Epigallokatechín-3-Gallát podporuje dozrievanie in vitro a vývoj embryí po IVF prasacích oocytov, časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Účel:Epigalokatechín-3-galát (EGCG) je hlavnou zložkou katechínových polyfenolov a má ochranné účinky vďaka svojim silným antioxidačným vlastnostiam. Pokiaľ vieme, stále je nedostatok systematického výskumu účinkov EGCG na in vitro maturáciu (IVM) a in vitro fertilizáciu (IVF) prasacích oocytov. Cieľom tejto štúdie bolo určiť účinky EGCG na IVM a IVF oocytov ošípaných.

Metódy:Bravčové oocyty boli ošetrené rôznymi koncentráciami EGCG (5, 10 a 20 uM) a expanzia buniek kumulu, rýchlosť dozrievania oocytov, reaktívne formy kyslíka (ROS), hladiny glutatiónu (GSH) a malondialdehydu (MDA), celková antioxidačná kapacita boli určený. Hladiny expresie mRNA génov spojených s oxidačným stresom a apoptózou boli stanovené kvantitatívnou PCR v reálnom čase. Hodnotila sa aj rýchlosť štiepenia a rýchlosť blastocyst oocytov po liečbe 10 uM EGCG počas IVM a IVF. Výsledky: EGCG v 5, 10 a 20 uM významne podporovalo expanziu buniek kumulu a EGCG v 10 uM zvýšilo rýchlosť dozrievania oocytov. Liečba EGCG (10 μM) znížila hladiny ROS a MDA a zároveň zvýšila antioxidačnú kapacitu a koncentrácie GSH v zrelých oocytoch. Výsledky qRT-PCR ukázali, že liečba EGCG up-regulovala expresiu mRNA katalázy, glutatiónperoxidázy a superoxiddismutázy v zrelých oocytoch. Okrem toho liečba EGCG tiež znížila hladiny expresie mRNA Bax a kaspázy-3 a zvýšila úroveň expresie mRNA Bcl{15}} v zrelých oocytoch. Okrem toho rýchlosť štiepenia a rýchlosť blastocyst oocytov ošetrených 10 uM EGCG počas IVM a IVF boli významne vyššie ako v kontrolnej skupine.

Záver:Naše výsledky naznačujú, že EGCG podporuje in vitro dozrievanie a vývoj embryí po IVF oocytov ošípaných. Ochranné účinky EGCG na oocyty môžu byť spojené s jeho antioxidačnými a antiapoptóznymi vlastnosťami. Kľúčové slová: EGCG, prasacie oocyty, IVM, antioxidant, antiapoptóza, IVF

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Úvod

Dozrievanie oocytov in vitro (IVM) je kľúčovým krokom v produkcii embryí in vitro pre hospodárske zvieratá..2 Oocyty z IVM majú kapacitu na oplodnenie a vývoj na embryá, zatiaľ čo úspešnosť vývoja embryí z oocytov IVM je nižšia než z in vivo zrelých oocytov. Zrenie oocytov vyžaduje cytoplazmatické aj jadrové dozrievanie a nesprávne cytoplazmatické dozrievanie prispieva k slabému vývojovému potenciálu IVM oocytov. Na základe predchádzajúcich štúdií je správne zloženie média a kultivačné podmienky nevyhnutné pre úspešný oocyt IVM4 Epigalokatechín-3-galát (EGCG) je jednou z hlavných bioaktívnych zlúčenín v zelenom čaji a patrí medzi katechínové polyfenoly. EGCG je dobre známy svojou úlohou pri chelátovaní prechodných kovov a tým znižovaní úrovne oxidačného stresu.5 Experimentálne štúdie in vitro a in vivo ukázali, že EGCG má rôzne biologické funkcie vrátane prevencie chromozomálneho poškodenia reaktívnymi formami kyslíka (ROS), antibakteriálnych aktivít, Huang et al ukázali, že EGCG v IVM médiu môže znížiť hladinu ROS a apoptózu v oocytoch hovädzieho dobytka a zvýšiť expanziu buniek kumulu. stupňa Roth et al ukázali, že intraperitoneálna injekcia antioxidantu EGCG zlepšuje vývojovú kompetenciu a kvalitu embryí, ktoré sa vyvíjajú z oocytov ošetrených hypertermiou u myší. Gadani a kol. ukázali, že suplementácia EGCG do rozmrazených kančích spermií zlepšila oplodnenie in vitro (IVF).8 Nedávna štúdia Bucciho a kol. však preukázala, že suplementácia EGCG do rozmrazovacieho média nezlepšila kvalitu psích spermií alebo kapacitu viazania zón. 10 Pokiaľ vieme, stále je nedostatok systematického výskumu účinkov EGCG na IVM a IVF oocytov ošípaných. Zostáva preskúmať, či možno EGCG použiť ako účinný antioxidant pre prasacie oocyty kultivované in vitro. Systematicky sa skúmali účinky EGCG na IVM a IVF oocytov ošípaných. Okrem toho sa pomocou in vitro testov stanovila hladina ROS, antioxidačná kapacita, hladiny expresie mRNA génu spojeného s antioxidantom a apoptózou v oocytoch.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Materiály a metódy Etické vyhlásenie

Túto prácu schválila Etická komisia pre experimentovanie na zvieratách Juhočínskej poľnohospodárskej univerzity.

Liečba EGCG

EGCG zlúčenina bola zakúpená od Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) a bola pripravená ako 1 mM zásobná koncentrácia s použitím M-199 média (Sigma-Aldrich). Na určenie účinku EGCG na index expanzie kumulu a rýchlosť dozrievania oocytov in vitro a produkciu ROS oocytov sa použili rôzne koncentrácie EGCG (0,5,10 a 2{{ 16}} uM) bolo doplnených v IVM médiu (M-199 médium doplnené 10 percentom fetálneho hovädzieho séra, 10 percent prasacej folikulárnej tekutiny, 0,57 mM cysteínu, 10 ng/ml epidermálneho rastového faktora, 10 IU/ml sérového gonadotropínu gravidných kobýl a 10 IU/ml ľudského chorionického gonadotropínu). Na stanovenie účinkov EGCG na celkovú antioxidačnú kapacitu, obsah glutatiónu (GSH), hladinu malondialdehydu (MDA) a hladiny expresie mRNA sa do IVM média pridalo EGCG (0 a 10 uM). Na stanovenie účinkov EGCG na vývojový potenciál oocytov sa EGCG (0 a 10 μM) doplnilo počas IVM a/alebo IVF alebo počas IVM a/alebo IVC.

Odber oocytov a dozrievanie in vitro

Vaječníky boli získané z mladých ošípaných zabitých na miestnom bitúnku (Guangzhou Kongwangji Slaughterhouse, Guangzhou, Čína) a prenesené do laboratória v 0,9-percentnom fyziologickom roztoku pri teplote 37 stupňov do 2 hodín. Folikulárna tekutina z 3-8 mm antrálnych folikulov sa odsala injekčnou striekačkou s pripojenou 18- ihlou. Ako už bolo opísané, približne 50 komplexov kumulus-oocyt (COC) sa kultivovalo v 500 ul (IVM) média, pokrylo sa minerálnym olejom a kultivovalo sa 44 hodín pri 38, 5 ° C v inkubátore s 5 percentami CO2 so zvlhčeným vzduchom.

Hodnotenie expanzie cumulus a IVM oocytov

Expanzia kumulu bola zaznamenaná po 44 hodinách IVM. Hodnotenie bolo zaslepené, aby sa eliminovala zaujatosť. Stupeň expanzie kumulu pre každú COC bol hodnotený podľa subjektívneho bodovacieho systému na stupnici 0-4, kde 0 označuje žiadnu expanziu, 1 označuje minimálnu pozorovateľnú expanziu, 2 označuje expanziu vonkajšej vrstvy buniek cumulus, 3 označuje rozšírenie všetkých vrstiev buniek cumulus okrem corona radiata a 4 označuje úplné rozšírenie všetkých vrstiev buniek cumulus.12 Priemerné skóre (0.0-4.{{10} }) pre každú skupinu, v každom replikáte (4-6 replikátov), ​​sa potom vypočítal, aby sa získala hodnota označovaná ako index expanzie kumulu. Extrúzia prvého polárneho telieska v oocytoch bola stanovená pod svetelným mikroskopom. Oocyty boli klasifikované nasledovne: nezrelé (nedosiahli metafázu), zrelé (prezentovaná metafáza I platničky a polárne telo) a abnormálne (akékoľvek chromozomálne aberácie, ako je diploidná, abnormálna metafáza I, viacsmerné vreteno a chromozomálna disperzia). Rýchlosť dozrievania oocytov sa vypočítala nasledovne: počet zrelých oocytov/celkový počet vyšetrených oocytov x 100 percent.

Stanovenie hladín ROS

Na stanovenie intracelulárneho obsahu ROS sa 30 zrelých oocytov inkubovalo 20 minút pri 38,5 stupňoch vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) s obsahom 10 μM 2',7'-dichlórfluoresceín diacetátovej fluorescenčnej sondy (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína) . Oocyty sa potom premyli PBS doplneným 1 percentom hovädzieho sérového albumínu. Obrázky boli zachytené systémom konfokálnej mikroskopie (IX71, Olympus, Japonsko) s rovnakými nastaveniami skenovania medzi skupinami. Intenzita fluorescencie sa vypočítala pomocou Image. J softvér.

Test celkovej antioxidačnej kapacity

Celková antioxidačná kapacita v oocytoch sa analyzovala pomocou súpravy Total Antioxidant Capacity Assay Kit metódou ABTS (Beyotime, Peking, Čína) podľa protokolu výrobcu. Test ABTS meria celkovú antioxidačnú kapacitu vzorky a je založený na radikálovom zafarbení ABTS· plus. Katiónový radikál ABTS· plus je chromofor, ktorý absorbuje pri vlnovej dĺžke 734 nm a vzniká oxidačnou reakciou ABTS (2,2-azino-bis-(3-etylbenztiazolín{{7 }}sulfonát amónny) s persíranom draselným.13

Kvantifikácia obsahu GSH

Obsah GSH sa meral pomocou súpravy Total Glutathion Assay Kit (S0053, Beyotime, Bejing, Čína) podľa pokynov výrobcu. Táto súprava využíva kinetickú enzymatickú recykláciu založenú na oxidácii GSH 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoovou kyselinou), [DTNB] na meranie celkového obsahu glutatiónu (tGSH) v biologických vzorkách. Do jamiek mikrotitračnej platne sa pridajú glutatiónové štandardy alebo upravené vzorky, po ktorých nasleduje DTNB a glutatiónreduktáza. Pridanie NADPH2 do jamiek iniciuje progresívnu redukciu DTNB pomocou GSH, čo spôsobí zvýšenie farby, ktoré sa monitoruje pri 405 nm. Stručne, vzorky sa naočkovali do 96-jamkových doštičiek a potom sa do každej jamky pridalo 150 μl detekčného roztoku. Po ekvilibrácii vzoriek pri izbovej teplote počas 5 minút sa pridalo 50 μ roztoku -0,16 mg/ml NADPH. Obsah GSH sa určil vydelením nameranej hodnoty 5-tio{{15 }}nitrobenzoovej kyseliny počtom oocytov v každej vzorke.

Kvantifikácia hladiny malondialdehydu (MDA).

Hladina MDA v oocytoch sa analyzovala pomocou testovacej súpravy MDA (Beyotime) podľa protokolu výrobcu. MDA reaguje s kyselinou tiobarbiturovou (TBA) za vzniku červenej zlúčeniny, ktorá má maximálnu absorbanciu 532 nm. Činidlo TBA sa pripravilo zmiešaním 0,2 ml SDS (8,1 percenta), 1,5 ml kyseliny octovej (20 percent, pH =3,5) a 1,5 ml TBA (0,8 percenta) spolu, potom sa 100 ul každej homogenizovanej vzorky oocytov zmiešalo s týmto 200 ul TBA činidla. Zmes sa inkubovala vo vriacom vodnom kúpeli počas 15 minút a potom sa ochladila na ľade. Po ochladení sa zmes centrifugovala pri 4000 ot./min. počas 10 minút. Absorbancia supernatantu bola stanovená pri 532 nm oproti slepému pokusu.

Oplodnenie in vitro a kultivácia embryí Experiment IVF sa uskutočnil tak, ako bolo uvedené vyššie.14 Stručne, oocyty odobraté z miestneho bitúnku sa kultivovali 44 hodín a mechanicky pipetovali v 1 mg/ml hyaluronidáze v DPBS; potom sa 10-15 oocyty zoskupili a preniesli do 50 μl TBM oplodňovacieho média (113,1 mm NaCl,3.0mM KCl, 7,5 mM CaCl22H20,20 .0 mM Tris, 11.0 mM glukóza, 5,0 mM pyruvát sodný) s obsahom 2,5 mM kofeínu a 2 mg/ml BSA (frakcia V) pokrytá minerálnym olejom. Čerstvé spermie (od ošípanej Duroc vo veku ~ 12 mesiacov s históriou viacnásobného chovu) poskytnuté spoločnosťou Guangxi Yangxiang Company Co. Ltd (Guangxi, Čína) sa trikrát premylo centrifugáciou s DPBS doplneným 0,1 percenta BSA pri 1500 ot./min. 4 min. Pelety spermií boli resuspendované a zriedené na 1 x 10 stupňov spermií/ml s TBM na kapacitáciu v CO2 inkubátore počas 30 minút. Potom boli kapacitované spermie pridané do oocytov obsahujúcich kvapky s konečnou koncentráciou spermií 1 x 102 spermií/ml a spoločne inkubované počas 6 hodín pri 39 stupňoch v atmosfére 5 percent CO2 vo vzduchu. Po oplodnení sa oocyty 3-krát premyli médiom PZM3 a kultivovali sa s médiom PZM3 pri 39 °C, 5 percent O2, 5 percent C02 a 90 percent N2; a 100 percent vlhkosti. Embryonálne štiepenie a tvorba blastocyst sa hodnotili 48 hodín a 6 dní po inseminácii. Vzorce na hodnotenie rýchlosti štiepenia a blastocyst boli nasledujúce: rýchlosť štiepenia=počet štiepení/počet zrelých oocytov; počet blastocyst=počet blastocyst/počet zrelých oocytov.

Kvantitatívna PCR v reálnom čase (qRT-PCR) Celková RNA sa extrahovala z zrelých oocytov pomocou činidla Trizol (Invitrogen, USA) a kvantifikovala sa meraním absorbancie pri 260 nm. RNA bola reverzne transkribovaná do cDNA pomocou súpravy HiScript III-RT SuperMix (Vazyme, Nanjing, Čína). PCR v reálnom čase sa uskutočnila na tepelnom cykléri qTOWER³(Analytik Jena Germany) s použitím súpravy ChamQrM Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme). Hladiny expresie mRNA detegovaných génov sa normalizovali pomocou GAPDH a vypočítali sa použitím metódy 2-△c. Sekvencie primérov boli uvedené v doplnkovej tabuľke S1.

Štatistická analýza

Všetky analýzy údajov sa uskutočnili pomocou štatistického softvéru R (verzia 3.6.3). Všetky údaje boli prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka. Významné rozdiely medzi rôznymi liečebnými skupinami boli hodnotené pomocou permutačných testov. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tento článok je prevzatý z Tento článok bol publikovaný v nasledujúcom časopise Dove Press: Drug Design, Development and Therapy