Účinky flavonoidov na kožu podľa ich štrukturálnych charakteristík: Prehľad

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Pozadie: Počas infarktu myokardu (IM) sa stratia miliardy kardiomyocytov. Optimálna terapia by mala účinne nahradiť poškodené kardiomyocyty, prípadne kmeňovými bunkami schopnými prihojiť sa a diferencovať sa na dospelé funkčné kardiomyocyty. Ako také sú vhodnými kandidátmi kmeňové bunky srdcového predsieňového prívesku (CASC). Prítomnosť zvýšených hladín konečných produktov pokročilej glykácie (AGE) v srdcových oblastiach, kde sú transplantované CASC, však môže ovplyvniť ich regeneračný potenciál. V tejto štúdii skúmame, či a ako AGE menia vlastnosti CASC in vitro. Metódy a výsledky: CASC v kultúre boli vystavené rôznym koncentráciám AGEs （50 ug/ml až 400 ug/ml）. Prežitie, proliferácia a migračná kapacita CASC sa významne znížili po 72 hodinách expozície AGE. Apoptóza sa významne zvýšila so zvyšujúcou sa koncentráciou AGE. Škodlivé účinky týchto AGE boli čiastočne otupené predinkubáciou s receptorom pre AGE (RAGE) inhibítor （25μM FPS-ZM1）, čo naznačuje zapojenie RAGE do pozorovaných negatívnych účinkov. Záver: AGE majú od času a koncentrácie závislý negatívny účinok na prežitie, proliferáciu, migráciu a apoptózu CASC in vitro, čiastočne sprostredkovaný aktiváciou RAGE. To, či sú anti-AGE terapie účinnou liečbou pri liečbe kmeňovými bunkami po IM, si vyžaduje ďalšie vyšetrenie.

Kľúčové slová:kmeňové bunky; aldehyddehydrogenáza; CASC; glykované proteíny; konečné produkty pokročilej glykácie; šírenie; apoptóza; migrácia; Inhibícia RAGE

1. Úvod

Koronárna choroba srdca (ICHS) zostáva celosvetovo hlavnou príčinou mortality a morbidity, pričom najčastejšou formou ICHS je infarkt myokardu (IM) [1]. IM je výsledkom úplnej alebo čiastočnej oklúzie koronárnej artérie. V ischemickej oblasti je obmedzený kyslík a živiny, čo vedie k smrti buniek myokardu. Veľkosť infarktu závisí od viacerých faktorov, ako je veľkosť rizikovej ischemickej oblasti, umiestnenie a trvanie koronárnej oklúzie a množstvo reziduálneho kolaterálneho prietoku krvi [1,2]. Keďže dospelé kardiomyocyty majú minimálne regeneračné vlastnosti, vnútorná oprava poškodeného tkaniva zostáva nepolapiteľná. Nájdenie terapeutického prístupu, ktorý efektívne nahradí jazvu myokardu funkčným kontraktilným tkanivom, je jedinou možnosťou, ako obnoviť stratené srdcové tkanivo.koľko cistanche vziaťVeľa výskumného úsilia bolo vynaložené na odhalenie terapeutického potenciálu a mechanizmov bunkovej terapie bunkami kostnej drene (BMC). Kostná dreň obsahuje hematopoetické kmeňové bunky (HSC), endotelové progenitorové bunky (EPC) a mezenchymálne kmeňové bunky (MSC)[3]. Klinické štúdie s mononukleárnymi BMC a MSC nepriniesli významné zlepšenie srdcovej funkcie po IM. Keďže mononukleárne BMC a MSC sa nediferencujú na kardiomyocyty, pozorované obmedzené zlepšenia sa pravdepodobne pripisujú parakrinným mechanizmom [4,5]. Na výrazné zlepšenie srdcovej funkcie po IM sa ťažisko výskumu presunulo na rezidentné srdcové kmeňové bunky (CSC), ako sú c-kit plus , Sca-1 plus , Isl-1 plus -bunky a kardiosféry, ktorí sú pravdepodobne vopred naprogramovaní, aby sa stali kardiomyocytmi. Ich úspešnosť pri regenerácii srdca je však slabá [6].

