Účinok Runingu II na rast a metastázy transplantovaného nádoru u myší s rakovinou prsníka a jeho mechanizmus

Cieľ:

Študovať účinok prípravku Runing II (čínsky rastlinný prípravok na rakovinu prsníka) na rast a metastázy transplantovaných nádorov rakoviny prsníka MA-891- myší s TA2 a jeho mechanizmus. Metódy: Bol vyvinutý model nádoru s transplantovanými kmeňmi buniek MA-891 karcinómu prsníka TA2 myší s pľúcnymi metastázami, aby sa pozoroval účinok Runing II na rast a metastázy transplantovaného nádoru. Imunohistochemická metóda a obrazová analýza boli prijaté na detekciu hladín vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF), receptora vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGFR), počtu mikrociev (MVC) a plochy mikrociev (MVA).

Výsledky: V skupine Running II bola miera inhibície hmotnosti nádoru a miera inhibície pľúcnych metastáz 37,3 percent a 65,4 percent, v uvedenom poradí, rast nádoru a metastázy v pľúcach boli zjavne inhibované; A hladiny VEGF a VEGFR, MVC a MVA boli významne znížené v porovnaní s hladinami v kontrolnej skupine nesúcej nádor (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

Navyše sme v rovnakom čase výskumu zistili, že echinacea v Cistanche pôsobí protinádorovo. Na aplikáciu echinakozidu v protinádorových liečivách tento vynález najprv pridá MTH1, anorganickú pyrofosfatázu a dGTP do reakčného roztoku (100mM pH 8,0 kyselina tris-octová, 40mM NaCl, 10mM octan horečnatý, 0,005 percenta Tween20 a 1 mMDTT) V tomto spôsobe sa enzým a substrát inkubovali pri teplote miestnosti počas 1 hodiny a potom sa na ukončenie reakcie pridalo 25 ul roztoku malachitovej zelene. Absorbancia sa detegovala pri 630 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek BIO‑RAD iMark. Výsledky ukázali, že echinakozid mal významný inhibičný účinok na enzýmovú aktivitu MTH1; Po druhé, účinok echinakozidu na nádorové bunky na bunkovej úrovni bol detegovaný testom MTT a výsledky ukázali, že echinakozid môže významne inhibovať rast buniek rakoviny hrubého čreva SW480 a buniek ľudského osteosarkómu U2OS a predložený vynález inhibuje rast echinakozidu. MTH1, špecifický enzým, ktorý udržuje prežitie v nádorových bunkách, vedie k inkorporácii oxidovaných nukleotidov do DNA, čo spôsobuje smrteľné zlomy dvojvláknovej DNA v rakovinových bunkách, čím vyvoláva protinádorové účinky. Nová medicínska aplikácia položí základy pre vývoj nových protinádorových liečiv v budúcnosti.

Kliknite na produkt cistanche efekty

Kľúčové slová:

nádor prsníka; angiogenéza; vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF); Beh II (čínsky bylinný prípravok na rakovinu prsníka)

Rakovina mliečnej žľazy je zhubný nádor, ktorý vážne ohrozuje zdravie žien a incidencia ochorenia je na prvom mieste medzi zhubnými nádormi žien, s tendenciou z roka na rok stúpať. Hoci jeho terapeutické metódy dosiahli určitý pokrok, miera dlhodobého prežitia u pacientok s rakovinou prsníka sa nezvýšila kvôli invazívnemu rastu a metastázovaniu nádorov. Angiogenéza nádorov je základnou podmienkou rastu, invázie a metastázovania nádorov.

Inhibícia angiogenézy nádorov je preto účinným spôsobom prevencie tvorby a rozvoja nádorov a predĺženia života pacienta.1 V tejto štúdii je mechanizmus čínskeho lieku Running II s funkciami dopĺňania qi a výživy jinu, Regulácia priechodných a koncepčných ciev, rozpúšťanie hmoty a detoxikácia pri inhibícii nádoru a antimetastáz bola študovaná z angiogenézy a jej regulačných faktorov v transplantovanom nádore rakoviny prsníka MA-891 myší TA2 s pľúcnymi metastázami.

