Účinky glykozidov Cistanche na synaptickú morfologickú plasticitu u myší s akcelerovaným starnutím
Mar 11, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
LIAN Juanqi1, WANG Lu2, ZHAO Fujun3, LIN Shuai3, YAN Xusheng4, JIA Jianxin4, CAI Zhiping4
(1. ročník 2014 Graduate School of Baotou Medical College, Baotou 014060, Čína)
(2. Trieda 12 ročníka klinickej medicíny 2015 na Baotou Medical College)
(3. trieda 1. ročníka súdneho lekárstva v roku 2013 na Baotou Medical College)
(4. Katedra anatómie človeka Baotou Medical College)
ABSTRAKT
Cieľ: Na preskúmanie účinkuglykozidycistanche (GC) na synaptickú plasticitu hipokampálnych neurónov u myší so sklonom k senescencii 8 (SAMP8).Metódy: 4 0 myši boli náhodne rozdelené do kontrolnej skupiny, skupiny s vehikulom, skupiny s nízkou dávkou (podávané GC 2,5 mg/kg ·d), skupiny so strednou dávkou (podávané GC 5.0 mg/kg < d)="" a="" skupina="" s="" vysokou="" dávkou="" (podávaná="" gc="" 10,0="" mg/kg="" ·="" d).="" myšiam="" v="" kontrolnej="" skupine="" nebola="" poskytnutá="" žiadna="" intervencia;="" tie="" v="" skupinách,="" ktorým="" sa="" podávalo="" a="" skupina="" s="" vehikulom="" podstúpili="" intraperitoneálne="" podávanie="" (gc/fyziologický="" roztok)="" alebo="" fyziologický="" roztok="" počas="" 30="" dní.="" počet="" normálnych="" pyramídových="" neurónov="" v="" hipokampálnej="" oblasti="" ca1="" sa="" spočítal="" farbením="" nissl;="" počet="" dendritických="" tŕňov="" v="" synapsiách="" sa="" spočítal="" golgiho="" farbením="" a="" proteínová="" expresia="" psd{11}}="" sa="" kvantifikovala="">Výsledky: V porovnaní s kontrolnou skupinou GC významne zvýšili počet normálnych pyramidálnych neurónov v hipokampálnej oblasti CA1 (P<0.05) and="" increased="" the="" number="" of="" dendritic="" spines="" in="" synapses="" (p=""><0.05). the="" expression="" levels="" of="" psd-95="" in="" administered="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.05), and="" the="" effect="" in="" the="" middle="" dose="" group="" was="" the="" most="" significant.="">Záver: GC môžu zlepšiť mieru prežitia hipokampálnych pyramídových buniek a zlepšiť synaptickú plasticitu.
KĽÚČOVÉ SLOVÁ: Glykozidy cistanche (GC); Myš so zrýchleným starnutím; Dendritická chrbtica; PSD – 95
S čoraz vážnejším starnutím sociálnej populácie dochádza k prevalencii tzvAlzheimerova choroba(AD) postupne narastal, čo prinieslo veľkú záťaž rodinám pacientov a spoločnosti
[1]. Hlavnými klinickými prejavmi AD sú kognitívne poruchy a poruchy pamäti a hlavnými znakmi prípadu sú senilné plaky tvorené extracelulárnymi amyloidnými depozitmi a intracelulárnymi neurofibrilárnymi spleťami[2]. Patogenéza AD je stále nepresvedčivá. Patologické zmeny synapsií sa považujú za neurobiologický základ AD pamäti a kognitívnej dysfunkcie. Abnormálne zmeny v synapsiách môžu byť hlavným článkom v patogenéze AD. Myš s zrýchleným starnutím (SAM) je inbredný model starnutia myši. Jeho podlínia P8 má rovnomerné a stabilné patologické charakteristiky starnutia, čo sa prejavuje progresívnym poklesom učenia a pamäte a rozpoznávania s pribúdajúcimi mesiacmi. Známa dysfunkcia a patologické prejavy sú podobné ako u pacientov s AD, takže myši SAMP8 sú ideálnym zvieracím modelom na štúdium mechanizmu učenia a zhoršenia pamäti súvisiaceho so starnutím.
Tento článok má v úmysle analyzovať mieru prežitia buniek, merať hustotu dendritickej chrbtice a detegovať postsynaptické kompakty s cieľom preskúmať možný mechanizmus GC.(glykozidycistanche)ovplyvnenie synaptickej morfologickej plasticity hipokampálnych neurónov u rýchlo starnúcich myší s cieľom liečby súvisiacej s ADcistancheglykozidy(GCs) Priestorové učenie a porucha pamäti poskytuje teoretický a experimentálny základ.
