Účinky polysacharidov Cistanche na biologické správanie buniek rakoviny pľúc A549
Sep 23, 2022
Abstrakt: Cieľ Preskúmať účinokPolysacharid Cistancheo biologickom správaní bunky rakoviny pľúc A549. Metódy Bunky rakoviny pľúc A549 boli rozdelené do kontrolnej skupiny,Polysacharid Cistancheskupina 100, 200, 400 ng/ml, skupina si-NC, skupina si-LINC01410,Polysacharid Cistanche400 ng/ml plus pcDNA,Polysacharid Cistanche400 ng/ml plus skupina pcDNA-LINC01410. Rýchlosť proliferácie buniek A549 sa detegovala metódou MTT, schopnosť klonovania buniek A549 sa detegovala testom tvorby kolónií a 549 buniek sa detegovala prietokovou cytometriou
Rýchlosť apoptózy buniek, metóda Transwell sa použila na detekciu migrácie a schopnosti invázie buniek A549 a metóda RT-qPCR sa použila na detekciu expresie LINC01410 mRNA v bunkách A549.
Výsledky:Polysacharid Cistanchemôže inhibovať proliferáciu buniek A549, tvorbu kolónií, migráciu a schopnosť invázie, expresiu mRNA LINC01410 (P<0.05), and="" promote="" cell="" apoptosis="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" after="" inhibiting="" the="" expression="" of="" linc01410,="" the="" growth,="" migration="" and="" invasion="" abilities="" of="" a549="" cells="" were="" inhibited=""><0.05). overexpression="" of="" linc01410="" could="" reverse="" the="" effects="" of="">Polysacharid Cistanchena proliferáciu, apoptózu, migráciu a inváziu buniek A549. Záver:Polysacharid Cistanchemôže inhibovať aktivitu, tvorbu klonov, migráciu a schopnosť invázie buniek rakoviny pľúc a podporovať bunkovú apoptózu znížením expresie LINC01410.
Kľúčové slová:Polysacharid Cistanche; bunka rakoviny pľúc A549; LINC01410; šírenie; apoptóza
Kliknite sem a získajte bezplatnú vzorku Cistanche
Rakovina pľúc je zhubný nádor s prvou morbiditou a úmrtnosťou v mojej krajine. Liečebné metódy rakoviny pľúc zahŕňajú imunizáciu, chirurgiu a chemoterapiu [1].
Štúdie ukázali, že tradičná čínska medicína a jej zložky majú veľké výhody pri liečbe rakoviny pľúc a môžu zlepšiť účinnosť rakoviny pľúc [2-3].Cistancheje v mojej krajine vzácnym liečivým materiálom a medzi jeho hlavné zložky patria celkové glykozidy fenetylalkoholu, polysacharidy, iridoidy, alkaloidy a lignany. Štúdie zistili, že celkomfenyletylglukozidy Cistanchemôcťznižujú poškodenie pečene u myší s nádorom H22 a inhibujú rast nádoru[4]. Ergosterozid, aktívna zložka Cistanche, môže inhibovať rast nádoru a proliferáciu buniek kolorektálneho karcinómu v modeli xenoštepu nahých myší a indukovať apoptózu [5].
Cistanche polysacharidymôže inhibovať bunky Lewisovej rakoviny pľúc a sarkómu S180 zvýšením aktivít prirodzených zabíjačských buniek a interleukínu 2 (IL-2).
Avšak potenciálne funkcie, procesy biogenézy a základné mechanizmyCistanche polysacharidypri rakovine pľúc zostávajú nejasné. Štúdie ukázali, že lncRNA sú často deregulované pri rakovine pľúc a hrajú dôležitú úlohu pri výskyte, rozvoji a liečbe rakoviny pľúc [7]. LINC01410 je vysoko exprimovaný pri rakovine endometria a ovplyvňuje prognózu pacientok s rakovinou endometria [8]; Nadmerná expresia LINC01410 podporuje angiogenézu a metastázy rakoviny žalúdka inhibíciou miR-532-5p [9]; Bunky papilárneho karcinómu štítnej žľazy proliferujú, migrujú a napádajú [10-11], zatiaľ čo úloha LINC01410 pri rakovine pľúc je nejasná. Účelom tohto experimentu bolo študovať účinkyCistanche polysacharidya LINC01410 o malígnom fenotype buniek rakoviny pľúc a či sa LINC01410 podieľal na reguláciiCistanche polysacharidyo malígnom biologickom správaní buniek rakoviny pľúc s cieľom poskytnúť základ pre ďalší výskumCistanche polysacharidy.