kliknite sem a dozviete sa viac

V posledných rokoch naša výskumná skupina objavila nový typ srdcových kmeňových buniek s názvom „kardiálne predsieňové kmeňové bunky“ (CASC). Na rozdiel od iných kmeňových buniek vykazujú CASC mimoriadne kardiomyogénne diferenciačné vlastnosti, čo z nich robí sľubného kandidáta na regeneráciu srdca [4]. Izolácia tejto populácie kmeňových buniek z predsieňových príveskov je založená na vysokej aktivite aldehyddehydrogenázy (ALDH). Vysoká aktivita ALDH bola hlásená aj v iných typoch kmeňových buniek, ako sú okrem iného MSC, HSC a nervové a rakovinové kmeňové bunky[7-9]. Keďže sa ukázalo, že ALDH je kardioprotektívny a podporuje prežitie buniek v stresových podmienkach, použitie ALDH plus populácie kmeňových buniek pri ischemických stavoch môže byť v tomto kontexte prospešné [4,10]. CASC môžu byť rozšírené až na klinicky relevantné čísla bez straty základných charakteristík, ako je aktivita ALDH, profil povrchového antigénu a kardiomyogénna diferenciačná kapacita [11]. Táto skutočnosť je rozhodujúca pre prenos tohto terapeutického prístupu na kliniku. Okrem toho sme ukázali, že autológna transplantácia CASC vedie k zlepšeniu funkcie ľavej komory, čo je výsledkom adekvátneho prihojenia kmeňových buniek a ďalšej diferenciácie CASC [4,12].

U pacientov s MI sú zvýšené hladiny konečných produktov pokročilej glykácie (AGEs) [13]AGEs sú proteíny a/alebo lipidy, ktoré sú ireverzibilne poškodené glykáciou, procesom, pri ktorom redukujúce cukry reagujú neenzymaticky s aminoskupinami v lipidoch alebo proteínoch. . Okrem glykácie vedie oxidačný stres k tvorbe AGE aj prostredníctvom oxidácie proteínov a/alebo lipidov [14]. AGE sa tvoria endogénne a prirodzene sa akumulujú v tele so starnutím alebo v patologických situáciách, ako je IM, keď sú zvýšené hladiny oxidačného stresu [15-17].čo je cistancheOkrem toho predchádzajúci výskum ukázal, že AGE ovplyvňujú rôzne typy kmeňových buniek in vitro [18-20]. Schopnosť kmeňových buniek proliferovať je znížená AGEs a ​​apoptotická rýchlosť je zvýšená po aplikácii AGEs. Tieto účinky by sa mohli uskutočniť prostredníctvom niekoľkých mechanizmov, vrátane aktivácie apoptotickej dráhy, RAGE alebo nadmernej tvorby ROS [20]. Či AGE ovplyvňujú aj vlastnosti CASC, zostáva neznáme. Tieto zistenia vyvolávajú otázku, či AGE môžu negatívne ovplyvniť terapeutickú účinnosť CASC, ktoré sa používajú na liečbu IM. Cieľom tejto štúdie je preto preskúmať in vitro účinky AGE a potenciálnu aktiváciu jeho receptora RAGE na proliferáciu, prežitie a migráciu CASCS.

2. Materiály a metódy

2.1. Pokusy na zvieratách

Štúdie na zvieratách boli vykonané v súlade so smernicou EÚ 2010/63/EÚ pre pokusy na zvieratách a schválené Miestnym etickým výborom pre pokusy na zvieratách (UHasselt, Belgicko, Diepenbeek; ID 201919K). Všetky zvieratá boli držané v prostredí s kontrolovanou teplotou (21 stupňov, 60 percent vlhkosti) s 12h-12h cyklom svetlo-tma. Boli kŕmené štandardnou peletovou stravou s vodou dostupnou ad libitum. Celkovo sa použilo 62 samíc potkanov Sprague-Dawley (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Francúzsko).