1 Materiál a metódy
1.1 Experimentálne zvieratá a zoskupenie 40 samcov 10-mesačných myší SAMP8 (zakúpených na Tianjinskej univerzite tradičnej čínskej medicíny), chovaných v čistom prostredí pri teplote okolia (24.0 ± 1.0) stupeň , vlhkosť (50,0 ± 5,0) percent , jedlo a voda zadarmo. Na začatie experimentu boli zvieratá chované do veku 11 mesiacov. Zvieratá boli náhodne rozdelené do 5 skupín (8 zvierat/skupina): slepá kontrolná skupina (kontrolná) skupina, kontrolná skupina s rozpúšťadlom (vehikulum),cistanche celkové glykozidy(GC) skupina s nízkou dávkou [2,5 mg / (kg ·d)], skupina so strednou dávkou [5. 0 mg / (kg · d)], skupina s vysokou dávkou [10.0 mg / (kg · d)]. Zvieratám v kontrolnej skupine nebola poskytnutá žiadna intervencia. Zvieratá v skupine s nízkou dávkou dostali GC 2,5 mg / (kg · d), zvieratá v skupine so strednou dávkou dostali GC 5.0 mg / (kg · d) a zvieratá v skupine s vysokou dávkou boli podávané GC. 0 mg/(kg ·d), zvieratá v skupine s vehikulom dostali rovnaké množstvo normálneho fyziologického roztoku. Kontinuálna intraperitoneálna injekcia liekov alebo fyziologického roztoku počas 30 dní, 0,5 ml/d.
1.2 Príprava a spracovanie vzoriek Zvieratá sa usmrtili 24 hodín po poslednom podaní, anestetizovali a krk sa usmrtil. Prerežte hrudnú dutinu, aby ste obnažili srdce, prerežte úponok pravej predsiene, aby krv vytiekla, a vložte perfúznu ihlu do ľavej komory. Po infúzii 100 ml normálneho fyziologického roztoku sa pokračovalo v infúzii 4 percent paraformaldehydu, kým končatiny myší neboli stuhnuté. Vezmite mozog a vložte ho do 4 percentného paraformaldehydu na viac ako 24 hodín.
1.3 Lieky a činidlá GC(glykozidycistanche) boli zakúpené od China Academy of Traditional Chinese Medicine, postsynaptická hustota -95, PSD -95 boli zakúpené od Epitomic, Coomassie Brilliant Blue CBBG 250 kit bol zakúpený od Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd. Engineering Institute, DAB imunohistochemický kit bol zakúpený od Biotechnologická spoločnosť Peking Zhongshan Jinqiao.
1.4 Farbenie Nissl a počet buniek 4 % fixácia mozgového tkaniva paraformaldehydom na viac ako 24 hodín, orezanie a dehydratácia gradientovým alkoholom, priehľadný xylén, ponorenie do vosku, zaliatie konvenčným parafínom, sériový rez s hrúbkou 5 μm. Nakrájajte plátky a odvoskujte do vody, farbite 1% toluidínovou modrou pri 37 stupňoch 60 minút, prajte 5 minút × 3x, odlíšte 95% alkoholom, 100% alkoholom Dehydratujte, priehľadný xylén, pripevnite neutrálnou gumou, pozorujte pod mikroskop. Oblasť CA1 tej istej hipokampálnej sekcie každej skupiny sa náhodne vybrala z 3 pozorovacích polí (x100), spočítal sa počet normálnych pyramídových buniek do 1 mm a na analýzu sa zobral priemer.
1.5 Modifikované Golgiho farbenie Opravené mozgové tkanivo vložte do Golgi-Coxovho farbiaceho roztoku, chráňte pred svetlom 14 dní a roztok vymieňajte každé 2 dni; umiestnite mozgové tkanivo do 30 percent sacharózy a umiestnite ho do chladničky pri teplote 4 stupňov. Tkanivo je možné po poklese na dno rozrezať; vibračný mikrotóm na rezanie a farbenie; fixačné riešenie pre vývoj; sušenie montážnej dosky, pozorovanie a počítanie pod mikroskopom. Pozorujte zmeny v dendritickej chrbtici neurónového vrcholu hipokampu CA1 a CA3 každej skupiny myší a vypočítajte hustotu dendritickej chrbtice.
