Účinky kyseliny perfluóroktánovej na črevnú mikroflóru a mikrobiálne metabolity u myší C57BL/6JⅡ

2. Materiály a metódy

2.1. Zvieratá

Štvortýždňové samce myší C57BL/6J bez špecifického patogénu boli zakúpené od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Myši konzumovali pitnú vodu ad libitum. Zariadenie pre zvieratá na University of Georgia bolo udržiavané pri teplote 22 °C a 40-70 % vlhkosti v rámci cyklu svetlo:tma 12:12 h. Pred experimentom s expozíciou PFOA bolo päť myší umiestnených v jednej klietke a myši náhodne menili klietky raz týždenne počas štyroch týždňov. Expozícia PFOA začala, keď mali myši osem týždňov a obdobie expozície trvalo štyri týždne. Na začiatku experimentu boli myši zaradené do skupiny vystavenej PFOA alebo do kontrolnej skupiny náhodne (n=10 myší v každej skupine), pričom jedna myš bola v jednej klietke. PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bol podávaný myšiam prostredníctvom pitnej vody. Konečná koncentrácia PFOA v pitnej vode bola 1 časť na milión (ppm). Dávka bola zvolená na základe našej predchádzajúcej štúdie [24]. Kontrolné myši konzumovali pitnú vodu bez pridania PFOA. Protokol pre zvieratá bol schválený Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie, University of Georgia (kód protokolu: A2014 10-014-Y2-A1).

KLIKNITE NA domáce lieky na zápchu

2.2. Extrakcia metabolitov

Extrakcia metabolitov sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie [25]. Stručne, 20 ul každej vzorky séra sa extrahovalo 225 ul metanolu. Vzorky boli vortexované počas 10 sekúnd. Potom sa k vyššie uvedeným vzorkám pridalo 750 ul metyl-terc-butyléteru (MTBE) a 188 ul vody, aby sa vyvolala separácia fáz. Vzorky sa pretrepávali pri 4 °C počas 6 minút, nasledovala centrifugácia pri 14,000 x g počas 2 minút. Extrakčné rozpúšťadlo bolo odplynené a vopred ochladené na -20 ◦C. Horná nepolárna fáza (350 ul) sa zozbierala a odparila do úplného sucha pomocou koncentrátora Labconco Centrivap (Labconco, Kansas, MO, USA). V prípade vzoriek pečene a stolice sa k 10 mg každej vzorky pridalo 225 ul metanolu a 750 ul LMTBE. Vzorky sa homogenizovali pomocou aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) pri rýchlosti 1500 otáčok za minútu pri 30 °C piesku, potom sa vortexovali a pretrepávali pri 4 °C počas 6 minút. Potom sa do vzoriek pridalo 188 ul vody a nasledovala centrifugácia pri 14,000x g počas 2 minút. Horná nepolárna fáza (350 ul) sa zozbierala a odparila do úplného sucha. Vysušené vzorky sa potom resuspendovali v 60 ul 4:1 acetonitrilu a vody (objem/objem) s vnútornými štandardmi. Vzorky sa vortexovali, nasledovala sonikácia počas 5 minút a centrifugácia pri 14, 000 x g počas 2 minút. Supernatant sa odobral na analýzu LC-MS.

2.3. Necielené profilovanie metabolizmu

Necielené metabolomické profilovanie sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie [25]. Systém Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) sa použil na separáciu metabolitov pomocou kolóny Acquity UPLC BEH Amide (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), ktorá bola spojená s Acquity VanGuard BEH Amide pre- kolóna (5 mm x 2,1 mm x 1,7 um, Waters, Milford, MA, USA). Voda kvality LC-MS (100%) s 10mM mravčanom amónnym a 0,125% kyselinou mravčou (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , USA) sa použila ako mobilná fáza A. Medzitým sa ako mobilná fáza B použil pomer 95:5 acetonitril: voda (v/v) obsahujúci 10 mM mravčan amónny a 0,125 % kyseliny mravčej. Gradient začínal so 100 % B pri 0– 2 min, 70 % Bat 7,7 min, 40 % B po 9,5 min a 30 % B po 10,25 min, nasledované 100 % B po 12,75 – 16,75 min. Prietok sa udržiaval na 0,4 ml/min. Spektrá sa zbierali v pozitívnom móde elektrosprejovej ionizácie (ESI) s použitím Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Rozsah hmotnosti bol nastavený od m/z 60 do 900 s režimom závislým od údajov pre MS/MS spektrazískanie. Necielené metabolomické nespracované údaje boli prvýkrát prevedené do súborov ABF pomocou konvertora ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (prístup 6. júla 2022)). Na identifikáciu a kvantifikáciu metabolitov sa použila MSDIAL verzia 5.1.0.1 [26]. Na zlepšenie zoznamu funkcií kvality sa použil nástroj na optimalizáciu zoznamu vlastností hmotnostného spektra (MS-FLO) označením funkcií na ďalšie spracovanie údajov [27]. Retenčný čas m/z knižniceNa identifikáciu metabolitov sa použili databázy spektier Fiehn HILIC MS/MS v MassBank v Severnej Amerike.