MATERIÁLY

Šesťdesiat SPF samíc myší TA2, s hmotnosťou (20±2) g, vo veku 6-8 týždňov, bolo zakúpených od Department of Laboratory Animals, Tianjin University of Medical Sciences. Bunkový kmeň MA-891 buniek rakoviny prsníka myši bol dodaný prof. Luo Liqinom, Patologické laboratórium, Inštitút nádorov, Čínska akadémia lekárskych vied.

Runing II sa skladá z Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis) atď., s pomerom dávok 1,67: 1,67: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1, ktoré boli pripravené ako odvar Sekcia farmácie, nemocnica Longhua, podľa tradičnej techniky a udržiavaná na 4ºC; Cyklofosfamid (CTX, 200 mg/ampulka, číslo pobočky: 981104) a tamoxifén (TAM) boli vyrobené spoločnosťou Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd.; Normálny fyziologický roztok bol vyrobený spoločnosťou Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

Polyklonálna protilátka vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF) (pracovné riedenie 1:25–1:50), receptor vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGFR, pracovné riedenia 1:30–1:50) a FVIIIAg polyklonálna protilátka (pracovné riedenie 1:50 ) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology Inc; Druhá protilátka EnVision, králičia anti-potkania VEGF protilátka, kozia anti-králičia FVIII Ag protilátka a kozia anti-králičia VEGFR protilátka a EnVision Kit boli zakúpené od Dako Co., Dánsko; 3,3- diaminobenzidín (DAB) bol zakúpený od Shanghai Huamei Bioengineering Factory.

METÓDY

Vývoj zvieracieho modelu

Zvierací model bol vyvinutý na základe metód Luo a Gao, et al.2,3. Vybrali sa in vitro kultivované MA-891 bunky rakoviny prsníka myší vo fáze logaritmického prežívania a koncentrácia buniek sa regulovala ako 1x107/ml. Za aseptických podmienok boli rakovinové bunky cicavcov naočkované do subkutánnej časti pravej axily myši TA2 (0,2 ml/myš, tj 2X106 buniek/myš).

Zoskupovanie zvierat a spôsoby podávania

Dva dni po inokulácii boli myši náhodne rozdelené do 4 skupín, 15 myší v každej skupine. 1) Kontrolná skupina nesúca nádor: 0.4 ml normálneho fyziologického roztoku sa podávalo intragastricky, jedenkrát denne, päťkrát každý týždeň. 2) Skupina cyklu II: Pokus II bol zriedený normálnym fyziologickým roztokom a 0,4 ml tohto riedenia, čo zodpovedá 48 g·kg{{10}}·d-1, čo bolo vypočítaná podľa priloženej tabuľky „Konverzná tabuľka medzi plochami ľudského a zvieracieho tela“ v „Metodológii štúdií farmakológie čínskych liečiv“4 bola podávaná intragastricky, raz denne, päťkrát každý týždeň. 3) CTX kontrolná skupina: Pokiaľ ide o dávku, ktorú použil Jiang Bo, 5 CTX sa zriedil normálnym fyziologickým roztokom a 0,4 ml, čo zodpovedá 50 mg·kg-1·d-1 podávané intragastricky, raz každý druhý deň, trikrát týždenne. 4) Kontrolná skupina TAM: TAM bol zriedený normálnym fyziologickým roztokom a 0,4 ml zodpovedajúce 2,7 mg.kg-1·d-1 bolo podaných intragastricky, raz denne, päťkrát každý týždeň. Lieky boli podávané počas 3 týždňov vo všetkých štyroch skupinách.