Cistanche polysacharidy
Materiál polysacharidov Cistanche v štúdii Treat Cancer
Bunky rakoviny pľúc A549 boli zakúpené od American Type Culture Collection (ATCC).Polysacharid Cistanche(čistota väčšia alebo rovná 98 percent, číslo produktu D3281) bol zakúpený odWecistanche Bio-Tech Biotechnology Co., Ltd. Fetálne hovädzie sérum bolo zakúpené od Guangzhou Shuoheng Biotechnology Co., Ltd.;
Médium RPMI{0}} bolo zakúpené od Hangzhou Qiannuo Biotechnology Co., Ltd.; MTT kit bol zakúpený od Shanghai Meixuan Biotechnology Co., Ltd.; Komora Transwell a Matrigel boli zakúpené od Beijing Unicon Biotechnology Co., Ltd.; Súprava apoptózy bola zakúpená od PromoCell, Germany Company; Súprava SYBRremix ExTaqTM bola zakúpená od Shanghai Shanran Biotechnology Co., Ltd.
2 metódy Cistanche polysacharidov v štúdii Treat Cancer Study
2.1 Bunková kultúra a zoskupovanie
Bunky A549 sa kultivovali v médiu RPMI{1}} obsahujúcom 10 percent fetálneho hovädzieho séra v inkubátore s teplotou 37 stupňov a 5 percentami CO2. Boli ošetrené bunky v logaritmickej rastovej fázePolysacharid Cistanchepri hmotnostných koncentráciách 100, 200 a 400 ng/ml a zaznamenané akoPolysacharid Cistanche100, 200 a 400 ng/ml skupiny; bunky A549, ktoré neboli ošetrené polysacharidom Cistanche, boli kontrolnou skupinou. Bunky A549 boli transfekované si-NC alebo si-LINC0141, v danom poradí, označené ako si-NC skupina, si-LINC01410 skupina; si-NC a si-LINC01410 boli transfekované do buniek A549 a ošetrené 400 ng/mlPolysacharid Cistanche, označené akoPolysacharid Cistanche400 ng/ml plus skupina pcDNA,Polysacharid Cistanche400 ng/ml plus skupina pcDNA-LINC01410.
2.2 Detekcia metódou MTT
Rýchlosť proliferácie buniek A549 Bunky A549 boli ošetrenéPolysacharid Cistanchev hmotnostných koncentráciách 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 a 400 ng/ml. Odoberte bunky A549 v každej skupine a umiestnite ich do 96-jamkovej platne, do každej jamky pridajte 20 μl MTT, pokračujte v kultivácii v inkubátore počas 4 hodín, odstráňte supernatant, pridajte 150 μl DMSO do každej jamky a detekovať svetlo každej skupiny buniek pri vlnovej dĺžke 490 nm. Hodnoty hustoty (OD) sa použili na výpočet rýchlosti bunkovej proliferácie.
Kultivácia Cistanche
2.3 Test tvorby kolónií
A549 cell cloning ability Collect A549 cells in each group, adjust the density to 1 × 105 /mL, and inoculate 100 μL per well in a 6-well plate, incubate in an incubator until visible cell clones appear, wash 2 times with PBS, 4 % paraformaldehyde was fixed for 20 min, stained with 1% crystal violet solution for 15 min, observed under a light microscope, and the number of colonies (>50 buniek).
2.4 Detekcia prietokovou cytometriou
Rýchlosť apoptózy buniek A549 Bunky A549 v každej skupine sa zhromaždili a resuspendovali v 100 μl fosfátom tlmeného fyziologického roztoku (1 x 106 / ml) a do skúmavky sa pridal 1 ml bunkovej suspenzie, 10 μl Annexinu V-FITC a 5 μLPI. , chránené pred svetlom. Po inkubácii počas 30 minút sa bunky zhromaždili a analyzovali prietokovou cytometriou.
apoptóza.