2.2. Izolácia a expanzia potkaních CASC

CASC boli odobraté z príveskov pravej predsiene, ako bolo opísané vyššie [4]Stručne povedané, potkanom bol injekčne podaný heparín (1000 jednotiek/kg, intraperitoneálne (ip) a boli usmrtené predávkovaním pentobarbital sodný (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). Odobrali sa srdcia, premyli sa normálnym roztokom Tyrode (137 mMNaCl, 5,4 mMKCl, 0,5 mMMgClz, 1 mMCaClz, 11,8 mMNa-HEPES-kazeurín, 10mM ,pH 7,4) a odobrali sa prívesky pravej predsiene. Extrahované tkanivo prívesku pravej predsiene bolo rozomleté ​​na kúsky s veľkosťou ~ 1 mm3, premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a enzymaticky disociované 30 minút v Hankovom vyváženom soľnom roztoku obsahujúci 0,6 WU/ml kolagenázy NB 4 (Serva, Heidelberg, Nemecko) a 20 mM Carly.bioflavonoidyBunky ALDHt boli zafarbené podľa súpravy Aldefluor (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgicko). Bunky ALDHt boli definované ako CASC a boli triedené prietokom (BD FACS Aria) v médiu X-VIVO 15 (Lonza, Bazilej, Švajčiarsko) doplnenom 20 percentami fetálneho teľacieho séra (FCS) a 2 percentami penicilínu/streptomycínu (P/S) . Izolované CASC sa naočkovali na 6-jamkové platne v hustote 60,{7}} buniek na jamku a inkubovali sa pri 37 stupňoch vo zvlhčenom inkubátore s atmosférou 5 % CO2. Médium sa menilo každé 2 až 3 dni. Keď CASC dosiahli 80 percent konfluencie, boli zozbierané pomocou trypsínu. Pre všetky experimenty sa použili pasáže 1 CASC.

Cistanche môže proti starnutiu

2.3. AGEs Príprava

AGE boli pripravené tak, ako bolo opísané vyššie [21]. Stručne, hovädzí sérový albumín (BSA; 7 mg/ml) sa inkuboval s glykolaldehydovými dimérmi (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgicko) v sterilnom PBS (pH 7,4) počas 5 dní pri 37 stupňoch. Tento roztok bol dialyzovaný proti PBS, dvakrát počas 2 hodín a cez noc pri 4 stupňoch, aby sa odstránil nezreagovaný glykolaldehyd (hranica 3,4 kDa. AGE boli filtrované (0,2 um filter, Sarstedt, Antverpy, Belgicko). BSA inkubovaný v PBS (7 mg/ml ) sa použil ako kontrolný roztok.

2.4. Test šírenia a prežitia

Uskutočnili sa testy proliferácie a prežitia s testom propidium jodidu (PI), ako je opísané skôr v Gervois et al. a Lo Monaco et al.[22,23]. Stručne povedané, CASC sa naočkovali na 96-jamkovú doštičku v médiu X-VIVO s 10 percentami FCS a 2 percentami P/S. Na proliferačné testy sa naočkovalo 5000 buniek na jamku. Na testy prežitia sa naočkovalo 100 buniek na jamku. Po 24 hodinách sa do média pridalo päť rôznych podmienok: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml a 400 ug/ml AGEs. Na meranie proliferácie sa BSA alebo AGE pridali do média X-VIVO s 2 percentami FCS a 2 percentami P/S.kúpiť cistancheNa meranie prežitia boli BSA alebo AGE pridané do média X-VIVO s 0 percentami FCS a 2 percentami P/S. Po troch rôznych časových bodoch (24, 48 a 72 h) sa médium nahradilo lyzačným pufrom A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Nemecko), po ktorom nasledovalo rovnaké množstvo stabilizačného pufra B (ChemoMetec) doplneného PI (10 ug/ ml, Sigma). Po inkubačnej dobe 15 minút v tme sa merala fluorescencia pomocou čítačky doštičiek Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Nemecko) pri excitácii 540 nm, emisnej vlnovej dĺžke 612 nm a zisku 2000. Boli uskutočnené experimenty v troch vyhotoveniach. Údaje boli normalizované na údaje získané s 400 ug/ml BSA.

2.5. Migračný test

CASC sa naočkovali na {{0}}jamkovú doštičku v hustote 5000 buniek na jamku v médiu X-VIVO s 10 percentami FCS a 2 percentami P/S. K médiu sa pridalo päť podmienok: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml a 400 ug/ml AGEs. Po inkubačnej dobe 72 hodín sa upravené CASC zozbierali pomocou trypsínu a použili sa na test migrácie medzi jamkami. V ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgicko) s poréznou membránou s veľkosťou pórov 8 um sa 100 000 buniek za podmienok naočkovalo do média X-VIVO s 0 percentami FCS a 2 percentami P/S. ThinCerts boli umiestnené na 24-jamkové platne obsahujúce X-VIVO médium s 2 percentami FCS a 2 percentami P/S. Po 24 hodinách migrácie boli ThinCerts fixované 4 percentami paraformaldehydu (PFA) počas 15 minút a inkubované s 0,1 percent kryštálovej violeti počas 30 minút. Bunky, ktoré nemigrovali, sa odstránili z hornej strany ThinCerts, potom sa množstvo transmigrovaných CASC kvantifikovalo pomocou softvéru AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Zaventem, Belgicko). Údaje boli normalizované na údaje získané s 400 ug/ml BSA.