1.6 Imunohistochemické rezy boli zbavené parafínu vo vode, inkubované s 3 percentami H2O2 počas 10 minúty, aby sa eliminovala aktivita endogénnej peroxidázy, premyté destilovanou vodou 5 minút × 3-krát, opravené vysokotlakovou mikrovlnou, premyté PBS počas 5 minút × 3-krát sa kozie sérum blokovalo na 30 minúty pri teplote miestnosti, po kvapkách sa pridala králičia anti-myšia PSD-95 primárna protilátka, cez noc pri 4 stupňoch, premyla sa PBS počas 5 minút× 3-krát sa po kvapkách pridala sekundárna protilátka značená biotínom, inkubovala sa 2 hodiny pri 37 stupňoch, premyla sa PBS 5 minút x 3-krát, nakvapkal sa streptavidín značený chrenovou peroxidázou, premyl sa PBS 5 minút x 3-krát, premyl sa DAB na 2 minúty, kontrastné farbenie hematoxylínom, dehydratované gradientovým alkoholom, transparentné xylénom a namontované. 1.7 Spracovanie obrazu a štatistická analýza. Na pozorovanie boli vybrané rovnaké hipokampálne prierezy každej skupiny. V oblasti CA1 sa náhodne vybrali tri zorné polia (x 100), aby sa spočítal počet normálnych pyramídových buniek do 1 mm, a analyzoval sa priemer. Výsledky imunohistochémie boli merané softvérom na analýzu obrazu IPP 7.0. Experimentálne údaje sa analyzovali softvérom SPSS 17.0 a na porovnanie párových priemerov s viacerými vzorkami sa použila jednosmerná ANOVA. P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Anti-Alzheimerova choroba
2 výsledky
2.1 Účinok celkových glykozidov zcistancheo počte normálnych pyramídových buniek v hipokampe myší SAMP8 Nissl farbenie Výsledky Nissl farbenia ukázali, že počet neurónov v oblasti CA1 kontrolnej skupiny sa znížil, usporiadanie bolo neusporiadané a väčšina buniek mala abnormálnu morfológiu a lýza a nekróza. Morfológia buniek v GC(glykozidycistanche)skupina bola relatívne jasná a úplná, s veľkým počtom viditeľných výčnelkov, telo Nissl bolo fialové, jadierka boli hlboko zafarbené, jasné a centrované a jadrá neboli zafarbené. Morfológia buniek skupiny s vehikulom je podobná ako v kontrolnej skupine. Počet buniek ukázal, že počet normálnych pyramidálnych neurónov v oblasti CA1 skupiny, ktorej sa podávala, sa zvýšil (P<0.05); the="" difference="" between="" the="" medium="" and="" high="" dose="" groups="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), the number of normal pyramidal neurons To a certain extent, it shows an upward trend with increasing dose. There was no significant difference in the number of normal pyramidal cells between the vehicle group and the control group (P>0.05). Pozri tabuľku 1.
Tabuľka 1 Účinok glykozidov cistanche na farbenie hipokampálneho Nis u myši SAMP8, počet normálnych pyramídových buniek a počet dendritických tŕňov (ks)
a sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=0.193, P=0.582; b sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=13.621, P=0.008; c sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=21.798 , P=0.005; d sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=18.326, P=0.006; e sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=0.244, P=0.463; f je v porovnaní s kontrolnou skupinou V porovnaní s t=10.903, P=0.010; g sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=21.817, P=0.005; h sa porovnáva s kontrolnou skupinou t=15.572, P=0. 007.
2.2účinok celkových glykozidov zcistanche na hustote dendritických tŕňov u myší SAMP8 Golgiho farbenie ukázalo, že počet dendritických tŕňov v kontrolnej skupine sa znížil a hustota sa znížila. Po podaní GC zvieratám sa zvýšil počet a hustota dendritických tŕňov a bolo vidieť veľké množstvo výčnelkov (P=0,048). Medzi skupinou so strednou dávkou a skupinou s vysokou dávkou nebol žiadny štatisticky významný rozdiel (P=0 0,853). Počet a hustota dendritickej chrbtice Stupeň vykazuje stúpajúcu tendenciu so zvyšovaním dávky. skupina vozidiel a kontrola
Počet a hustota dendritických tŕňov v skupine nemajú štatistickú významnosť (P=0.764). Pozri tabuľku 1.
2.3 ÚčinokCistancheglykozidy na expresiu PSD-95 u myší SAMP8 Imunohistochemická kvalitatívna detekcia PSD-95 ukázala, že kontrolná skupina mala nižšiu expresiu PSD-95, zafarbenie bunkového tela bolo svetlejšie a miera pozitívnej expresie bola nižšia. Po doplnení GC in vitro sa bunkové telo zafarbilo hlbšie a expresia a pozitívna miera PSD-95 sa zvýšila (t=5.751, P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" middle-dose="" group="" and="" the="" high-dose="" group="" (t="1.077," p="">0.05). Do určitej miery vykazovala expresia PSD-95 stúpajúci trend so zvyšujúcimi sa dávkami. vozidlo
There was no statistically significant difference in PSD-95 expression between the control group and the control group (t = 0.585, P>0.05).
