevyhnutným výsledkom reparácie tkaniva a mechanizmus jej vzniku, najmä hyperproliferácia FBS, nedostatočná degradácia a pod., vedie k vzniku a rozvoju HS. Tgf-p1 je široko zapojený do bunkovej, tkanivovej abnormálnej proliferácie a diferenciačných ochorení a pokračuje počas hojenia rán; Svoje účinky uplatňuje najmä prostredníctvom signálnej dráhy tgf-p/Smads, v ktorej fosforylácia proteínov Smad2/3 vedie k zvýšenej expresii intracelulárnych a extracelulárnych fibrogénnych proteínov, podporuje produkciu kolagénu a urýchľuje progresiu fibrózy; Smad7 ako negatívny regulátor môže zabrániť tejto ceste prostredníctvom interakcie s aktivovanými receptormi tgf-p1, čím sa zníži syntéza kolagénových vlákien; Takže buď zvýšenie expresie Smad7 alebo inhibícia expresie Smad2/3 môže zabrániť vzniku hypertrofickej jazvy.

Táto štúdia aplikovala Cistanche cphgs na HS, kožné fibrotické ochorenie, a zistila, že rôzne dávky cphgs inhibovali proliferáciu hsfbs indukovanú tgf-p1; Okrem toho 90m & / L cphgs inhibovali signalizáciu dráhy podporovaním expresie Smad7 a znížením expresie Smad2 / 3 na úrovni génovej aj proteínovej expresie a znižovali produkciu CoL-I, COL-3, čo zase inhibovalo progresiu HS. Naše výsledky potvrdili, že cphgs inhibovali produkciu kolagénu tým, že zasahovali do expresie proteínov súvisiacich so signálnou dráhou tgf-p / Smads pri stimulácii tgf-p1. Výsledky tejto štúdie ukázali, že Cistanche cphgs inhibuje proliferáciu a účinne znižuje sekréciu kolagénu fibroblastov hypertrofickej jazvy prostredníctvom signálnej dráhy tgf-p / Smads.