2.6. Apoptózový test

CASC sa naočkovali na 96-jamkovú platňu v hustote 10,{2}} buniek na jamku v médiu X-VIVO s 2 percentami FCS a 2 percentami P/S. Na štúdium apoptózy sa uskutočnil kaspázový test s použitím činidla IncuCyte8 Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagent (zriedené 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgicko). K médiu sa pridalo päť podmienok: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml a 400 ug/ml AGEs.CASC kultivované v médiu X-VIVO bez FCS a 2 percent P/ S boli použité ako pozitívna kontrola. Experimenty sa uskutočňovali trojmo. Snímky sa urobili po 24, 48 a 72 hodinách inkubácie pomocou systému analýzy buniek IncuCyte@S3Live-Cell (Sartorius, Schaarbeek, Belgicko). Analýza oblasti obsadenej apoptotickými bunkami sa uskutočnila pomocou IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgicko). Údaje boli normalizované na pozitívnu kontrolu (plus, X-VIVO médium bez FCS).

2.7. In vitro inhibícia RAGE

RAGE bol inhibovaný, aby sa vyhodnotil príspevok aktivácie RAGE k proliferácii, prežitiu a migrácii CASC. Stručne, CASC boli predinkubované pri 37 stupňoch v 5 percentnom CO2 inkubátore s RAGE antagonistom FPS-ZM1 (10 a 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgicko). Po 2 hodinách predinkubácie sa pridalo 400 ug/ml AGE.cistanche AustráliaPo 24 48 a 72 hodinách sa proliferácia a prežitie vyhodnotili tak, ako je opísané vyššie. Po 72 hodinách inkubácie sa vopred upravené CASC zozbierali a použili na test migrácie medzi jamkami, ako je opísané vyššie.

2.8.Štatistika

Štatistické analýzy sa vykonali pomocou softvéru GraphPad Prism 9.0.0.cistanchNormálna distribúcia údajov bola hodnotená Shapiro-Wilkovým testom. Normálne rozložené dáta boli podrobené jednosmernému testu ANOVA s opakovanými meraniami, po ktorom nasledoval Holm-Sidakov test Multiple Comparison. Keď údaje neboli normálne rozdelené, použil sa neparametrický Friedmanov test, po ktorom nasledoval Dunnov test viacnásobného porovnania. Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Hodnota p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Výsledky

3.1. Expozícia AGEs negatívne ovplyvňuje šírenie a prežitie CASC

Ako je znázornené na obrázku 1, AGE významne a postupne znižovali proliferáciu CASC v priebehu času. Negatívny vplyv AGE na proliferáciu CASC bol tiež závislý od koncentrácie. Po 72 hodinách koncentrácie 100 ug/ml, 200 ug/ml a 400 ug/ml AGEs významne znížili proliferáciu CASC v porovnaní s BSA (obrázok 1C; 80 percent ± 7 n100 ug/ml, 74 percent ± 3 v 200 ug/ml a 65 percent ± 4 v 400 ug/ml AGEs）. Aplikácia samotného BSA neovplyvnila proliferatívnu kapacitu CASC (obrázok Sl v doplnkových materiáloch). Ako je znázornené na obrázku 2, rastúce koncentrácie AGE negatívne ovplyvnili prežitie CASC v čase. Významné účinky AGE boli pozorované po 48 (obrázok 2B) a 72 hodinách (obrázok 2C; 85 percent ± 3 v 100 ug/ml, 73 percent ± 3 v 200 ug/ml a 64 percent ± 4 v 400 ug/ml AGEs) Aplikácia samotného BSA neovplyvnila schopnosť CASC prežiť (obrázok S1).