3 Diskusia
PSD-95 je hlavnou zložkou postsynaptických funkcií a súvisí s rôznymi synaptickými funkciami vrátane iónových kanálov, synaptickej aktivity, intracelulárnych dráh prenosu signálu atď. [3]. PSD-95 zhlukuje príbuzné proteíny v signálnej dráhe receptora NMDA za vzniku komplexu receptor-signalizačná molekula-regulačná molekula-cieliaca molekula [4], ktorý hrá kľúčovú úlohu v signálnej transdukčnej dráhe. NMDA receptory sa podieľajú na indukcii dlhodobej potenciácie (LTP) v oblasti CA1 hipokampu a na procese učenia a pamäti [5]. PSD-95 hrá v tomto procese kľúčovú regulačnú úlohu a jeho obsah proteínov možno použiť ako ďalší molekulárny marker na meranie synaptickej plasticity. V našich predchádzajúcich štúdiách sme dokázali, že GC(glykozidycistanche)môže zlepšiť učenie a kognitívne poškodenie u myší SAMP8, ale neobjasnili sme jeho možný morfologický mechanizmus buniek. Tento experiment má za cieľ študovať jeho možný bunkový morfologický mechanizmus.
V tomto experimente zlepšenie miery prežitia pyramídových buniek a synaptickej plasticity v GC(glykozidycistanche)skupina bola lepšia ako skupina s vehikulom a kontrolná skupina. Je možné vidieť, že GC výraznejšie zlepšili morfológiu pyramídových buniek. Experimentálne výsledky ukazujú, že vyššie dávky GC môžu mať lepší účinok. Z porovnania medzi skupinou so strednou dávkou a skupinou s vysokou dávkou je možné vidieť, že účinok sa významne nemení, keď dávka dosiahne určitú koncentráciu. Preto, aby sa predišlo plytvaniu a vedľajším účinkom GC pri používaní GC, mala by sa zvoliť najvhodnejšia koncentrácia [6].
Predchádzajúce štúdie ukázali, že GC(glykozidycistanche)môže zlepšiť učenie a kognitívne poškodenie myší SAMP8 zlepšením miery prežitia pyramídových buniek [7]. Existujú aj údaje, ktoré naznačujú, že GC môžu zlepšiť neurodegeneratívne ochorenia podporou proliferácie a diferenciácie nervových kmeňových buniek [8-10]. Autor sa domnieva, že mechanizmus GC na zlepšenie AD možno dosiahnuť zlepšením plasticity synaptickej morfológie a zachovaním počtu pyramídových buniek, čo je základ pre konečné použitie GC v prevencii a liečbe klinickej AD.
Referencie
[1] Chen Juluo, Chen Xingui, Hu Panpan atď. Pacienti s Alzheimerovou chorobou používajú funkcie Predbežný výskum [J]. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science, 2013, 22 (10): 889-891.
[2] Jin Chunhui, Liu Xiaowei, Yuan Jianmin a kol. Korelácia jednoduchého nukleozidového génu triediaceho receptora 1 medzi kyslým polymorfizmom a sporadickou Alzheimerovou chorobou［J］. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science, 2014, 23 (5): 427-429.
[3] Schliebs R, Arendt T. Význam cholinergného systému v mozgu počas starnutia a pri Alzheimerovej chorobe［J］. Neural Transm, 2006, 113 (11): 1625-1644.
[4] Soriano FX. Špecifické zacielenie signálov NMDA receptorov pred smrťou s rôznou závislosťou od ligandu NR2B PDZ［J］［. J Neurosci, 2008, 28 (42): 10696-10710.
[5] Selkoe DJ. Rozpustné oligoméry beta-proteínu amyloidu zhoršujú synaptickú plasticitu a správanie ［J］］. Behav Brain Res, 2008, 192 (1): 106 -113.
[6] Huang Zonghui, Chen Guanmin, Zhao Kangtao a kol. Štúdia o toxicite Cistanche ［J］. China Journal of Hygiene Inspection, 2014, 24 (8): 1098 -1100.
[7] Jia Jianxin, Song Wei, Yan Xusheng a kol. Celkové glykozidy cistanche majú účinok na myši SAMP8. Vplyv a mechanizmus vzájomného učenia a pamäte［J］. Journal of Baotou Medical College, 2014, 30 (6): 6-8.
[8] Xiao Q, Yan P, Ma X a kol. Posilnenie biogenézy astrocytických lyzozómov uľahčuje klírens A a zmierňuje patogenézu amyloidných plakov［J］［. J Neurosci, 2014, 34 (29): 9607-9620.
[9] Li QJ, Tang YM, Liu J a kol. Liečba Parkinsonovej choroby nervovými kmeňovými bunkami C172 nadmerne exprimujúcimi NURR1 s rekombinovaným adenovírusom s deficitom republiky obsahujúcim gén NURR1［J］. Synapse, 2007, 61 (12): 971-977.
[10] Qin Wei, Wei Wei, Xu Qian a kol. Cistanche na proliferáciu C172 nervových kmeňových buniek Vplyv [J]. Strait Pharmacy, 2015, 27 (12): 263-265.
