Vylepšenie proteomiky mozgového tkaniva zhora nadol pomocou FAIMS, časť 4

Identifikovali sme aj početné fragmenty odvodené z nekanonických zostrihových izoforiem tauproteínu, o ktorých je známe, že sú exprimované v ľudskom mozgu.83 Stručne, izoformy tau sú definované počtom N-koncových inzertov v dôsledku alternatívneho zostrihu exónu 2 a/alebo 3 (uvedené na 0N, 1N a 2N) a počet opakovaní viažucich mikrotubuly v dôsledku alternatívneho zostrihu exónu 10 (označovaného ako 3R alebo 4R).84

Tau proteín je dôležitý proteín v neurónových bunkách, ktorý hrá veľmi dôležitú úlohu pri udržiavaní normálnej štruktúry a funkcie neurónových buniek. Štúdie ukázali, že tau proteín úzko súvisí s pamäťou a jeho abnormálna expresia môže viesť ku kognitívnemu poklesu a dokonca k kognitívnej poruche.

Vedci vykonali veľa výskumov o vzťahu medzi proteínom tau a pamäťou. Podľa výskumu môže tau proteín pomôcť regulovať stabilitu nervových vlákien, čím podporuje prenos informácií a tvorbu pamäte medzi neurónovými bunkami. Akonáhle je však tau proteín abnormálny, ako je akumulácia proteínu, povedie to k pretrhnutiu nervových vlákien a smrti veľkého počtu neurónových buniek, čo ovplyvní tvorbu a udržiavanie pamäte a dokonca vedie k poškodeniu pamäte. Preto je udržiavanie normálnej expresie a funkcie tau proteínu veľmi dôležité pre udržanie zdravia pamäti.

Nedávne štúdie tiež zistili, že živiny obsiahnuté v niektorých potravinách a nápojoch sú prospešné aj pre udržanie normálnej funkcie tau proteínu. Napríklad antioxidanty, Omega{0}} mastné kyseliny a zelenina a ovocie bohaté na kofeín môžu pomôcť regulovať expresiu a funkciu proteínu tau, ktorý pomáha zlepšovať pamäť a kognitívne funkcie.

Preto by sme mali dbať na udržiavanie dobrých životných návykov, kontrolu stravy, znižovanie stresu atď., aby sme udržali normálnu expresiu a funkciu proteínu tau. Zároveň udržiavanie dobrých študijných návykov a mierne cvičenie môže tiež pomôcť podporiť prenos informácií a tvorbu pamäte medzi neurónovými bunkami. Verím, že pokiaľ budeme dbať na udržiavanie zdravého životného štýlu, môžeme mať zdravú pamäť a lepšie si užívať život. To ukazuje, že musíme zlepšiť našu pamäť. Cistanche môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, z ktorých jedným je zlepšenie pamäte. Účinnosť Cistanche pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Za zmienku tiež stojí, že endogénne fragmenty tau sú bežným nálezom v ľudskom mozgovom tkanive a mozgovomiechovom moku a diferenciálna fragmentácia tau môže hrať úlohu v progresii AD.85,86

Pozorovali sme niekoľko fragmentov, ktoré dokázali jednoznačne rozlíšiť {{0}}}N a 1N tau (obrázky 10A, S7 a S8). Skutočnosť, že pozorujeme vysoké spektrálne počty pre 0N (86 PrSM) a 1N (91 PrSM), ale nepozorujeme žiadne PrSM pre 2N, je v súlade s predchádzajúcim kvantitatívnym imunoblotingom, ktorý zistil, že 0N a 1N sú dominantné formy a vytvárajú ∼ 91 % celkového tau, zatiaľ čo 2N tvoria iba ~9 %.87

Pokiaľ ide o jednoznačné priradenie opakovaní viažucich mikrotubuly, pozorovali sme spektrá, ktoré možno priradiť aj 3R (obrázky 10A a S9) a 4R tau (obrázky 10A a S10).

Opatrná inferencia nám umožnila dospieť k záveru, že braintau je reprezentovaný väčšinou zmesou 1N3R (Tau-B), po ktorej nasledujú spojovacie varianty 0N4R (Tau-D), čo je v súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami.87,88

Zatiaľ čo iné zostrihové izoformy mali tiež jedinečné fragmenty, nízky počet spektrálnych zhôd (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Prekvapivo, N-konce fragmentov obsahujúcich prevládajúcu R-doménu sú pokračovaním C-koncov fragmentov obsahujúcich prevládajúcu N-doménu, alebo inými slovami, zdá sa, že ide o spojené fragmenty produkované možným proteolytickým štiepením (označované ako miesto č. 1 na obrázku 10A). Okrem toho C-konce proteoforiem obsahujúcich doménu 3R a 4R zdieľajú rovnaké miesto štiepenia (označované ako miesto #2 na obrázku 10A), aj keď samotné sekvencie sú odlišné v dôsledku zostrihových variácií exónu 10.