3.2. Zvýšené koncentrácie AGE Zvyšujú apoptózu CASC

Na objasnenie účinku rôznych koncentrácií AGEs (50, 100, 20 a 400 ug/ml) na apoptózu CASC sa uskutočnil kaspázový test. Percento buniek exprimujúcich kaspázu 3/7 sa meralo v rôznych časových bodoch: 24 (obrázok 3A), 48 (obrázok 3B) a 72 (obrázok 3C) h. Rýchlosť apoptózy sa postupne zvyšovala v priebehu času so zvýšenými koncentráciami AGE (obrázok 3C, 72 h; 77 percent ± 17 v 400 ug/ml AGEs vs. 18 percent ± 3 v BSA).

3.3. Expozícia AGE znižuje migračnú kapacitu CASC

Migračná kapacita CASC sa hodnotila testom migrácie medzi jamkami po 72 hodinách inkubácie s rôznymi koncentráciami AGE. Na obrázku 4-E sú uvedené reprezentatívne príklady migrácie CASC po inkubácii s BSA a rôznymi koncentráciami AGEs (50, 100, 200 a 400 ug/ml). Kvantifikácia migrácie je znázornená na obrázku 4F. V porovnaní s BSA sa pozorovalo významné zníženie migrácie, keď sa CASC inkubovali so 400 ug/ml AGEs (obrázok 4E, F; 75 percent ± 5 v 400 ug/ml AGEs).

3.4. Škodlivé účinky AGE v CASC sú sprostredkované aktiváciou RAGE

Na vyhodnotenie príspevku aktivácie RAGE k pozorovaným škodlivým účinkom AGE sa po inkubácii s antagonistom RAGE FPS-ZM1 hodnotila proliferácia, prežitie a migrácia CASC. Pred vystavením 400 ug/ml AGEs boli CASC predinkubované počas 2 hodín s 10 alebo 25 uM FPS-ZM1. Aplikácia samotného FPS-ZMl (10 a 25 uM) neovplyvnila proliferatívnu kapacitu ani prežitie CASC (obrázok S2). Proliferácia CASC (obrázok 5A-C) sa hodnotila po 24 (A), 48 (B) a 72 (C) hodinách. Ako je znázornené na obrázku 1, negatívny vplyv na proliferáciu CASC prostredníctvom AGE je významne otupený po predinkubácii s 25 uM FPS-ZM1 (obrázok 5A-C). Po 24 a 48 hodinách sa proliferácia CASC výrazne zlepšila, s expozíciou 400 ug/ml AGEs (24 hodín, obrázok 5A; 104 percent 士8 v 25 μM FPS-ZM1 vs. 79 percent ± 5 v 400 ug/ml AGEs; 48 h, obrázok 5B; 95 percent ± 5 palcov 25 μM FPS-ZM1 vs. 70 percent ± 4 palcov 400 ug/ml AGEs）. Po 72 hodinách bol pozorovaný rovnaký trend. Proliferácia mala tendenciu zlepšovať sa, keď bola inhibovaná RAGE (obrázok; 80 percent ± 8 v 25 μMFPS-ZM1 vs. 67 percent ± 5 v 400 ug/ml AGEs, p=0,06）). Prežitie (obrázok 6A-C) sa hodnotilo po 24 (A), 48 (B) a 72 (C) hodinách. Negatívny vplyv na prežitie CASC pomocou AGE (obrázok 2) sa výrazne zlepšil po predinkubácii s 25 uM FPS-ZM1 (obrázok 6A-C). Po 24 hodinách sa prežitie výrazne zlepšilo (obrázok 6A; 104 percent ± 7 v 25 μM FPS- ZM1 verzus 91 percent ± 4 v 400 ug/ml AGEs）. Tento trend bol tiež pozorovaný po 48 hodinách (obrázok 6B; 91 percent ± 5 v 25 μM FPS-ZM1 vs. 81 percent ± 5 v 400 ug/ml AGES, p =0.07). Reprezentatívne príklady migrácie CASC po 72 hodinách inkubácie s 400 ug/ml AGE a FPS-ZMl sú uvedené na obrázku a kvantifikované na obrázku. Predinkubácia CASC s 25 uM FPS-ZMI by mohla zabrániť zníženej migračnej kapacite CASC pozorovanej pri expozícii AGE ( Obrázok 7B; 98 percent ± 6 v 25 uM FPS-ZM1 vs. 7 percent ± 8 v 400 ug/ml AGEs, p{108}},07）.