2.4. Sekvenovanie génu 16S rRNA

Celková DNA sa extrahovala zo vzoriek výkalov pomocou súpravy PowerSoil® DNA isolationkit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA), podľa pokynov výrobcu. Priméry 515F a 806R sa použili na amplifikáciu oblasti V4 16S rRNAgénu. normalizáciou a čiarovým kódovaním. DNA bola sekvenovaná na súprave IlluminaMiSeq v2 s 500 cyklami. Údaje o sekvenovaní génu 16S rRNA sa analyzovali pomocou kvantitatívneho náhľadu do mikrobiálnej ekológie (QIIME) II [28]. Stručne, nespracované údaje o sekvenovaní boli odšumované pomocou DADA2, po čom nasledoval výber operačnej taxonomickej jednotky (OTU). SILVA (verzia 138), vyškolený klasifikátorom založeným na scikit-learn Naïve-Bayes, sa použil ako databáza.

2.5. Štatistická analýza

Veľkosť účinku lineárnej diskriminačnej analýzy (LEfSe) sa použila na určenie bakteriálnych rodov, ktoré najpravdepodobnejšie vysvetlili rozdiely medzi PFOA a kontrolnými skupinami [29]. Na porovnanie metabolitov sa použil Mann-Whitney U test na výpočet p-hodnôt medzi PFOA a kontrolnými skupinami. Miera falošných objavov sa použila na opravu viacnásobných porovnaní. Metabolity s p-hodnotou < 0.05 sa považovali za významné. Čiastočná diskriminačná analýza najmenších štvorcov (PLS-DA) a analýza obohatenia dráhy sa uskutočnili pomocou MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmics sa použil na integratívnu analýzu črevnej mikroflóry a fekálnych metabolitov – ide o integratívny rámec pre viacrozmernú analýzu omických údajov [31].

Prírodný bylinný liek na zmiernenie zápchy-Cistanche

Cistanche je rod parazitických rastlín, ktorý patrí do čeľade Orobanchaceae. Tieto rastliny sú známe svojimi liečivými vlastnosťami a už po stáročia sa používajú v tradičnej čínskej medicíne (TCM). Druhy Cistanche sa vyskytujú prevažne v suchých a púštnych oblastiach Číny, Mongolska a iných častí Strednej Ázie. Rastliny cistanche sú charakteristické svojimi mäsitými, žltkastými stonkami a sú vysoko cenené pre svoje potenciálne zdravotné prínosy. V TCM sa verí, že Cistanche má tonické vlastnosti a bežne sa používa na výživu obličiek, zvýšenie vitality a podporu sexuálnej funkcie. Používa sa tiež na riešenie problémov súvisiacich so starnutím, únavou a celkovou pohodou. Zatiaľ čo Cistanche má dlhú históriu používania v tradičnej medicíne, vedecký výskum jeho účinnosti a bezpečnosti prebieha a je obmedzený. Je však známe, že obsahuje rôzne bioaktívne zlúčeniny, ako sú fenyletanoidové glykozidy, iridoidy, lignany a polysacharidy, ktoré môžu prispievať k jeho liečivým účinkom.

Wecistanche'scistanche prášok, cistanche tablety, cistanche kapsulya ďalšie produkty sa vyvíjajú pomocoupúšťcistancheako suroviny, pričom všetky majú dobrý vplyv na zmiernenie zápchy. Špecifický mechanizmus je nasledovný: Predpokladá sa, že Cistanche má potenciálne výhody na zmiernenie zápchy na základe jeho tradičného použitia a určitých zlúčenín, ktoré obsahuje. Zatiaľ čo vedecký výskum konkrétne o účinku Cistanche na zápchu je obmedzený, predpokladá sa, že má viacero mechanizmov, ktoré môžu prispieť k jeho potenciálu zmierniť zápchu. Laxatívny účinok:Cistanchesa už dlho používa v tradičnej čínskej medicíne ako liek na zápchu. Predpokladá sa, že má mierny laxatívny účinok, ktorý môže pomôcť podporiť pohyby čriev a vyvolať zápchu. Tento účinok možno pripísať rôznym zlúčeninám v Cistanche, ako sú fenyletanoidové glykozidy a polysacharidy. Zvlhčovanie čriev: Na základe tradičného používania sa Cistanche považuje za látku s hydratačnými vlastnosťami, ktorá je špecificky zameraná na črevá. Podpora hydratácie a lubrikácie čriev môže pomôcť zmäkčiť nástroje a uľahčiť priechod, čím sa zmierni zápcha. Protizápalový účinok: Zápcha môže byť niekedy spojená so zápalom v tráviacom trakte. Cistanche obsahuje určité zlúčeniny, vrátane fenyletanoidných glykozidov a lignanov, o ktorých sa predpokladá, že majú protizápalové vlastnosti. Znížením zápalu v črevách môže pomôcť zlepšiť pravidelnosť vyprázdňovania a zmierniť zápchu.