2.5 Detekcia metódou Transwell
Schopnosť migrácie a invázie buniek A549 Suspenzie buniek A549 (2×104/200 μl, médium bez séra) každej skupiny boli rovnomerne rozložené v hornej komore komory Transwell a 500 μl RPMI{{ 7}} médium obsahujúce 10 percent FBS sa pridalo do spodnej komory. Bunky v hornej komore boli odstránené a bunky v dolnej komore boli fixované 4 percentami paraformaldehydu a zafarbené 0,1 percentami kryštálovej violeti. Bunky sa pozorovali pod svetelným mikroskopom a náhodne sa vybralo 5 zorných polí na počítanie. V experimente bunkovej invázie bol Matrigel vopred potiahnutý na hornú komoru Transwellovej komory a ostatné kroky boli rovnaké ako v migračnom experimente.
2.6 Detekcia RT-qPCR
Expresia LINC01410 mRNA v bunkách A549 Celková RNA sa extrahovala z buniek pomocou činidla TRIzol a cDNA sa syntetizovala podľa pokynov súpravy na reverznú transkripciu. Reakčným systémom boli 2 μl produktu reverznej transkripcie, 10 μl SYBR Green Mix, 0,5 μl priamych a reverzných primerov a 7 μl sterilnej vody. Reakčné podmienky boli 95 stupňov počas 30 s, 60 stupňov počas 30 s a 72 stupňov počas 30 s, celkovo 40 cyklov; relatívna expresia LINC01410mRNA bola vypočítaná metódou 2-ΔΔCT s GAPDH ako internou referenciou. Sekvencie primérov sú LINC01410 dopredný 5'-TGACAAGAATGGCCCAAGC-3', reverzný 5'-ACTGTGCACCTGTTACACCA-3'; interný odkaz GAPDH dopredu 5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3', dozadu 5'-CTCCACGACGTACTC AGCG-3'.
2.7 Štatistická analýza
Na spracovanie bol použitý softvér SPSS 20.0, namerané údaje boli vyjadrené ako (x±s), na porovnanie medzi dvoma skupinami bol použitý t test nezávislých vzoriek, na porovnanie medzi viacerými skupinami bola použitá jednosmerná analýza rozptylu skupiny a na párové porovnanie medzi skupinami sa použil LSD-t test. P<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">
Extraktový prášok Cistanche
3 výsledky Cistanche polysacharidov v štúdii Treat Cancer Study
3.1 ÚčinokPolysacharid Cistanchena proliferáciu a apoptózu buniek A549 V porovnaní s kontrolnou skupinou bola rýchlosť proliferácie buniek A549 v každej dávkovej skupinePolysacharid Cistanchezvýšená (P<0.05), ic50="" was="" 319.8="" ng/ml,="" see="" table="" 1="" .="" compared="" with="" the="" control="" group,="" the="" proliferation="" rate="" of="" a549="" cells="" in="" the="" polysaccharide="" 100,="" 200,="" and="" 400="" ng/ml="" groups="" of="" cistanche="" decreased="" (="" p="" <="" 0.="" 05="" )="" ,="" the="" number="" of="" clones="" was="" decreased="" (="" p="" <="" 0.="" 05)="" ,="" and="" the="" apoptosis="" rate="" was="" increased="" (="" p="" <="" 0="" ).="" .05)="" ,="" in="" a="" dose-dependent="">
3.2 ÚčinokPolysacharid Cistanchena schopnosť migrácie a invázie buniek A549 V porovnaní s kontrolnou skupinou bol počet buniek A549 v každej dávkovej skupinePolysacharid Cistancheznížená (P<0.05) in="" a="" dose-dependent="" manner,="" as="" shown="" in="" figure="" 2,="" table="">
3.3 ÚčinokPolysacharid Cistanchena expresiu LINC01410 mRNA v bunkách A549 V porovnaní s kontrolnou skupinou bola expresia LINC01410 mRNA v bunkách A549 v každej dávkovej skupinePolysacharid Cistanchebola znížená (P＜0.05) v závislosti od dávky.