4. Diskusia

Naša štúdia je prvou, ktorá ukazuje, že AGE ovplyvňujú vlastnosti CASC, konkrétne prežitie, proliferáciu, migráciu a apoptózu in vitro. Naše údaje ukazujú, že tieto účinky sú čiastočne sprostredkované aktiváciou RAGE spôsobom závislým od dávky.

4.1. Úloha AGE pri IM

Hladiny AGE v obehu sú signifikantne zvýšené u pacientov s akútnym IM [24,25] Ako sa však podieľajú na patofyziológii IM, zostáva nejasné. Reaktívne formy kyslíka (ROS) sú hlavnými prispievateľmi zapojenými do syntézy AGE. Oxidačný stres môže vyvolať tvorbu reaktívnych karbonylových zlúčenín a glykooxidáciu Amadoriho produktov v Maillardovej reakcii. Ako také sa AGEs ireverzibilne tvoria a akumulujú v srdci po IM a predpokladá sa, že potenciálne ďalej zhoršujú nepriaznivý fenotyp srdca [26,27]. Okrem toho, neutrofily a aktivované makrofágy, ktoré sa podieľajú na zápalovom procese pri IM, sú hlavnými prispievateľmi k syntéze AGE [28,29]. Tieto imunitné bunky vylučujú AGE a sú uvádzané ako kľúčové induktory tvorby AGE pri MI. 4.2. Fyziologický význam koncentrácií AGE

V našej štúdii sme testovali široký rozsah koncentrácií AGEs （50 až 400 ug/ml）Koncentrácia AGEs použitá v iných in vitro štúdiách skúmajúcich účinok AGEs na kmeňové bunky sa pohybuje od 15 do 500 ug/ml 【20】. Existuje významná variabilita použitých koncentrácií, ale vyššie hladiny AGE vo všeobecnosti odrážajú fyziologické plazmatické hladiny zistené u pacientov trpiacich viacerými chorobami. Ukázalo sa, že koncentrácia AGEs-albumínu u diabetických pacientov sa pohybuje od 50 do 400 ug/ml[30]. Hladiny AGE môžu u pacientov trpiacich kardiovaskulárnymi ochoreniami vzrásť na koncentrácie až 200 ug/ml [31,32]. U pacientov s Alzheimerovou chorobou v počiatočnom štádiu sa tiež uvádzajú nižšie koncentrácie AGE v rozsahu nanometrov [33]. Avšak kvôli rôznym analytickým metódam používaným na meranie AGE a heterogenite rôznych typov AGE zostáva odhad spoľahlivých koncentrácií AGE in vivo technicky náročný a je pravdepodobne podhodnotený [34].

4.3. AGE majú negatívny vplyv na vlastnosti CASC

Aj keď transplantácia CASC vykazuje sľubný potenciál pre regeneráciu srdca po IM, prežitie a regeneračná kapacita buniek zostáva problémom. Ischemické oblasti sú známe ako nepriateľské prostredie so zvýšenými hladinami oxidačného stresu, zápalu a fibrózy v kombinácii so zvýšenými hladinami tkaniva AGE. Či by AGE ovplyvnili regeneračnú kapacitu CASC, nebolo známe, ale mohlo by ísť o dôležité poznatky v kontexte regenerácie srdca a sľubných regeneračných kapacít CASC[12]. V našej štúdii sme ukázali, že AGE zhoršujú prežitie, proliferáciu a migráciu CASC in vitro, spôsobom závislým od koncentrácie a času. Okrem toho expozícia AGE vedie k postupnému zvýšeniu apoptózy CASC. Naše údaje sú v súlade so štúdiami skúmajúcimi účinok AGE na viaceré typy iných kmeňových buniek, v ktorých je zmenená proliferatívna kapacita a zvýšená apoptóza [20]. Zhu et al. skutočne preukázali významné zníženie proliferácie EPC po vystavení rôznym koncentráciám AGE [16]. Rovnaký účinok bol hodnotený Sunom a kol. aj v EPC, kde zvýšenie rýchlosti apoptózy bolo sprostredkované aktiváciou dráhy p38 MAPK [35]. NSC vystavené AGE viedli k redukcii proliferácie kmeňových buniek v závislosti od dávky, sprostredkovanej prostredníctvom PPARy dráhy [36]. V kmeňových bunkách derivovaných z tukového tkaniva (ADSC) vedie zvýšenie aktivácie kaspázy 3 k zvýšeniu apoptotickej rýchlosti [37]. Yang a kol. uviedli nižšie proliferačné a migračné kapacity v MSC spôsobom závislým od koncentrácie AGE. Tento účinok bol sprostredkovaný nadmernou produkciou ROS[18]. Zostáva určiť, či sú škodlivé účinky na CASC, veľmi odlišnú populáciu kmeňových buniek srdcového pôvodu, sprostredkované aj nadmernou produkciou ROS.