Ešte prekvapivejšie je, že všetky tieto miesta štiepenia ležia v rámci troch dobre opísaných hexapeptidových motívov.89–95 Obrázok 10B ukazuje všetky jedinečné fragmenty, ktoré sme identifikovali z našich súborov údajov a ktoré by bolo možné mapovať na izoformu tau 1N3R, ako aj umiestnenie štiepenia. stránky.

Štiepne miesto č. 1 leží v druhej oblasti bohatej na prolín tau, ktorá rozdeľuje hexapeptidovú sekvenciu KVAVVR a poskytuje jedno z najsilnejších väzbových miest pre mikrotubuly (obrázok 10B).89–91 Štiepne miesto č. 2 leží v hexapeptidových motívoch 3R a 4R VQIVYK a VQIINK, u ktorých sa preukázalo, že riadia agregáciu tau (obrázok 10B).92–95

Je zaujímavé, že mnohé z fragmentov, ako je znázornené na obrázku 10B, začínajú alebo končia v blízkosti týchto dvoch miest štiepenia. Je známe, že každý z týchto hexapeptidových motívov tvorí štruktúru, často vo forme vlásenky, ktorá je základom agregácie podieľajúcej sa na rôznych neurodegeneratívnych ochoreniach.89,93,96 Je zaujímavé, že tieto pozorovania zdôrazňujú možnosť zdieľanej dráhy proteolytickej degradácie medzi izoformami tau, schopné narušiť ich agregačné oblasti.25,85,86

Nakoniec sme našli množstvo spektrálnych zhôd pre A, ktoré bolo možné pozorovať výlučne pomocou FAIMS.

Tieto proteoformy A, ktoré zvyčajne vyžadujú špeciálne techniky frakcionácie alebo manipulácie na zlepšenie regenerácie v dôsledku ich hydrofóbnych vlastností a vlastností náchylných na agregáciu,9, 16, 97, 98, boli pozorované neporušené pomocou FAIMS v rozsahu -40 až -50 CV.

Patria sem kanonické A 1–42 a A 1–40 (obrázok 11A, B), ako aj niekoľko N-koncovo skrátených foriem (konkrétne A 2–42 a A 4–42, obrázok 11C, D).

Stojí za zmienku, že proteoformy A s rôznymi N- a C-koncovými štiepeniami je notoricky ťažké identifikovať v analýzach zdola nahor kvôli extrémnej hydrofóbnosti tryptických produktov, čo zdôrazňuje výhodu analýzy intaktných proteínov.

Veríme, že metodika FAIMS-TDP ponúka robustný spôsob na dosiahnutie neporušenej identifikácie týchto proteoforiem A, čo umožňuje ľahké určenie rôznych kombinácií N a C-koncových produktov štiepenia, ktoré existujú.

ZÁVERY

Opísali sme, ako nano-LC reverzná fázová separácia vysoko komplexnej vzorky obsahujúcej proteíny v širokom hmotnostnom rozsahu môže ťažiť z implementácie frakcionácie v plynnej fáze prostredníctvom FAIMS v kontexte hmotnostnej spektrometrie zhora nadol.

Ukázalo sa, že FAIMS ovplyvňuje prenos proteoforiem veľkosťou a / alebo nábojom, čím sa znižuje zložitosť MS1 a umožňuje sa väčšia hĺbka pokrytia proteómu.

FAIMS pri jednom CV (-50) umožnilo identifikovať v priemere 1833 ± 17 jedinečných proteoforiem, čo je viac ako dvojnásobok v porovnaní s bez FAIMS (754 ± 35). Pridanie FAIMS neviedlo k zhoršeniu reprodukovateľnosti kvantifikácie a zostalo blízko 20 % RSD, čo je porovnateľné s prístupom zdola nahor bez označenia.

Zaznamenalo sa klesajúce CV FAIMS, aby sa zvýšila molekulová hmotnosť iónových druhov prenášaných do prístroja (medián MW=5 kDa pri -50 CV oproti -15 kDa pri -20 CV) a tiež sa pozorovalo, že modulácia CV ovplyvňuje prenos obálka stavu náboja proteoformy rozdielne.

Definovali sme tiež optimálne kombinácie CV, ktoré by mohli produkovať najväčšie teoretické maximum pokrytia proteoforiem / génov alebo proteómových sekvencií. V porovnaní s tromi súbormi údajov „No FAIMS“ by externé krokovanie CV pri -50, -40 a -30 V mohlo viac ako zdvojnásobiť počet jedinečných proteoforiem, jedinečných génov a pokrytia sekvencií proteómov.