Na 22. deň po podaní boli myši usmrtené dislokáciou krčných stavcov a odvážené. Potom sa odobrala a odvážila hmota nádoru a pľúca. Skutočná telesná hmotnosť myši=vážená telesná hmotnosť – hmotnosť nádoru. Sivé uzliny na povrchu pľúc, tj ložiská metastáz, boli spočítané voľným okom. Nádorová hmota bola umiestnená do 10-percentného neutrálneho formaldehydového roztoku na fixáciu, nasledovalo zaliatie parafínom, ultratenké rezy, imunohistochemické Envision dvojkrokové namáhanie a stanovenie VEGF, VEGFR, počtu mikrociev (MVC) a plochy mikrociev (MVA).

Miera inhibície hmotnosti nádoru

Miera inhibície nádoru=(priemerná hmotnosť nádoru kontrolnej skupiny po liečbe – priemerná hmotnosť nádoru skupiny liečenej liekom po liečbe)/priemerná hmotnosť nádoru kontrolnej skupiny po liečbe × 100 percent .

Miera inhibície pľúcnych metastáz

Miera inhibície pľúcnych metastáz=(priemerný počet pľúcnych metastáz v kontrolnej skupine – priemerný počet pľúcnych metastáz v skupine liečenej liekom)/priemerný počet metastáz v pľúcach v kontrolnej skupine x 100 percent.

Imunohistochemické farbenie Envision v dvoch krokoch

Odobrala sa parafínová rez 4 μm, nasledovalo rutinné odstraňovanie parafínu xylénom, gradientová dehydratácia a premytie PBS, 5 minút x 3-krát; sekcia bola ponorená do 0.01 mol/l, pH 6,0 citrátového pufra, vložená do mikrovlnnej rúry s teplotou 98 °C na 10 minút na opravu antigénu a po vybratí z mikrovlnka; kvapkanie prvej protilátky (vyššie uvedená protilátka a riedenie zodpovedajúcej protilátky), 37 °C, 90 minút, premytie PBS, 5 minút x 3-krát; kvapkanie druhej protilátky Envasion pri teplote miestnosti počas 60 minút, premytie PBS, 5 minút x 3 krát; nakvapkanie novopripraveného DAB roztoku na vyvolávanie farby, kontrola vyvolávacej farby 3–10 min pod mikroskopom, kontrastné farbenie 45 s campeachy, opláchnutie vodou z vodovodu, sušenie dúchadlom, montáž neutrálnou gumou. Bunka s cytoplazmou hnedo-žltých alebo čierno-hnedých granúl bola považovaná za pozitívnu. Známa pozitívna časť rakoviny prsníka bola použitá ako pozitívna kontrola a tá, v ktorej PBS pufor nahradil prvú protilátku, bola použitá ako negatívna kontrola.

Analýza obrazu

Použila sa videokamera ACE (rozlišovací výkon 930 riadkov) a analyzátor obrazu LEICAQ500W a plnoautomatický systém analýzy obrazu LEICA. Pod mikroskopom x 200 sa náhodne vybrali 2 zorné polia v každej sekcii na stanovenie VEGF alebo 3 zorné polia na stanovenie VEGFR a MVA a vo všetkých skupinách sa vypočítalo percento pozitívnej plochy k celej ploche zorného poľa. . Na stanovenie MVC sa vybralo 5 oblastí s najbohatšími krvnými cievami v každej sekcii pod mikroskopom x 100 a potom pod x 400 sa spočítali mikrocievy v každom zornom poli 5 neprekrývajúcich sa oblastí a použil sa priemer ako priemerné počítadlo mikrociev (MVC) nádoru.

Štatistická metóda

Použil sa softvér SPSS8.0 a na porovnanie medzi mierami sa použil chí-kvadrát test a na porovnanie priemerov sa použil t-test alebo jednosmerná ANOVA.

VÝSLEDKY

Nádorové inhibičné a antimetastázové účinky Runningu II na transplantovaný nádor u myší s rakovinou prsníka MA-891-s TA2 s metastázami v pľúcach

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 percent, s výrazným rozdielom (obaja P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

Účinky behu II na expresiu VEGF a VEGFR v transplantovanom nádore myší MA-891- nesúcich TA2

Ako je uvedené v tabuľke 2, expresie VEGF a VEGFR v skupine Running II a CTX kontrolnej skupine boli významne nižšie ako v kontrolnej skupine nesúcej nádor (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05), expresia VEGF bola významne nižšia ako v kontrolnej skupine TAM (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0.05) a expresia VEGFR bola nižšia ako v kontrolnej skupine nesúcej nádor (P<0.05).

Účinok behu II na MVA a MVC transplantovaného nádoru u myší TA2 nesúcich MA-891-

Ako je uvedené v tabuľke 3, hladiny MVA a MVC v transplantovanej rakovine v skupinách liečených liekmi boli významne nižšie ako hladiny v kontrolnej skupine nesúcej nádor (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

DISKUSIA

Tradičná čínska medicína zastáva názor, že genéza a vývoj nádoru sú výsledkom komplexného pôsobenia idiopatických a empatických faktorov, avšak s dôrazom na idiopatické a empatické faktory. V predchádzajúcej klinickej štúdii prof. Lu a Tang zastávali názor, že nedostatok vitálnej čchi vo vnútri a disharmónia priechodných a koncepčných ciev sú hlavnými príčinami vzniku nádoru a vnútorná invázia, presun a šírenie rakovinových patogénov sú hlavnými podmienkami vzniku nádoru. rast a metastázy rakoviny prsníka.6 Preto v liečbe obhajujú vyživovanie vitálnej čchi a odstraňovanie hmôt. Running II je čínska bylinná receptúra, ktorá je zhrnutá dlhoročnou klinickou praxou podľa liečebného princípu posilňovania odolnosti organizmu v prvom rade a eliminácie patogénnych faktorov v druhom rade. Vo vzorci sú suverénne zložky Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen ( Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii) s účinkami na doplnenie qi a vyživujúci jin, reguláciu priechod a koncepčné cievy, čo zodpovedá bežne pozorovaným charakteristikám rakoviny prsníka, ako je nedostatok qi a jinu a disharmónia priechodných ciev a ciev na počatie. Klinicky táto receptúra ​​dosahuje zjavný účinok predĺženia doby prežitia, zvýšenia kvality života, stabilizácie nádorového ložiska a prevencie metastáz rakoviny.

Táto štúdia vytvorila model nádoru z kmeňa MA-891 buniek s transplantovanými bunkami rakoviny prsníka TA2 myší s pľúcnymi metastázami a pozorovala účinok Running II na rast solídneho nádoru a pľúcne metastázy a zistila, že existujú významné rozdiely v nádore rýchlosť inhibície a rýchlosť inhibície pľúcnych metastáz medzi skupinou Running II a skupinou nesúcou nádor a medzi skupinou Running II a CTX kontrolnou skupinou, čo ukazuje, že Running II má zjavné funkcie inhibície rastu tumoru a anti-metastázy. Okrem toho tamoxifén (TAM) nemá zjavnú funkciu inhibície rastu nádoru a antimetastázy u modelových myší, čo je podobné výsledku, že rakovina prsníka MA-891 je kmeň ER buniek a správa o priamom účinku nízkej koncentrácie TAM v zahraničí.7

Nádor je typické ochorenie závislé od krvných ciev a jeho rast, infiltrácia a metastázy závisia od angiogenézy. Zároveň neovaskularizácia opäť dodáva metastázový kanál pre nádorové bunky, čím vytvára priaznivé podmienky pre rast, metastázy a difúziu nádoru. 8, 9 VEGF je proangiogénny faktor s najsilnejším, jedinečným a špecifickým pôsobením na vaskulárne endotelové bunky a mnohé nádorové bunky môžu vylučovať VEGF, ktorý zvyšuje vaskulárnu permeabilitu a priamo pôsobí na vaskulárne endotelové bunky prostredníctvom väzby na VEGF receptor, stimulácia jeho delenia a proliferácie, indukcia angiogenézy nádoru a ovplyvnenie počtu mikrociev, na podporu rastu a metastázovania nádoru.10,11 Väčšina nádorových buniek má vysokú expresiu VEGF, zatiaľ čo v normálnych tkanivách len malý počet orgánov, ako napr. obličky, vaječníky atď., majú vyššiu expresiu VEGF. Niektorí vedci sa preto domnievajú, že VEGF možno použiť ako markery nádorového metabolizmu a metastáz12 a je ideálnejšou cieľovou súčasťou blokovania neoangiogenézy v nádoroch,13 a interferencie s vaskulárnymi regulačnými faktormi nádorov a ich pôsobiacou väzbou, regulujúcou expresiu faktorov angiogenézy a inhibíciou angiogenézy možnou kontrolou rastu a metastáz nádoru.

Výsledky v tejto štúdii naznačujú, že Runing II môže down-regulovať expresiu VEGF a VEGFR, aby pravdepodobne blokoval prenos signálu VEGF-indukovanej migrácie a proliferácie endotelových buniek a ďalej inhiboval angiogenézu v nádoroch, a teda má antineoplastické a antimetastázujúce účinky. .

Predchádzajúce štúdie ukázali, že v priebehu rastu malígnych nádorov príliš rýchly rast tkaniva nevyhnutne vyvolal vážnu anoxiu lokálneho tkaniva a anoxia by mohla stimulovať syntézu mRNA VEGF a spomaliť degradáciu mRNA VEGF, aby sa vyvolala genéza veľký počet lokálnych nových kapilárnych ciev.14,15 Pri pozorovaní imunohistochemicky pozitívnych sfarbených buniek autori zistili zjavnú expresiu VEGF v cytoplazme odumierajúcich nekrotických nádorových buniek, naopak, menšiu alebo žiadnu expresiu VEGF v nádorových bunkách s aktívnou proliferáciou , čo môže súvisieť s vyššou úrovňou anoxiu indukujúceho faktora v nádorových bunkách, v súlade so správou Talks KL a kol.16 Running II obsahuje Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae) atď., ktoré pôsobia na aktiváciu krvného obehu, rozpúšťanie hlienov a odstraňovanie zákalu. Inhibujú syntézu a sekréciu VEGF pravdepodobne zlepšením lokálnej mikrocirkulácie nádoru, zvýšením prísunu kyslíka do nádorových buniek, a teda inhibíciou rastu nádoru, aby sa vykonala anti-metastáza.

LITERATÚRA

1.Folkman J. Angiogenéza a rakovina prsníka. J Clin Oncol 1994; 12: 441-443.

2. Folkman J. Výskum angiogenézy: od laboratória po kliniku. Forum (Genova) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. Expresia faktora vaskulárnej permeability ovplyvňuje angiogenézu nádoru v líniách ľudského melanómu xenoimplantovaných nahým myšiam. Am J Pathol 1995; 5: 775-782.

4. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, a kol. Vaskulárny endoteliálny rastový faktor je trhom pre nádorovú inváziu a metastázy v skvamocelulárnych karcinómoch hlavy a krku. Clin Cancer Res 1999; 5: 775-782.

5.Warren RS, Yuan H, Matli MR a kol. Regulácia vaskulárnym endotelovým rastovým faktorom hypoxiou. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. Post-transkripčná regulácia vaskulárneho endotelového rastového faktora hypoxiou. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

7. Talks KL, Turley H, Gatter KC, et al. Expresia a distribúcia hypoxiou indukovateľných faktorov HIF-1 alfa a HIF-2 alfa v normálnych ľudských tkanivách, rakovinách a makrofágoch spojených s nádorom. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com