Ukázalo sa, že základné mechanizmy, v ktorých AGE vykonávajú svoje negatívne účinky na funkciu orgánov, sú závislé a/alebo nezávislé od aktivácie RAGE receptora [15]. Štúdie na mnohých typoch kmeňových buniek ukazujú, že AGE sprostredkúvajú svoje účinky hlavne prostredníctvom aktivácie RAGE alebo iných apoptotických dráh[20]. Aktivácia RAGE pomocou AGE spôsobuje aktiváciu MAPK, čo vedie k fosforylácii JNK a p38] Tieto fosforylované proteíny zvyšujú transkripciu rôznych proapoptotických transkripčných faktorov v jadre, čo vedie k zvýšeniu apoptózy. Okrem toho môžu byť aktivované kaspázové dráhy, ktoré spôsobujú apoptózu indukovanú AGEs[39]. Následné štúdie zostávajú nevyhnutné na odhalenie molekulárnych mechanizmov, ktorými sú v CASC indukované následné účinky AGE. Ukázali sme však, že po blokovaní RAGE pomocou FPS-ZM1 boli pozorované účinky AGE na CASC otupené. Naše údaje preto silne naznačujú, že AGE sprostredkúvajú svoje účinky na CASC pravdepodobne prostredníctvom väzby a aktivácie RAGE. Či ide o Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, nadmernú produkciu ROS alebo iné signálne dráhy, je potrebné ďalej identifikovať. Naše údaje sú tiež v súlade s prácou opísanou Zhangom a kol., kde FPS-ZMl tiež zvrátil negatívne účinky AGE v ADSC blokovaním RAGE, čo ďalej potvrdzuje dôležitú úlohu aktivácie RAGE ako sprostredkovateľa škodlivých účinkov spôsobených AGEs[40].