Je tiež potrebné zdôrazniť, že naša práca skúmala iba relatívne malý rozsah CV, ktorý sme považovali za najvhodnejší pre náš prístup TDP s použitím komplexnej vzorky. Keďže FAIMS možno ľahko prispôsobiť iným metódam, analýzy MS1 s nízkym rozlíšením s analyzátormi Orbitrap môžu byť schopné zlepšiť identifikáciu väčších proteoforiem v rozsahu CV, ktorý sme testovali, ako aj nad -20 V, kde by sa pravdepodobne pozorovali väčšie proteoformy.

Možno si tiež predstaviť, že budúce prístrojové vybavenie hmotnostného analyzátora, ktoré zlepšuje získavanie väčších proteoforiem a je kompatibilné s FAIMS, môže ťažiť zo skúmania CV pod -20, ktoré sa rozšíria do rozsahu kladného napätia.

Náš pracovný postup TDP nám umožnil identifikovať a charakterizovať jedinečné proteoformy odvodené od génov so známymi úlohami pri neurodegeneratívnych ochoreniach.

To zahŕňalo určenie zloženia neznámeho hmotnostného posunu prítomného v blízkosti domény -synukleínu viažucej železo, ktorá sa použila na určenie polohy potenciálnych domén viažucich železo v - a tiež synukleíne. Zistilo sa tiež, že PARK7 je modifikovaný sukcinylovou skupinou na svojom aktívnom mieste Cys zvyšku.

Boli sme schopní jednoznačne rozlíšiť tau fragmenty zodpovedajúce 0N, 1N, 3R a 4R zostrihovým variantným izoformám jednotlivo a opísať nové proteolytické štiepne miesta umiestnené v alebo blízko niekoľkých hexapeptidových opakovaní s naočkovaním agregácie.

Nakoniec FAIMS umožnil identifikáciu niekoľkých neporušených proteoforiem A, vrátane A 1–42 náchylných na agregáciu, bez potreby zložitých frakcionačných alebo purifikačných techník.

Stručne povedané, veríme, že pridanie FAIMS na objavenie TDP poskytne robustnú a reprodukovateľnú metódu na zvýšenie dostupného proteómu na detekciu a charakterizáciu.

Doplnkový materiál

Doplnkový materiál nájdete vo webovej verzii na PubMed Central.

POĎAKOVANIE

Autori by sa chceli poďakovať Tao Liu a Richardovi Smithovi za ich rady a užitočné diskusie.

Táto práca bola podporovaná U01 AG061356 (PLDJ) a R01 AG015819 (DAB). Časť výskumu bola vykonaná pomocou EMSL (grid.436923.9), používateľského zariadenia DOE Office of Science, sponzorovaného programom Biological and Environmental Research. Grafické abstraktné a obrazové aktíva na obrázku 1 boli vytvorené pomocou Bionder.com.

LITERATÚRA

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd-Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Tesár DO; Carvalho F; Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE;Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Seno SI; Irvani SSN; Jha RP; Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T;Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S; Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR; Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Rybník CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A; Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahraian MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; venketasubramanské N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Globálna, regionálna a národná záťaž Alzheimerovou chorobou a inými demenciami, 1990–2016: systematická analýza pre štúdiu Global Burden of Disease 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Masters CL Amyloid prekurzorový proteín (APP) a beta A4 amyloid v etiológii Alzheimerovej choroby: vzťahy medzi prekurzorom a produktom pri poruche funkcie neurónov. Mozgový patol. 1991, 1, 241-251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimerova choroba: hypotéza amyloidnej kaskády. Science 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Goedert M. Tau proteín a neurofibrilárna patológia Alzheimerovej choroby. Trendy Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau a neurodegeneratívne ochorenie: doterajší príbeh. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Tri dimenzie amyloidnej hypotézy: čas, priestor a „krídelníci“. Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Propagácia Takeda S. Tau ako diagnostický a terapeutický cieľ pre demenciu: Potenciály a nezodpovedané otázky. Predné. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Proteomika zhora nadol v zdraví a chorobe: výzvy a príležitosti. Proteomika 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrová AE; Kononikhin AS; Indeykina, Autori nedeklarujú žiadny konkurenčný finančný záujem. MI; Popov IA; Nikolaev EN Hmotnostná spektrometrická analýza diverzity peptidov Abeta: ťažkosti a budúce perspektívy objavovania biomarkerov AD. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Hmotnostná spektrometria je mnohostranná zbraň, ktorá sa má použiť v boji proti Alzheimerovej chorobe: Amyloidné beta peptidy a ďalšie. hmotnostné spektrum. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andrej VP; Petyuk VA; Brewer HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Tábor D; Smith RD; Lieberman AP; Albin RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Kvantitatívna LC-MSproteomika Alzheimerovej choroby a normálneho veku ľudských mozgov bez označenia. J. Proteome Res. 2012, 11,3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Radenie M; Wang PG; brada LS; Li L. Integrovaná proteomika a sieťová analýza identifikujú proteínové uzly a sieťové zmeny pri Alzheimerovej chorobe. ActaNeuropathol. komun. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com