4.4. Budúce perspektívy anti-AGE terapií kardiovaskulárnych chorôb a súčasné obmedzenia

Potvrdenie in vivo o použití anti-AGE terapií a ich potenciálnej pridanej hodnote pre transplantáciu kmeňových buniek po infarkte myokardu je potrebné potvrdiť na zvieracom modeli predtým, ako to bude možné preložiť na kliniku. Vo viacerých štúdiách in vitro sa ukázalo, že inhibítor PPARy rosiglitazón [41,42], inhibítory MAPK [18,35,43] alebo antioxidanty [4] môžu zmierniť účinky na kmeňové bunky sprostredkované AGEs. Avšak ich vplyv in vivo ako terapeutická intervencia v kombinácii s transplantáciou kmeňových buniek nebol doteraz nikdy riešený. Existuje viacero stratégií na zníženie hladín AGE v tele. Pyridoxamín (PM) je inhibítorom tvorby AGEs tým, že znižuje konverziu Amadori-na-AGEs a ​​zachytáva karbonylové zlúčeniny. Účinnosť, ako aj bezpečnosť liečby PM bola preukázaná v klinických štúdiách s diabetickými pacientmi [45]. Avšak klinická štúdia NephroGenex v roku 2014, testujúca Pyridorin[(tj PM) ako antidiabetickú liečbu, bola zastavená z dôvodu finančných problémov [46]. Žiadne iné klinické štúdie v súčasnosti neskúmajú PM ako terapiu. Inhibícia tvorby AGE pomocou PM by však mohla byť stratégiou na zlepšenie potenciálu kmeňových buniek na účely regenerácie srdca. Okrem toho by sa v budúcnosti mohli použiť ďalšie inhibítory tvorby AGE, ako je aminoguanidín, na zníženie hladín AGE po MI. Klinická štúdia ACTION II preukázala účinnosť aminoguanidínu u diabetických pacientov. Zatiaľ čo aminoguanidín nedokázal významne znížiť primárny koncový bod zdvojnásobenia času na dosiahnutie maximálnych hladín kreatinínu v sére u týchto pacientov, preukázali sa ďalšie klinicky dôležité účinky na komplikácie diabetu, ako je zníženie proteinúrie a koncentrácií lipidov v obehu. Avšak kvôli reverzibilným nežiaducim účinkom, ako je indukcia autoprotilátok, symptómy podobné chrípke a anémia, bola táto štúdia ukončená a translácia do kliniky zostáva obmedzená [47,48]. Okrem toho, používanie antioxidantov, ako je N-acetyl-L-cysteín (NAC) alebo glutatión ako doplnok k našej strave, by mohlo poskytnúť niektoré prospešné výsledky pre terapiu kmeňovými bunkami, pretože zvyšujú stabilitu genómu, zlepšujú adhéziu a stimulujú proliferáciu kmeňových buniek. 49]. Bunkovo ​​špecifické účinky sa však medzi typmi kmeňových buniek líšia a na vyhodnotenie ich terapeutickej účinnosti pri použití v kombinácii s transplantáciou kmeňových buniek sú potrebné klinické skúšky závislosti odpovede od dávky. Ďalšou možnosťou je odbúrať AGEs pomocou ALT-71 terapie. ALT-711 je schopný štiepiť väzby uhlík-uhlík medzi karbonylmi, čím prerušuje priečne väzby v molekulách AGEs. Niekoľko klinických štúdií však nedokázalo potvrdiť priaznivé účinky ALT-711 pozorované v štúdiách na zvieratách. Okrem toho, inhibítory RAGE (ako FPS-ZM1) alebo inhibítory downstream molekúl v dráhe RAGE môžu interferovať so signálnou osou buniek AGEs/RAGE, čím blokujú účinky sprostredkované AGEs v kmeňových bunkách. Účinnosť rôznych typov malých molekúl a inhibítorov blokovať AGEs v kmeňových bunkách bola preukázaná vo viacerých in vitro experimentoch [18,35,44], ale nikdy predtým nebola testovaná na zvieracích modeloch. Preto môžeme len predpokladať, že tieto inhibítory sú účinné pri blokovaní AGE v situácii in vivo, ale sú potrebné experimenty s dôkazmi. Napokon ďalšou možnosťou blokovania AGE v kombinácii s terapiou kmeňovými bunkami je samotná genetická modifikácia kmeňových buniek. Je známe, že nadmerná expresia sRAGE zvyšuje vychytávanie AGE (a iných ligandov RAGE, ako je amyloid-), aby sa zlepšila účinnosť bunkovej terapie. Toto bolo preukázané v MSC vylučujúcich sRAGE ako terapiu Alzheimerovej choroby [50,51], artritídy [52] a Parkinsonovej choroby [53]. MSC vylučujúce sRAGE prežili dlhšie, mali zvýšenú migračnú kapacitu, boli lepšie chránené proti apoptóze a mali protizápalové vlastnosti. Tiež downregulácia RAGE, a tým desenzibilizácia kmeňových buniek na AGE, by mohla byť možnosťou na zlepšenie funkčnosti buniek. Zostáva preskúmať, či by tieto stratégie mohli byť použiteľné aj pri nastavení IM a srdcovej opravy. Aby sme to zhrnuli, všetky tieto stratégie sa zameriavajú na boj proti AGE s cieľom zlepšiť funkčnosť a zadržiavanie kmeňových buniek. Tieto terapeutické možnosti však zostávajú hypotetické a je potrebné ich preskúmať in vivo v kombinácii s terapiou CASC predtým, ako sa prenesú do klinického prostredia. 5. Závery

Zistili sme, že AGE mali postupný účinok na vlastnosti CASC závislý od času a koncentrácie, a to zvýšením apoptózy a znížením prežitia, proliferácie a migrácie in vitro. Pracovné mechanizmy za týmito účinkami je potrebné ďalej skúmať, aj keď sme ukázali, že aktivácia RAGE je dôležitým prispievateľom k týmto negatívnym účinkom súvisiacim s AGE. Zostáva ďalej skúmať, či by zacielenie na AGE in vivo mohlo zlepšiť terapeutickú kapacitu CASC po MI.

Tento článok je prevzatý z J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm